弱毒力CMV载体表达抗性基因增强植物抗除草剂性能的应用
黄瓜花叶病毒病防治策略研究进展
黄瓜花叶病毒病防治策略研究进展植物病毒病是危害农作物的一类重要病害，因其危害大、防治困难而有植物癌症之称。
近年来，植物病毒病在果树、蔬菜、花卉以及多种经济作物上的危害越来越严重。
大量研究证明，植物病毒病多数是由烟草花叶病毒（TMV）和黄瓜花叶病毒（CMV）引起的。
黄瓜花叶病毒能侵染1000多种单、双子叶植物，可经75种蚜虫传播，有些分离物还可通过种子传播，是寄主植物最多、分布最广、最具经济重要性的植物病毒之一。
能引起多种蔬菜产生花叶、坏死、枯萎等，为害面积大。
为了减轻其在生产上的危害，多年来科研工作者尝试了多种不同方法防治CMV，提出了不同的防治策略。
本文拟对相关内容进行探讨，以寻求高效的黄瓜花叶病毒防治策略。
1黄瓜花叶病毒（CMV）概述1.1CMV分类及危害黄瓜花叶病毒（Cucumbermosaicvirus，CMV）属雀麦花叶病毒科（Bromoviridae）黄瓜花叶病毒属（Cucumovirus）的典型成员。
白Doolittle和Jagge分别报道CMV是黄瓜花叶病的病原以来，各国学者相继报道了CMV的危害。
近10多年来，CMV在一些国家和地区的许多作物上造成严重危害，如引起番茄的坏死、香蕉的花叶（心腐）、豆科植物的花叶、瓜类的花叶、西番莲的死顶等。
此外，许多过去被认为是新的病毒，现已被证实为CMV新的株系。
几十年来，各国学者根据他们分离到的CMV的寄主范围及症状表现得到许多株系或分离物，迄今，全世界已报道了100多个CMV株系（如Fny、Y、O、NT9、lx、Q）或分离物。
1.2CMV微观结构及RNA组成黄瓜花叶病毒为直径约29nm的二十面体的小颗粒，颗粒分子量约为5.3×10E6，其中18%是RNA，82%是蛋白质。
CMV是单链RNA病毒，属三分体基因组，包括4个RNA片段，即RNA1～4，其分子量分别为1.01×10E6、0.89×10E6、0.68×10E6、0.33×10E6。
抗病虫育种技术
因的影响，即抗性是寄主与寄生物（病虫） 双方的基因型互作的结果，但它们也各自有 其独立的遗传系统。 针对寄主方面每一个垂直抗病基因，在 病原菌方面或迟或早也会出现一个相对应的 毒性基因。毒性基因只能克服其相应的抗性 基因，而产生毒性（致病）效应。在寄主-寄 生物体系中，任何一方的每个基因都只有在 另一方相应基因的作用下，才能被鉴定出来。
上述概念延伸到寄主-昆虫的关系时也同样存 在，即当寄主中每有一个主效抗性基因时，在 昆虫方面便迟早会有一个相应的致害基因。当 寄主具有抗虫基因时而昆虫不具有致害基因时， 则表现为抗虫；而当寄主具有抗虫基因时，但 昆虫具有相应的致害基因时，寄主则是不抗虫 的。
第二节 抗病性及其鉴定
一、病原菌致病性的遗传和变异
过去认为基因对基因学说主要是针对主效基因 制约的垂直抗性而言，目前认为：在微效基因系 统中也可能存在着基因对基因的关系，只是当若 干个乃至多个微效基因共同决定着抗病性和致病 性时，分化互作很小，难以从试验误差中区分开 来而被忽略。 同时，就每一个微效基因而言，虽然存在着基 因对基因的关系，但是其专化性很弱，相对品种 对相对小种的定向选择作用也就不大，因而小种 的组成变化较慢，所以就总的系统而言，抗病性 能稳定持久。
（多基因，水平抗病性）
⑴ 垂直抗性（小种特异性或专化性抗性）
同一寄主品种对病原菌的不同的生理小种具有特异 反应或专化反应。 特点是抗、感反应表现明显，易于识别。往往受单 基因或几个主基因的控制，抗病×感病杂交后代的抗 性一般按孟德尔遗传规律分离。 但抗病性易随病原菌生理小种的变异而丧失，大面 积推广易使侵染它的生理小种上升为优势小种。
（二）致病性的遗传
对真菌病害的遗传研究认为： 毒性为单基因隐性遗传。 侵染力是多基因遗传。
植物基因沉默
摘要：植物抗病性是研究植物与病原体之间相互关系中寄主植物抵抗病原体侵染的性能，这是植物的一种属性。
对于植物的抗病性,人们早就从遗传学角度进行了研究。
40 年代通过遗传分析，提出了基因对基因学说，认为抗性是植物品种所具有抗性基因和与之相应的病原体的非致病性基因结合时才得以表现，从遗传上初步说明了病原体和寄主的相互关系。
60 年代发现寄主对病原体侵染的过敏反应，认为这是寄主对病原体侵染防卫反应。
70 年代开始运用分子生物学技术分析病原体的无毒基因和致病基因，开始确定寄生的防卫基因。
80 年代研究得到寄主系统抗病反应与水杨酸相关。
90年代开始克隆寄主的抗病基因。
从病毒诱导基因沉默的遗传学和分子生物学角度来探讨植物抗病的可能机制，基因沉默是近十年来在转基因植物中发现的一种后生遗传现象。
