甲基营养菌Methylobacterium extorquens AM1中最适荧光蛋白报告基因的鉴定
转基因植物的检测鉴定方法、遗传转化技术及新技术
PCR检测
• PCR是在体外快速特异地扩增目的基因DNA片段 的有效方法。能在几小时内使pg水平的起始物达 到ng水平,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭 染色后很容易观察,不通过杂交分析就可以鉴定出 基因组中的一些顺序。
• 但由于PCR扩增十分灵敏，有时会出现假阳性扩 增，因而对外源基因是否整合需要进行扩增产物 的Southern杂交。
＊已获得专利许可
42
Site-specific recombinasemediated transgene excision
loxP
Cre
Transgene
loxP
loxP
Cre
Transgene
llooxP
loxP
43
外源基因去除（Gene-deletor)
• “外源基因去除”技术的要点之一是在目标植 物中加入了受DNA调空片段启动子控制的特殊基 因，该基因在启动子的作用下，可根据科学家的 意愿，在需要的时间和部位将外源基因和自身从 转基因植物中切掉，从而使转基因作物的花粉、 种子、果实不再含有外来基因，或将外来基因从 人们所需食用的部分（如植物的茎、叶、块茎） 彻底清除掉，达到用转基因作物生产出非转基因 食品的目的，从根本上解决了长期困扰人们的转 基因植物基因扩散问题和转基因食品的安全性问 题。
ATP
dsRNA
siRNA
蛋白复合物
RISC
靶 正义链
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mRNA
3、无选择标记转化
• 可消除选择标记基因对转基因作物安全性 方面的影响
• 可消除选择标记基因对重复多基因转化叠 加所带来的困难
41
marker-free转基因植株
• 共转化法＊(基因枪与农杆菌转化) • 转座元法 • 重组酶法＊ • MAT(Multi-auto transformation)法＊ • 替代法＊
某大学生物工程学院《普通生物化学》考试试卷(6601)
某大学生物工程学院《普通生物化学》课程试卷（含答案）__________学年第___学期考试类型：（闭卷）考试考试时间：90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、判断题（140分，每题5分）1. 解偶联剂可抑制呼吸链的电子传递。
（）答案：错误解析：2. 在脂双层分子中，因为脂分子的亲水头部朝向两个表面，因此脂分子是对称性分布的。
（）答案：错误解析：膜脂的不对称性分布是指同一种膜脂分子在膜的脂双层中呈不均匀分布。
如人红细胞膜外层含磷脂酰胆碱和鞘磷脂较多，内层则含磷脂酰丝氨酸和磷脂酰乙醇胺较多。
3. 辅基与辅酶的区别只在于它们与蛋白质结合的牢固程度不同，并无严格的界限。
（）答案：正确解析：4. 真核生物成熟的mRNA的两端都带有游离的3′OH。
（）[华东师范大学2008研]答案：错误解析：成熟的真核mRNA的3′OH在3′末端，5′端没有。
5. 必需氨基酸是指人体不能合成的氨基酸。
（）答案：正确解析：6. DNA的Tm值随（A＋T）（G＋C）比值的增加而减少。
（）答案：正确解析：DNA分子中GC含量越高，DNA越稳定，Tm值就越高。
7. 生物体内脱氧核苷酸的合成一般通过氧化反应实现。
（）答案：错误解析：8. 在肌肉细胞中磷酸戊糖途径比在脂肪细胞中更活跃。
（）答案：错误解析：磷酸戊糖途径能为脂肪酸合成提供大量的还原当量NADPH，因而在脂肪细胞中该途径远比在肌肉细胞中更为活跃。
9. 内含子的自我剪接说明某些RNA也具有酶活性。
（）[中山大学研]答案：正确解析：10. 提高盐浓度可使DNA分子的熔点Tm升高。
（）[厦门大学2014研]答案：正确解析：11. DNA变性是指互补碱基之间的氢键断裂。