基因沉默大体可以分为两类：位置效应引起的基因沉默和同源依赖的基因沉默。
其中，同源依赖的基因沉默又可以分为转录水平的基因默和转录后水平的基因沉默。
基因沉默的发现使得人们对植物和病毒的相互关系有了一个新的认识。
基因沉默研究中所发现的转录后基因沉默现象是植物抵御病毒入侵、保持自身基因组完整性的一种防御机制，是植物与病毒共进化的结果。
对于沉默产生的机理，尤其是转录后基因沉默，已经提出不少模型，有阈值模型、异常RNA模型、生化开关模型、反义RNA模型等，但是都未能较全面地解释基因沉默中出现的各种实验现象。
该文现就实验所取得的相关结果、转录后基因沉默机制和植物对病毒防御机制的相互关系，以及其研究进展进行综述。
植物病毒是农作物生产上的主要病害之一，据统计，全球共有几百种植物病毒。
植物病毒有时会对粮食产量和人类数量产生灾难性的影响。
仅以马铃薯为例，因马铃薯X 病毒(PVX) 造成的损失可达10 % ，马铃薯Y 病毒( PVY) 所造成的损失可高达80 %。
对病毒病的研究始于20 世纪初，1928 年Wingard[28]首次发现了“恢复”( recovery) 现象，即植物受到病毒侵染发病后，经过一定时间植株可以从病毒侵染症状中“恢复”过来，新长出的叶片不再感染病毒，具有了一定的抗性。
反义技术及其在植物基因工程中的应用
吉林农业大学学报 2004,26(5):515～518Journal o f Jilin Agricultural Univer sity反义技术及其在植物基因工程中的应用Ξ柴晓杰,王丕武ΞΞ,关淑艳,徐雅维(吉林农业大学生物技术学院,长春130118)摘 要:反义技术是根据核酸杂交原理设计反义核酸来人为控制基因表达的方法,现已成为基因工程中的常用技术。
文中就反义技术的作用机制、在植物基因工程中的应用及其前景作简要综述。
关键词:反义技术;核酸杂交;基因表达;植物基因工程中图分类号:Q78 文献标识码:A 文章编号:100025684(2004)0520515204Antisense T echnology and Its Application in Plant G enetic EngineeringCH AI X iao 2jie ,W ANG Pi 2wu ,G UAN Shu 2yan ,X U Y a 2wei(College o f Biotechnology ,Jilin Agricultural Univer sity ,Changchun 130118,China )Abstracts :Antisense technology has been comm only used in genetic engineering 1It is a method to design antisense nucleic acids based on hybridization in order to regulate gene expression artificially 1In this pa 2per ,we briefly review the mechanism of antisense technology and its application in genetic engineering and look forward to the prospect of this technology 1K ey w ords :antisense technology ;hybridization ;gene expression ;plant genetic engineering 20世纪80年代初,人们在研究反义核酸对原核和真核基因调控的基础上,发现了反义技术(antisense technique )。
植物病毒病防治策略的研究进展
因、毒素蛋白基因以及动物的病毒抗体基因 [ 5] 。各种抗性 基因的应用及机理如下 : 311 复制酶介导的保护作用
3 植物抗病毒基因工程
迄今为止 ,人们已运用各种基因工程策略在多种植物 上得到不同程度的抗病毒能力 。至 1998 年美国批准商业 化应用的转基因植物有抗病毒西葫芦和番木瓜 ,国内有转 基因抗病毒烟草 、番茄和甜椒的产品获准商业化应用 。这 些抗病毒的转基因植株应用的基因有病毒来源的如外壳 蛋白复制酶、移动蛋白基因和非病毒来源的植物抗性基
2 卫星 RNA病毒的保护作用
1983年田波等首先应用卫星 RNA作为防治 CMV 的