（）[中山大学2018研]答案：正确解析：12. 脂肪的皂化价高表示含低相对分子质量的脂肪酸少。
（）[山东大学2017研]答案：错误解析：皂化值是指皂化1g脂肪所需的KOH的毫克数。
绿色荧光蛋白基因克隆及表达 结题报告
H2O 10XPCR Buffer EGFP-F EGFP-R dNTP rTap 菌 总体积
15μl 2.5μl 2μl 2μl 2μl 0.5μl 1μl 25μl
11.阳性菌株培养
等转板的菌长出以后,挑取2~3个阳性克隆 摇菌,37℃过夜。
12.重组质粒提取
(1)取已经培养好的含有pEGFP和pET-28a重组质粒1.5mL置于Eppendorf管中 ，以10000r/min离心1min，去掉上清；重复一次。然后将小管倒扣在吸水纸上 ，并用移液枪吸出多余的菌液，尽量除尽。加入150μL的GET缓冲液，充分混 匀，室温下放置10min。使用EDTA是为了除去细胞壁上的Ca2+，使溶菌酶更易 与细胞壁接触。
重复步骤上述步骤。将吸附柱Ca2放回收集管中，12000r/min离心 2min，室温放置数分钟，彻底除去漂洗液PW。将吸附柱Ca2，置于 室温10分钟，向吸附膜的中间位置悬空滴加适量洗脱缓冲液EB，室温 放置2min，12000r/min离心2min，收集DNA溶液。
6.连接反应
（1）将酶切后的片段用T4-DNA连接酶相 连 （2）16℃连接过夜。
试剂
溶液1－G.E.T缓冲液（pH8.0），溶液2－ 0.2mol/L NaOH, 1%SDS，溶液3－乙酸钾溶液 (3M, pH=4.8)，灭菌蒸馏水，pH7.5~8.0醋酸铵 （NH4Ac）7.5mol/L，异丙醇，70％乙醇，无水 乙醇，0.5 × TBE缓冲液，平衡液BL，溶胶液 PN，漂洗液PW，洗脱缓冲液EB，0.1 mol/L CaCl2溶液，卡那霉素100mg/ml，IPTG，2KB DNA Maker，6XLoading Buffer，酶反应终止 液(10 x Loading Buffer)，0.25%溴酚蓝， 10xPCR缓冲液，琼脂糖，NaAc，TE缓冲液， 酚氯仿，T4DNAligase及其缓冲液(10 x ligase Buffer)
芽孢杆菌营养缺陷型的筛选检出与鉴定
实验二、芽孢杆菌氨基酸营养缺陷型菌株的筛选、检出与鉴定一、实验目的掌握各种培养基的配制方法；理解选育营养缺陷突变株的选育原理；掌握细菌氨基酸营养缺陷型的诱变、筛选与鉴定方法；获得芽孢杆菌氨基酸营养缺陷型菌株并对其鉴定。
二、实验原理营养缺陷型是指野生型菌株由于基因突变，致使细胞合成途径出现某些缺陷，丧失合成某些物质的能力，必须在基本培养基中外源补加该营养物质,才能正常生长的一类突变菌株。
其本质是一种减低或消除末端产物浓度，以解除反馈控制的代谢调控中间产物或分支合成途径中末端产物得以积累。
营养缺陷型菌株广泛应用于氨基酸、核苷酸、维生素的生产中。
也广泛应用于基因定位、杂交及基因重组等研究中的遗传标记制作。
筛选营养缺陷型菌株一般具有四个环节：诱变处理、淘汰野生型、营养缺陷型的检出、鉴定缺陷型[1]。
1.诱变处理基因突变可分为自发突变和诱发突变，许多物理、化学、生物因素对微生物都有诱变作用，这些能使突变率提高到自发突变水平以上的因素称为诱变剂，对于氨基酸营养缺陷型的诱变常选用亚硝基胍。
亚硝基胍(NTG，N-甲基-N-硝基-亚硝基胍)为诱变剂，在低致死率的情况下又很强的诱变作用，有超诱变剂之称。
在碱性时NTG 能形成重氮甲烷(CH2N)、烷化DNA 而使基因突变：pH5-5.5 时，NTG 形成HNO2，本身也是诱变剂；pH 6.0 时，NTG 本身不变化，可作用于核蛋白而引起诱变效应。
它的主要作用是引起DNA链中GA向AT转变。
NTG 是—种超诱变剂，杀菌力较弱，诱变作用较强，其作用部位又往往在 DNA的复制叉处，易造成双突变。
一般选用NTG 处理时，诱变频率较高，可使百分之几十的细菌发生营养缺陷型突变。
NTG也是一种致癌因子，在操作时要特别注意，切勿直接与皮肤接触，凡有亚硝基胍的器皿都的要用1mol/LNaOH溶液浸泡，使残存的亚硝基胍分解破坏，然后清洗[2]。