生防因子 ,用于田间和温室的病毒病害防治 ,收到良好效 果 [ 2～4] 。同时组建了植物病毒卫星 RNA生防制剂 CMV — S52 、CMV—S51 ,并 在 1982—1984 年 间对 含卫 星 RNA 的 CMV —S51分离物的寄主范围、症状反应等特性进行了研 究 。研究发现用 CMV —S51免疫“丰丰 ”青椒品种 10—15d 后 ,对强病毒 CMV81—3有一定程度的保护作用 ,免疫同 丰 37青椒品种 10—15 d后 ,对 CMV82—6—35 有强的保 护作用 ,免疫心叶烟后 10d对强病毒 TMV 有明显的保护 作用 [2,4,14] 。周雪平等人研究发现利用弱株系 CMVP1 接 种番茄 、三生烟、心叶烟后可抵抗强毒株的浸染 ,在番茄和 三生烟上的保护率达 90%以上 ,当去除 CMV P1 中的卫星 RNA后带病的番茄可产生较重的症状 [ 2] 。
甚至对许多非烟草花叶病毒性的病毒如黄瓜花叶病毒花生褪绿条纹病毒烟草环斑病毒均有效20核酶和反义基因核酶是一种能特异切割rna的rna依据已知的病毒基因组的特定区域序列设计rz使它能特异识别切割病毒的特定区域从而切断病毒基因组破坏其生物功能已有成功例子反义基因是与目的核酸序列互补的反义序列它可以抑制或封闭目的基因的复制剪接和表达较成功的例子是表达plrvtgmvcp基因的反义rna的烟草对各自来源的病毒都显示了较强的抗性缺陷干扰rnadi是指那些序列与亲本病毒相关的但必需依赖于病毒才能复制的rna分子它与卫星rna不同的是di与病毒核酸同源它直接来源于病毒的核酸序列但它在病毒核酸中有不边疆体它和反义rna技术有所不同
番茄育种动态及发展趋势
番茄育种动态及发展趋势作者：卢文经; 姜炳义; 汉晓冬; 刘策; 宋辉; 刘芳来源：辽宁农业科学番茄是世界上重要的蔬菜作物之一，分为加工型番茄和鲜食型番茄，在各国的蔬菜栽培中均占有相当的比例。
从发展趋势看，人们对番茄的需求量正在加大，据联合国粮农组织统计，1997年全世界番茄栽培为309.4ha，总产量达8487.3万ｔ。
市场对其番茄果实大小、形状、颜色、品质、风味、耐储运性、上市时间等不断提出新的要求，而作为生产者还要考虑品种的抗病性、丰产性、熟性以及经济效益。
以上这些毫无疑问都应成为番茄育种者的育种目标。
综合国内外有关专家的观点及个人的理解，仅从传统育种技术和利用基因工程技术两个方面论述番茄育种研究进展。
所谓传统育种技术就是指利用种群内基因重组原理通过筛选的办法来达到选育新品种的目的；而利用基因工程技术进行番茄品种特性改良，主要指种群间的转基因技术，从而获得抗病毒、抗虫、抗除草剂、抗冻、延长储藏期、改善风味、改变果色和育性等基因，这些都是通过常规育种技术难以达到的。
本文从以下几个方面来分析和探讨番茄育种技术。
1番茄适应性育种适应性包含的内容和范围很广，就目前而言，主要指番茄的耐弱光及抗寒性筛选研究。
1.1耐弱光及短日照育种这是温室番茄适应性育种的一个重要方面，主要通过比较座果及花穗分化情况来筛选材料。
1.2株型育种株型育种除了耐弱光温室栽培目的以外就是省工品种的选育。
如早在20世纪50年代，英国人就发现了具有隐性基因Ts的突变中其侧枝的生长是受ＩＳ基因控制的，当番茄植株含有ＩＳ基因时就只长一个茎，这不仅能减少整枝打杈的劳力，而且有利于机械化栽培。
1.3抗寒育种番茄抗寒筛选因加工番茄与鲜食番茄栽培条件和方式的不同而不同。
加工番茄主要指能在早春直播抗低温，即较强的低温发芽与苗期抗寒能力。
而鲜食番茄抗寒筛选方面，因为是温室栽培，除了要求幼苗有一定抗寒能力外，要求成株期在低温下有较好的座果能力。
研究证明，在低温条件下，花粉质量和座果率在不同品种间有较大差异，通过比较这种差异可对成株抗寒性进行选择。
植物转基因抗性策略研究进展
126--农业经济•专题综述 DOI:10.16498/ki.hnnykx.2016.010.035自首次报道转基因植物表达植物病毒序列并表现抗病性以来，人们尝试了各种不同类型的抗性产生方法。
这些方法主要包括表达不同的病毒序列、非病毒序列、宿主来源的抗性基因及各种宿主防御反应因子等。
笔者主要围绕以上各种成分或序列介导产生的抗性展开综述。
1 病毒蛋白介导的抗性策略1.1 外壳蛋白介导的抗性外壳蛋白（Coat protein ，CP ）介导的抗性方法主要通过在转基因植株表达病毒的外壳蛋白基因从而获得抗此种病毒或相关病毒的能力。
1986年Abel 等[1]将烟草花叶病毒（TMV ）的外壳蛋白编码序列导入到烟草中，获得了具有TMV 抗性的抗病毒植株。
随后，科学家们先后将黄瓜花叶病毒（CMV ）、马铃薯Y 属病毒（PVY ）、辣椒重症花叶病毒（PepSMV ）等的外壳蛋白基因导入烟草植株后，均得到了抗病毒植株。
外壳蛋白介导的抗性可能是蛋白质水平介导的干扰或RNA 水平的沉默的结果，也可能同时存在蛋白质和RNA 两种作用机制。
此外，当接种高病毒剂量或接种病毒RNA 时，外壳蛋白介导的抗性普遍存在容易被打破的共性[2-4]。