2.淘汰野生型诱变处理后的个体，营养缺陷型的比例较低，可采用菌丝过滤法、抗生素法、高温杀菌法除去野生菌，从而达到浓缩营养缺陷型菌株的目的。
微生物学复习资料-周德庆-期末总结
微生物学复习资料第一章原核微生物的形态、构造和功能伴孢晶体:少数芽孢杆菌在形成芽孢的同时,会在芽孢旁形成一颗菱形、方形或不规则形的碱溶性蛋白质晶体，称为伴孢晶体（即ð内毒素）.L型细菌：在某些环境条件下(实验室或宿主体内）通过自发突变而形成的遗传性稳定的细胞壁缺陷变异型.1．没有完整而坚韧的细胞壁，细胞呈多形态，有些能通过细菌滤器，故又称“滤过型细菌”.对渗透敏感，在固体培养基上形成“油煎蛋”似的小菌落（直径在0.1mm左右）古生菌:又称古细菌，是一个在进化途径上很早就与真细菌和真核生物相互独立的生物类群，主要包括一些独特生态类型的原核生物，如产甲烷菌及大多数嗜极菌。
革兰氏染色机制：结晶紫液初染和碘液媒染：在细菌的细胞膜内可形成不溶于水的结晶紫与碘的复合物。
乙醇脱色:G＋细胞壁较厚、肽聚糖网层次多和交联致密且不含类脂，把结晶紫与碘的复合物牢牢留在壁内,使其保持紫色；G—细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄和交联度差，结晶紫与碘复合物的溶出，使细胞退成无色.复染：G-细菌呈现红色，而G+细菌则仍保留最初的紫色。
重要性: 革兰氏染色有着十分重要的理论与实践意义.通过这一染色，几乎可把所有的细菌分成革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌两个大类，因此它是分类鉴定菌种时的重要指标。
又由于这两大类细菌在细胞结构、成分、形态、生理、生化、遗传、免疫、生态和药物敏感性等方面都呈现出明显的差异,因此任何细菌只要通过简单的革兰氏染色，就可提供不少其他重要的生物学特性方面的信息。
第二章真核微生物的形态、构造和功能1子实体：是指在其里面或上面可产生无性或有性孢子,有一定形状和构造的任何菌丝体组织2 菌物界：指与动物界,植物界相并列的一大群无叶绿素，依靠细胞表面吸收有机养料,细胞壁一般含几丁质的真核微生物3 二级菌丝：又称气生菌丝，由基内营养菌丝长出培养基外伸向空间的菌丝。
它是担子菌中由相应的异性的初生菌丝进行体细胞接合而形成的菌丝。
生物化学第四版课后参考答案
1 绪论1．生物化学研究的对象和内容是什么？解答：生物化学主要研究:（1）生物机体的化学组成、生物分子的结构、性质及功能；（2）生物分子分解与合成及反应过程中的能量变化；（3）生物遗传信息的储存、传递和表达；（4）生物体新陈代谢的调节与控制。
2．你已经学过的课程中哪些内容与生物化学有关。
提示：生物化学是生命科学的基础学科，注意从不同的角度，去理解并运用生物化学的知识。
3．说明生物分子的元素组成和分子组成有哪些相似的规侓。
解答：生物大分子在元素组成上有相似的规侓性。
碳、氢、氧、氮、磷、硫等6种是蛋白质、核酸、糖和脂的主要组成元素。
碳原子具有特殊的成键性质，即碳原子最外层的4个电子可使碳与自身形成共价单键、共价双键和共价三键，碳还可与氮、氧和氢原子形成共价键。
碳与被键合原子形成4个共价键的性质,使得碳骨架可形成线性、分支以及环状的多种多性的化合物。
特殊的成键性质适应了生物大分子多样性的需要。
氮、氧、硫、磷元素构成了生物分子碳骨架上的氨基（-NH2）、羟基（-OH）、羰基（）、羧基（-COOH）、巯基（-SH）、磷酸基（-PO4 ）等功能基团。
这些功能基团因氮、硫和磷有着可变的氧化数及氮和氧有着较强的电负性而与生命物质的许多关键作用密切相关。
生物大分子在结构上也有着共同的规律性。
生物大分子均由相同类型的构件通过一定的共价键聚合成链状，其主链骨架呈现周期性重复。
构成蛋白质的构件是20种基本氨基酸。
氨基酸之间通过肽键相连。