1.2 复制酶基因介导的抗性复制酶（Replicase ）介导的抗性方法主要通过表达病毒复制酶通读序列、全长序列、突变序列及缺失序列获得具有抗病毒能力的植株。
1990年Golemboski 等[5]将TMV 的54KD 复制酶基因转入烟草植株，获得了高抗TMV 的转基因抗病毒植株。
研究表明，复制酶基因介导的抗性策略产生的抗性不具广谱性，接种非常高剂量的病毒时表现出强抗性，接种病毒RNA 时也表现出高水平的抗性[6]，但是表达缺失型复制酶蛋白编码序列表现出广谱抗性[7]。
关于复制酶基因介导的抗性机制尚无定论。
多数早期的研究认为复制酶基因介导的抗性是由蛋白介导的，稍后的研究却发现存在RNA 介导的过程，也许复制酶基因介导的抗性在蛋白质水平和RNA 水平存在互补或替换的过程[6]。
《植物转基因技术》PPT课件
T-DNA区：能够转移整合入植物受体基因组， 并能在植物细胞中表达，从而导致 冠瘿瘤发生。
Vir区：由多个毒性基因组成， 其编码蛋白对 T-DNA的转移和整合 必不可少。
1.Ti质粒上的T-DNA：
仅存在于被感染植物细胞的细胞核中，整 合到植物基因组中 ，T-DNA以单拷贝或多拷贝 形式插入植物基因组中,插入的位点也各不相同。
实例 小麦的基因枪转化
3、幼胚的高渗预培养： 4、微弹的制备与基因枪的轰击（无菌）： 5、抗PPT愈伤组织的选择：白色生长快的为
外源质粒转化的愈伤（见图）。 6、抗PPT再生植株的获得：（见图）
实例 小麦的基因枪转化
7、抗PPT转化植株的耐盐性：
含盐0.7％NaCl条件下转化植株表现较强的耐盐性。
转化后的gus的瞬间表达转化后3周产生的抗性愈伤组织抗性愈伤的gus反应再生的转化植株转化植株叶片的gus表达抗性植株后代的抗性检测自1983年人类首次获得转基因植物后已有大量的抗病抗逆及品质改良的转基因植物获得成功在农业生产上已经发挥了重要的作用
《植物转基因技术》PPT 课件
植物转基因技术： 又称基因重组技术或DNA重组，
二）、转化载体系统：
Ti质粒载体系统一般分为两类： 一类叫共整合载体系统； 一类叫双元载体系统。
（一）、共整合载体质粒：
1.pGV3850 系 统 :
这是第一个非致癌的 Ti质粒衍生载体,来自 胭脂碱型质粒 pTiC58Trac, 包 括 25bp末端序列和胭脂 碱合成酶基因,T-DNA 上的其它基因则为 pBR322 序 列 取 代 。
5. 植物叶绿体基因工程
进行叶绿体遗传转化研究，建立了烟草叶绿体遗传 转化体系。并将一些基因转入烟草叶绿体。
黄瓜花叶病毒基因沉默载体的病毒含量和症状分析
第2卷第6期植物医学2023年12月V o l.2N o.6P l a n tH e a l t h a n dM e d i c i n e D e c.2023D O I:10.13718/j.c n k i.z w y x.2023.06.003黄瓜花叶病毒基因沉默载体的病毒含量和症状分析吴娟,李佳燕,李伟,曾紫怡,竺锡武湖南人文科技学院农业与生物技术学院,湖南娄底417000摘要:病毒诱导的基因沉默(V i r u s-i n d u c e dG e n eS i l e n c i n g,V I G S)已被广泛应用于植物基因功能研究,具有操作容易㊁较短时间内即可观察到沉默效果㊁成本较低的特性.黄瓜花叶病毒(C u c u m b e rM o s a i cV i r u s,C MV)V I G S载体已经应用于沉默辣椒㊁烟草㊁大豆等植物基因,对于研究植物基因功能有重要作用.研究以C MV的F n y株系(C MV-F n y)R N A2中2b基因缺失载体C MV-F209ә2b和表达2b基因N端61个氨基酸的载体C MV-F2092b61a a为对象,插入不同长度的外源基因g f p片段后,分析C MV V I G S载体在本氏烟植株上的病毒表达含量及诱导产生的病毒症状.结果表明,插入外源基因片段后,病毒外壳蛋白(C o a tP r o t e i n,C P)基因R N A表达水平均明显降低.携带不同长度g f p序列的重组病毒C MV F2092b61a a-g f p100㊁C MV F2092b61a a-g f p200和C MV F2092b61a a-g f p350其C P R N A 含量比装载最适长度g f p序列的C MV F209ә2b-g f p350高10倍左右,且同样不引发明显病毒症状.由此可见,C MV F2092b61a a相比C MV-F209ә2b更适合作为高效的V I G S载体,且初步探明它的最适插入片段长度为200~350n t.