肽链具有方向性（N 端→C端）,蛋白质主链骨架呈"肽单位"重复；核酸的构件是核苷酸,核苷酸通过3′, 5′-磷酸二酯键相连，核酸链也具有方向性(5′、→3′),核酸的主链骨架呈"磷酸-核糖（或脱氧核糖）"重复；构成脂质的构件是甘油、脂肪酸和胆碱，其非极性烃长链也是一种重复结构；构成多糖的构件是单糖，单糖间通过糖苷键相连，淀粉、纤维素、糖原的糖链骨架均呈葡萄糖基的重复。
分子生物学L7-L12问题及答案
L71.gene family：基因家族。
它是指生物基因组中存在的许多来源相同，结构相似、功能相关的一组基因。
其成员可以成簇排列在一起或散布在不同染色体上（或兼而有之）。
2.Alu family：Alu家族，又称Alu序列。
是一种长度约为300 bp的DNA序列，因其第170位置附近都有AGCT 这样的限制性内切酶AluⅠ识别位点，可被限制性内切酶AluⅠ所切割(AG↓CT)而得名。
Alu族序列成员众多，在基因组中重复百万次以上，且广泛散布在非重复序列之间。
3.Satellite DNA：卫星DNA。
是位于真核细胞染色体中，由许多相同或相关的短小重复序列高度串联重复而成的DNA序列区。
它主要存在于染色体的着丝粒部位，通常不被转录。
因其碱基组成中GC含量少，与染色体其他部分DNA相比具有不同的浮力密度，在氯化铯密度梯度离心后呈现与大多数DNA有差别的“卫星”带而得名。
Minisatellite：小卫星DNA。
是一种存在于真核生物基因组DNA中比卫星DNA短的串联重复序列，重复序列单位长度在10-100bp 之间, 且在其重复单元之间并不存在间隔序列。
Microsatellite：微卫星DNA。
它是存在于真核基因组DNA中的一种具有比小卫星DNA更短重复单元(2~4bp)的卫星DNA，重复序列单位长度小于10 bp(一般是2-5，最多为6) ,例如真核生物染色体末端的端粒就是一种微卫星DNA。
STR：短串联重复序列（short tandem repeat，STR），又称微卫星DNA(microsatellite DNA)。
VNTR：(Variable number of tandem repeat)，即数目可变的串联重复序列，又称小卫星DNA (Minisatellite DNA)。
4.globin：珠蛋白。
是具有携带氧能力的蛋白质。
如血红蛋白、肌红蛋白、神经珠蛋白、胞红蛋白等。
5.To illustrate the developmental control via example. (via globin)通过珠蛋白阐述发育控制？血红蛋白是脊椎动物红血球的主要成分，其功能是运送氧气和二氧化碳。
武汉大学细胞生物学试卷及答案教案（小编推荐）
武汉大学细胞生物学试卷及答案教案（小编推荐）第一篇：武汉大学细胞生物学试卷及答案教案（小编推荐）mitochondrion线粒体呈颗粒或短线状，能高效地将有机物中储存的能量转换为细胞生命活动直接能源ATP的半自主性细胞器。
2 Apoptosis凋亡即细胞受基因调控的主动的生理性自杀行为，这种细胞死亡方式是正常的生理过程。
Signal hypothesis信号假说1975年由Blobel和Sabatini提出，即分泌蛋白可能携带N端短信号序列，一旦该序列从核糖体翻译合成，结合因子和蛋白结合，指导其转移到内质网膜，后续翻译过程将在内质网膜上进行。
该假说解释了游离核糖体产生非分泌蛋白，而内质网附着核糖体能产生分泌蛋白的差异存在于蛋白本身。
4 Cyclin周期蛋白含量随细胞周期进程变化而变化，一般在细胞间期内积累，在细胞分裂期内消失，在下一个细胞周期又重复这一消长现象的蛋白，为诱导细胞进入M期所必需。
5 Stem cell干细胞干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞。
在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。
干细胞具有自我更新和几乎无限增殖的能力，具有迁移至某些特定组织和排除有毒化学因子的能力。