关键词:病毒诱导的基因沉默;黄瓜花叶病毒;2b;病毒含量中图分类号:S432文献标志码:A文章编号:20971354(2023)06002107A n a l y s i s o fV i r u sC o n t e n t a n dS y m p t o m s o fC u c u m b e rM o s a i cV i r u s-b a s e dG e n e S i l e n c i n g V e c t o rWUJ u a n, L I J i a y a n, L IW e i,Z E N GZ i y i,Z HU X i w uI n s t i t u t eo f A g r i c u l t u r ea n dB i o t e c h n o l o g y,H u n a nU n i v e r s i t y o f H u m a n i t i e s,S c i e n c ea n dT e c h n o l o g y,L o u d i H u n a n417000,C h i n a收稿日期:20230923基金项目:湖南省教育厅科研创新平台开放基金(18K100).作者简介:吴娟,博士,讲师,主要从事植保生物技术研究.通信作者:竺锡武,研究员.22植物医学h t t p://x b b j b.s w u.e d u.c n第2卷A b s t r a c t:V i r u s-i n d u c e d g e n e s i l e n c i n g(V I G S)h a s b e e nw i d e l y u s e d f o r p l a n t g e n e f u n c t i o n a l a-n a l y s i s.I t i s e a s y t o o p e r a t e,t o o b s e r v e t h e s i l e n c i n g e f f e c t i n s h o r t t i m e a n d l o wc o s t.C u c u m-b e rM o s a i cV i r u s(C MV)h a s b e e n s u c c e s s f u l l y d e p l o y e d a s aV I G S v e c t o r i n p l a n t s s u c h a s c h i l-i,t o b a c c o a n d s o y b e a n,p l a y i n g a n i m p o r t a n t r o l e i n p l a n t g e n e f u n c t i o n a l a n a l y s i s.I n t h i s s t u d-y,G F P g e n e f r a g m e n t s o f d i f f e r e n t l e n g t h sw e r e i n s e r t e d i n t o t h e2b g e n e d e l e t i o n v e c t o r C MV-F209ә2ba n dC MV-F2092b61a aw i t h t r u n c a t e d2b t o a n a l y z e t h e v i r u s e x p r e s s i o n l e v e l a n d i n-d u c e dv i r u s s y m p t o m s o f t h e s eC MV V I G S v e c t o r s i n N i c o t i a n a b e n t h a m i a n a.T h e r e s u l t s i n d i-c a t e d t h a t t h ea c c u m u l a t i o no fC P R N A w a ss i g n i f i c a n t l y r e d u c e da f t e r i n s e r t i n g f o r e i g n g e n e f r a g m e n t s.T h e C P R N A c o n t e n t s o f r e c o m b i n a n t v i r u s e s C MV F2092b61a a-g f p100,C M-V F2092b61a a-g f p200,a n d C MV F2092b61a a-g f p350c a r r y i n g d i f f e r e n t l e n g t ho fG F Ps e q u e n c e s w e r e a b o u t10t i m e sh i g h e r t h a nt h a to fC MV F209ә2b-g f p350c a r r y i n g t h eo p t i m a l l e n g t ho f G F P s e q u e n c e,a n d t h e y a l s o d i d n o t c a u s e o b v i o u s v i r u s s y m p t o m s.T h e r e f o r e,C M-V F2092b61a a i sm o r e s u i t a b l e a s a n e f f i c i e n tV I G S v e c t o r t h a nC MV-F209ә2b,a n d i t s o p t i m a l f r a g m e n t l e n g t ho f i n s e r t i o nh a s b e e n p r e l i m i n a r i l y d e t e r m i n e d t ob e200~350n t.K e y w o r d s:v i r u s-i n d u c e d g e n e s i l e n c i n g;c u c u m b e rm o s a i c v i r u s;2b;v i r u s c o n t e n t病毒诱导的基因沉默(V i r u s-i n d u c e dG e n eS i l e n c i n g,V I G S)是指携带目的基因片段的病毒侵染植物后在植物体内产生d s R N A,被宿主的R N A干扰(R N A i n t e r f e r e n c e,R N A i)体系将携带有植物基因片段的重组病毒的转录产物降解为21~30n t的s i R N A s,然后s i R N A s靶向降解与其序列同源的植物内源靶基因的转录产物,瞬间下调靶基因的表达,从而使植物在2~3周内快速出现功能缺失表型[1].它是一种转录后水平的基因沉默现象,病毒介导的基因沉默技术与转基因介导的基因沉默技术因其双链R N A来源不同而作为R N A干扰(R N A i)技术的两个分支存在.这种方法操作简便㊁快速㊁有效,适用于进行高通量操作,所以V I G S成为进行大规模靶基因功能筛选的重要研究工具,尤其对于那些难以进行转基因的物种.研究发现,至少有50多种来自不同科属的病毒能作为各种模式植物和一些农作物的V I G S载体[2].黄瓜花叶病毒(C u c u m b e rM o s a i cV i r u s,C MV)是一种球形的二十面体病毒,直径为28~ 30n m,存在于细胞的细胞质和细胞核中[3].黄瓜花叶病毒属于雀麦花叶病毒科㊁黄瓜花叶病毒属的一个典型成员.它可以感染1200多种植物,是自然界分布最广㊁宿主最多的植物病毒之一[4].黄瓜花叶病毒是三分体病毒类型,其遗传信息库包括有3条正单链(R N A1㊁R N A2和R N A3),可合成1a蛋白㊁2a蛋白㊁3a蛋白㊁外壳蛋白(C o a t P r o t e i n,C P)等;2b蛋白翻译自亚基因组R N A4A,参与病毒细胞间移动㊁R N A沉默的抑制及对抗植物体S A诱导的抗性,也与病毒症状的产生密切相关[5].2b蛋白是C MV最小的蛋白,只有约110个氨基酸,它是最早被称为病毒R N A沉默抑制子(V i r a lS u p p r e s s o ro fR N A S i l e n c i n g,V S R)的病毒蛋白,其N端61个氨基酸就是抑制活性部位,对于结合s i R N A双链是必需的[6-7].目前C MV病毒载体的研究都已将C MV的R N A s1㊁2和3的全长c D N A片段分别连入p C B301等植物表达载体双35S 启动子的下游,构建C MV侵染性克隆,该侵染性克隆可以通过农杆菌浸润的方法接种至植物,造成系统侵染[8].C MV V I G S载体的构建主要是对R N A2进行改造,去掉部分或全部2b基因序列,引入终止密码子和M C S,由于改造过程中,2b蛋白遭到破坏,降低了其对R N A沉默的抑制,使其更适合于病毒诱导基因沉默[9-10].姚敏等[8]的研究表明,2b缺失突变体C MV-F n yΔ2b在本氏烟上虽然早期有微弱的曲叶症状,但中后期无任何症状,R T-P C R检测表明F n y2b缺失突变体可系统侵染本氏烟,这与D i n g等[11]早期报道2b 缺失后能够系统侵染普通烟相一致.2b 基因缺失后,C MV -F n yΔ2b 能系统性侵染寄主植物,但病毒基因组R N A 大大降低[12].