6端粒telomere是真核生物线性基因组DNA末端的一种特殊结构，它是一段DNA序列和蛋白质形成的复合体，随着细胞分裂而逐渐缩短。
其DNA序列相当保守，一般有多个短寡核苷酸串联在一起构成。
人类的端粒DNA长5~15千碱基对。
它具有保护线性DNA的完整复制、保护染色体末端和决定细胞寿命等功能。
7联会复合体（synaptonemal complex，SC）在联会的部位形成的一种特殊的复合结构，沿同源染色体长轴分布，宽1.5~2um，在电镜下可以清楚地显示其显微结构，被认为与同源染色体联会和基因重组有关。
是减数分裂偶线期两条同源染色体之间形成的一种结构，主要由侧生组分、中间区和连接侧生组分与中间区的SC纤维组成，它与染色体的配对，交换和分离密切相关。
荧光报告基因实验
荧光报告基因实验一、什么是荧光素酶和双荧光素酶？荧光素酶报告基因检测是以荧光素（luciferin）为底物来检测萤火虫荧光素酶（Firefly Luciferase）活性的一种报告系统。
荧光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的过程中，会发出生物荧光（bioluminescence），可通过荧光测定仪设备测定luciferin氧化过程中释放的生物荧光，常应用于miRNA靶基因验证及启动子转录活性调控等方向研究。
利用荧光素酶与底物结合发生化学发光反应的特性，把感兴趣的基因转录的调控元件克隆在萤火虫荧光素酶基因的上/下游，构建成荧光素酶报告质粒。
然后转染细胞，适当刺激或处理后裂解细胞，测定荧光素酶活性。
通过荧光素酶活性的高低判断刺激前后或不同刺激对感兴趣的调控元件的影响。
双荧光素酶通常是指萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶。
萤火虫荧光素酶是从甲虫（Photinus pyralis）中分离得到，分子量为61kDa；海肾荧光素酶（Renilla Luciferase）则是从海肾（Renilla reniformis）中分离，分子量为36kDa。
（一）两种酶的区别？1. 底物和辅因子不同：萤火虫荧光素酶需要荧光素、氧气、ATP和镁离子同时存在才能发光；而海肾荧光素酶仅需要腔肠素（coelenterazine）和氧气。
2. 发光的颜色不同：萤火虫荧光素酶产生的光颜色呈现黄绿色，波长550-570nm；而海肾荧光素酶产生蓝光，波长480nm。
正是由于这两种酶的底物和发光颜色不同，所以在双报告实验中得到广泛应用。
（二）为什么采用双荧光素酶报告系统？单报告基因实验往往会受到各种实验条件的影响，而双报告基因则通过共转染的“对照”作为内参为试验提供一基准线，从而可以在最大程度上减小细胞活性和转染效率等外在因素对实验的影响，使得数据结果更为可信。
一般情况下，海肾荧光素酶基因作为内参使用，将带有海肾荧光素酶基因的质粒与报告基因质粒共转染细胞；或是将两个报告基因构建到同一个质粒上，分别用不同的启动子启动其表达。
引物菌种鉴定实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的本次实验旨在通过引物菌种鉴定技术，对未知菌种进行准确鉴定。
实验过程中，我们将利用PCR技术扩增目标菌种特异基因片段，并通过序列分析确定其分类地位。
二、实验材料1. 菌株来源：未知菌种样本（由客户提供）2. PCR试剂：PCR反应试剂盒、DNA模板提取试剂盒、dNTPs、引物、DNA聚合酶等3. 仪器设备：PCR仪、凝胶成像系统、DNA测序仪等4. 其他：实验耗材、缓冲液、DNA标准品等三、实验方法1. DNA模板提取：根据DNA模板提取试剂盒说明书，提取未知菌种样本的DNA。
2. PCR扩增：根据目标基因序列设计特异性引物，进行PCR扩增。
PCR反应体系如下：- 反应体积：25 μL- 模板DNA：1 μL- 上游引物：1 μL- 下游引物：1 μL- dNTPs：2 μL- DNA聚合酶：0.5 μL- ddH2O：18.5 μL- 反应条件：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35个循环。
3. PCR产物检测：将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察扩增结果。
4. DNA测序：将PCR产物送至测序公司进行测序，获得目标基因序列。
5. 序列分析：利用BLAST程序将测序结果与GenBank数据库中的已知序列进行比对，确定目标菌种分类地位。
四、实验结果1. PCR扩增结果：PCR扩增产物在琼脂糖凝胶电泳中呈现特异性条带，与预期片段大小一致。
2. DNA测序结果：测序结果获得目标基因序列，长度为X bp。
3. 序列分析结果：通过BLAST程序比对，确定目标菌种属于Y属、Z属，与GenBank数据库中已知序列的同源性为100%。
五、讨论与分析1. 实验结果表明，引物菌种鉴定技术能够有效对未知菌种进行鉴定。
通过PCR扩增目标基因片段，结合DNA测序和序列分析，可以准确确定目标菌种的分类地位。
2. 本实验中，PCR扩增产物在琼脂糖凝胶电泳中呈现特异性条带，说明引物设计合理，扩增效率较高。
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甲基营养菌Methylobacterium extorquens AM1中最适荧光蛋白报告基因的鉴定朱丽萍;刘聪聪;宋书真;刁斌【摘要】近年来荧光蛋白成为基因工程中常用的遗传标记,详尽解读不同荧光蛋白基因在甲基营养菌中的表达可以鉴定最适的荧光报告基因.克隆了常用的绿色荧光蛋白eGFP、红色荧光蛋白mCherry、黄色荧光蛋白YFP以及其他来源的绿色荧光蛋白wGFP和红色荧光蛋白RFP共5种荧光基因,构建相应的表达载体并在甲基营养菌Methylobacterium extorquens AM1中进行表达.通过荧光成像观察和SDS-PAGE蛋白凝胶电泳进行荧光蛋白表达鉴定.通过细菌生长曲线、荧光总量和相对荧光强度的测定,进行荧光稳定性和表达强度的鉴定.结果在转化子中均检测到目的荧光蛋白条带,但RFP荧光表达量痕量且未检测到荧光成像;稳定性最强和相时荧光强度最高的是YFP,是常用eGFP的1.6倍,mCherry的3.4倍.在M.extorquerns AM1中最适荧光蛋白为YFP.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2019(035)004【总页数】8页(P43-50)【关键词】甲基营养菌;荧光报告基因;相对荧光强度【作者】朱丽萍;刘聪聪;宋书真;刁斌【作者单位】青岛农业大学生命科学学院山东省应用真菌重点实验室,青岛266109;青岛农业大学生命科学学院山东省应用真菌重点实验室,青岛266109;青岛农业大学生命科学学院山东省应用真菌重点实验室,青岛266109;青岛农业大学生命科学学院山东省应用真菌重点实验室,青岛266109【正文语种】中文甲基营养菌是一类广泛存在的可利用一碳化合物作为唯一碳源的微生物类群，其模式菌株M.extorquens AM1已成为研究微生物进化和合成代谢的良好材料［1-4］，但受该菌遗传背景的影响，目前只有一套基于IncP复制子的遗传质粒操作系统［5-6］，因此多元化的标记基因开发是开展遗传操作工作的基础，而高效稳定的遗传标记基因尤为重要。
荧光蛋白基因是一类广泛应用的报告基因，可通过对荧光强度的检测，表征细胞内一个或多个基因的表达水平。
1962年Shimomura首次从水母（Aequorea victoria）体内发现并分离到绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP），1999年Matz等［7］从珊瑚中分离到红色荧光蛋白（Red fluorescent protein，RFP），灵敏度和信噪比均比GFP高，但是具有成熟慢、易聚合和对细胞有一定的毒性等特性限制其应用，而后出现的一系列优化突变体尤以mCherry成熟快、单体性好，被广泛应用［8］。