程晓东等[10]用C MV 不同株系的R N A 2与C MV -F n y 基因组R 1和R 3进行组合接种,获得在本氏烟中症状轻的病毒组合F 1T s h R 2F 3,T s h R 2的2b 基因缺失3'端的95n t 碱基(T s h 2V I G S )后病毒能系统性侵染寄主植物,但降低病毒外壳蛋白(C o a t P r o t e i n ,C P )含量.2b 基因完全缺失也有可能影响C MV V I G S 载体在一些植物上的复制和系统移动,导致无侵染性,所以报道的C MV 载体一般保留了2b 蛋白的N 端60~94个氨基酸序列[9].也有观点认为,保留的2b 序列内含R N A 沉默抑制子活性的功能域,有可能会影响病毒诱导的基因沉默[9].向志丹等[13]的研究发现,基于沉默的效率和稳定性,完全缺失2b 基因的载体C MV -F n yΔ2b 的最适插入片段是350n t 左右.本试验分析了C MV -F n y Δ2b 载体插入350b p 的g f p 外源基因片段,以及C MV -F 2092b 61a a 载体分别插入100b p ㊁200b p 和350b p 的g f p 外源基因片段,其病毒外壳蛋白R N A 水平的变化,及诱导产生的病毒症状的变化.1 材料与方法1.1 试验试剂限制性内切酶㊁T a q P C R 酶㊁P y r o b e s t D N A 聚合酶㊁M -M L V 反转录酶(R N a s e H -)㊁重组R N a s e 抑制剂㊁T 4D N A 连接酶购于宝日医生物技术(北京)有限公司;D N A 清洁回收试剂盒㊁D N A 凝胶回收试剂盒㊁质粒提取试剂盒购于爱思进生物技术(杭州)有限公司;2ˑq P C RM i x (S Y B R G r e e n Ⅰ)㊁引物购于北京擎科生物科技股份有限公司;T r i z o l 试剂购于赛默飞世尔科技(中国)有限公司;其他试剂购于生工生物工程(上海)股份有限公司.1.2 寄主植物本氏烟幼苗于25ħ㊁16h 光照/8h 黑暗的植物培养室中培养,生长至5~7叶期接种病毒.1.3 质粒及其构建C MV F n y 基因组R N A 1-3的侵染性克隆(p C B 301-C MV F 109,p C B 301-C MV F 209和p C B 301-C MV F 309)和2b 基因缺失质粒p C B 301-C MV F 209ә2b -M C S 由浙江理工大学赠与.p C B 301-F 2092b 61a a -M C S 是以质粒p C B 301-F 209ә2b -M C S 为基础构建的.以本实验室已有的p C B 301-C MV F 209质粒为模板,采用引物2b N c o I F 2和2b 61a a M l u R 通过P C R 扩增2b 61a a 的D N A 序列片段,大小为750b p 左右,p C B 301-C MV F 209ә2b -M C S 质粒用N c o I 和M l u I 双酶切后,切下570b p 左右片段后,约7400b p 载体片段与同样经过酶切的PC R 产物连接,获得pC B 301-C MV F 2092b 61a a -M C S 质粒.为了构建含不同长度的g f p 基因片段的重组质粒,采用不同的下游引物与G F P 350M l u F 组合,P C R 扩增获得100b p ,200b p 和350b p 的g f p 基因片段.经M l u I 和B a mHI 酶切,克隆至预先经M l u I /B a mHI 酶切的p C B 301-C MV F 209ә2b -M C S 和p C B 301-C MV F 2092b 61a a -M C S质粒,构建产生重组质粒p C B 301-C MV F 209ә2b -g f p 350,p C B 301-C MV F 2092b 61a a -g f p 100,p C B 301-C MV F 2092b 61a a -g f p 200和p C B 301-C MV F 2092b 61a a -g f p 350.