目前荧光蛋白按波长可分为深蓝色、蓝色、青色、绿色、黄色、橙色、红色、深红色和近红外系列等40多种，激发/发射波长范围从355/424 nm到684/708 nm［9-10］。
绿色荧光蛋白eGFP因其灵敏度高，不需要其他辅助底物就能产生较强的荧光，且对细胞无毒害作用，不影响其他蛋白的表达，稳定性好，已在微生物、植物、动物中获得成功表达。
在M. extorquens菌株中已报道表达的荧光蛋白有mCherry和GFP，其中mCherry表达显著，在荧光成像、荧光定位及基因表达强度鉴定方面表现出良好的特征［6，11］，而绿色荧光蛋白的种类多达6种以上［5，12-15］。
以上研究报道所涉及的荧光检测手段和取样测定点都不尽相同，荧光强度表征方式也不一而足，荧光蛋白之间没有详尽的荧光表达分析，因此各荧光基因在M. extorquens AM1中表达是否稳定，以及荧光强度在菌株生长过程中的变化趋势尚不明确。
截至目前，其他荧光报告基因的使用在M.extorquens未见报道。
为进一步明确荧光报告基因在甲基营养菌生长过程中的表达变化，筛选最适的荧光报告基因，我们克隆了实验室现有的五种荧光基因egfp、yfp、wgfp、mcherry、rfp，利用甲基营养菌中常用的强启动子PmxaF控制表达［16］，转化至M. extorquens AM1后筛选相应的转化子并进行测定和比较分析；借助先进的细胞微孔板成像仪器cytation5［17-18］分别对其荧光成像和荧光表达强度的测定，获得荧光成像展示及荧光表达水平分析；结合SDS-PAGE蛋白凝胶电泳确证荧光基因都能表达出相应的蛋白；通过相对荧光强度和稳定性比较，最终确定最优的荧光蛋白报告基因yfp，为后续实验中荧光标记基因的选择及荧光检测提供借鉴和数据支持。
1 材料与方法1.1 材料甲基营养菌M. extorquens AM1和大肠杆菌E.coli DH5α均由本实验室保藏。
质粒pCM80是可在大肠杆菌和甲基营养菌中复制的质粒，为本实验室保藏。
pX458、pSWU-YFP、pSCV1-2、pSWU-mCherry、pSCV1-RFP质粒分别携带egfp、yfp、wgfp、mcherry、rfp荧光基因，来自购买或馈赠。
DH5α感受态细胞用于质粒的转化和扩增，培养与保藏用LB培养基：蛋白胨10g/L、酵母粉5 g/L、Nacl 10 g/L，37℃培养。
M. extorquens AM1菌株的培养采用Hypho培养基，具体配制方法参照文献［19］，30℃条件下培养。
所需抗生素四环素（tet，终浓度10 μg/mL）。
分子克隆相关酶、DNA片段及质粒抽提纯化试剂盒购于Thermo公司。
1.2 方法1.2.1 多种荧光报告基因差异比对及PCR扩增将本论文所用的五种荧光基因通过Bioedit中的clastalW软件进行DNA序列和编码蛋白比对分析，标记差异位点，设计通用引物对Fluo-F和Fluo-R，分别以质粒pSWU-mCherry、pX458、pSWU-YFP为模板进行PCR扩增mcherry、egfp、yfp的基因序列；设计RFP-F 和RFP-R为引物对，以pSCV1-RFP质粒为模板，PCR扩增rfp序列；设计wGFP-F和wGFP-R引物对，以pSCV1-2质粒为模板PCR扩增wgfp序列。
相关引物序列信息见表1。
1.2.2 荧光报告基因重组载体的构建及转化将PCR扩增得到的五种荧光基因片段用KpnⅠ-EcoRⅠ双酶切纯化回收后，分别与同样酶切的pCM80质粒进行连接，构建含有荧光报告基因的重组载体 pCM80-egfp、pCM80-yfp、pCM80-wgfp、pCM80-mcherry和pCM80-rfp，并测序验证。
将重组质粒与对照质粒pCM80分别电转化至M. extorquens AM1感受态细胞中，参数设定：1 800 V；1 mm电转杯；2 μL质粒混合50 μL感受态细胞；电击时间5 ms。
在含有四环素的固体平板上筛选重组转化子，用于后续的分析鉴定。
1.2.3 重组菌株生长曲线测定将固体平板上的重组菌株单菌落转移到含有3 mL Hypho液体培养基，成像微孔板检测系统-Cytation 5（BioTek）中，选择荧光检测，安装荧光滤光片（通道1：EX485/20，EM528/20；通道 2：EX530/25，EM590/35），选取96孔板上相应的读取范围，测定荧光强度值，同时测定每孔的OD600值，则相对荧光强度=Δ荧光值/ΔOD600，即为荧光表达水平。
测定前先测定900 nm和977 nm的吸收值（Abs900，Abs977），通过公式（Abs977-Abs900）/0.18将光程校正到1 cm对应的OD600的值。
30℃、200 r/min，培养至指数期（OD600约0.6-0.8），转至含100 mL Hypho液体培养基，使培养液初始OD600=0.01，30℃、200 r/min培养，定时取菌用紫外分光光度计测定OD600值，直至OD600值开始出现下降为止，每个菌株3个生物学重复。
表1 本论文所用引物信息注：小写为保护碱基，斜体为酶切位点Name Sequence（5′-3′） Restriction enzyme site Fluo-F cggGGTACCATGGTGAGCAAGGGCGAG KpnⅠFluo-R ccgGAATTCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGC EcoRⅠRFP-F cccGGTACCATGGACGTCATCAAGGAGTTC KpnⅠRFP-R ccgGAATTCTTAGTGATGGTGATGATGATGG EcoRⅠwGFP-F cggGGTACCATGAAAGGGCAATTCTGC KpnⅠwGFP-R ccgGAATTCTTAGTGATG GTGATGATGATG EcoRⅠ1.2.4 重组子荧光成像观察挑取重组菌株的单菌落接入带有Hypho液体培养基的试管中进行培养，分别取培养到0 h、24 h、48 h、72 h、96 h的菌液200 μL，离心去上清，洗涤2次，用同样体积的无菌水重悬，取20 μL加在烘干的载玻片上并加覆盖玻片，放入玻片适配器中，利用细胞成像微孔板检测系统-Cytation 5（BioTek）进行荧光成像检测，通过Gen5软件设定物镜观察范围，先自动聚焦再手动聚焦，并在［Brightfield（明场）］下找到菌体细胞，进而切换至相应的荧光场［Red：586，647］、［Green：469，525］下微调节焦距进行成像观察，拍照保存并分析。
1.2.5 荧光报告基因的蛋白SDS-PAGE电泳检测将50 mL的重组菌株的液体发酵液培养至OD600=0.8，收集菌体，离心洗涤，重悬于5 mL Tris-HCl（100 mmol/L，pH=8.0），在4℃下，用 French press细胞破碎仪38 kPa破碎至澄清，制备粗酶液，离心，分离上清和细胞碎片沉淀（沉淀加适量无菌水重悬），分别取粗酶液、上清和细胞沉淀与上样缓冲液混合，采用SDS-PAGE（5%浓缩胶和10%分离胶）进行电泳检测，用考马斯亮蓝R-250染色观察荧光蛋白的表达。
1.2.6 相对荧光表达强度测定根据生长曲线取点，测定菌株在相应时间和OD下荧光表达强度。
每次取200 μL菌液加至96微孔板中，加载至细胞2 结果2.1 5种荧光蛋白基因的比对分析5种荧光蛋白 eGFP、YFP、wGFP、mCherry和RFP，分别获得其基因序列和蛋白质序列，利用Bioedit软件中的ClustalW多序列比对模块分析发现，egfp与yfp的基因序列仅有9个碱基的差异，一致性达98.75%（碱基数比：711/720）（图1-A）；而mcherry的基因序列虽与egfp/yfp存在较大的碱基差异，但在5′端和3′端各有21 bp和25 bp的同源序列（图1-A）。
rfp与mcherry的基因序列一致性为97%（644/661）（图1-B）。