所有重组质粒均测序正确,C MV 载体构建过程见图1.32第6期 吴娟,等:黄瓜花叶病毒基因沉默载体的病毒含量和症状分析图1 C MV 载体构建示意图1.4 农杆菌浸润接种病毒p C B 301-C M V F 109~F 309,p C B 301-C M V F 209ә2b -M C S ,p C B 301-C M V F 2092b 61a a -M C S ,p C B 301-C M V F 209ә2b -g f p 350,p C B 301-C M V F 2092b 61a a -g f p 100,p C B 301-C M V F 2092b 61a a -g f p 200和p C B 301-F 2092b 61a a -g f p 350质粒采用冻融法转入农杆菌GV 3101中,农杆菌浸润接种本氏烟参考张斯(2014)的方法,农杆菌G V 3101(p C B 301-C MV F 109)㊁G V 3101(p C B 301-C MV F 209,p C B 301-C MV F 209ә2b -M C S 等)和G V 3101(pC B 301-C MV F 309)等比例混合,用无针头注射器浸润接种于6~7叶龄本氏烟中间叶位相对的两叶片,接种后的本氏烟25ħ黑暗处理24h 后,继续25ħ㊁16h 光照/8h 黑暗温室培养.1.5 q R T -P C R 分析接种烟草C MVC P 基因m R N A 含量提取C M V ,C M V F 209ә2b -M C S ,C M V F 209ә2b -g f p 350,C M V F 2092b 61a a -M C S ,C M V F 2092b 61a a -g f p 100,C M V F 2092b 61a a -g f p 200和C M V F 2092b 61a a -g f p 350侵染本氏烟相同叶位系统叶的总R N A ,并用R N a s e -F r e eD N a s e 消化以除去D N A.总R N A 经n a n o d r o p 初步定量和1ˑTB E 琼脂糖电泳进行质量检测.以本氏烟A c t i n 为内参基因,C MV C P 基因特异的q R T -P C R 引物为F 309C P q F 2和F 309C P q R 2,具体引物序列见表1.总R N A 用M -M L V 反转录酶进行反转录,q R T -P C R 按照试剂盒的说明书进行.C P 基因的m R N A 相对表达水平通过2-ΔC t 法计算获得.表1 引物信息引物名称引物序列(5'~3')用途2b N c o I F 2C A T G C C A T G G C T G A G T T T G C C T G p C B 301-C MV F 2092b 61a a -M C S 质粒构建2b 61a a M l u RA C T C C G C C A C G T T C A C A T G A T C C A C T T G A T A G A A C G G T A G G F P M l u F C G A C G C G T G A G C T G A A G G G C A T C G A C T g f p 片段克隆共用正向引物G F P 350B a mH RC G G G A T C C T T A C T T G T A C A G C T C G T C C A T g f p 350克隆G F P 200B a mH R C G G G A T C C T C G C C G A T G G G G G T G T T C g f p 200克隆G F P 100B a mH RC G G G A T C C T C T T C T G C T T G T C G G C C A T G g f p 100克隆F 309C P q F 1G A A G C T T G T T T C G C G C A T T C q R T -P C R F 309C P qR 1C A C C T A T A T C A G C G C G C A T C q R T -P C R N b A c t i n F 1C C A C A T G C C A T T C T C C G T C T q R T -P C R N b A c t i n R 1T C C C T G A C A A T T T C C C G C T C qR T -P C R 42植物医学 h t t p ://x b b jb .s w u .e d u .c n 第2卷1.6 数据处理与统计学分析本研究所收集数据采用S P S S26.0软件进行分析.2 结果与分析2.1 C MVF n y 及重组病毒在本氏烟上的症状反应将C M VF n y RN A 2进行改造后,只表达2b 基因N 端61个氨基酸的病毒C M V F 2092b 61a a 在接种后的本氏烟上的病毒症状反应与C MV F n y 相比轻很多,植株无严重矮化和叶片卷曲症状,只是幼叶呈现浓绿与淡绿不均匀的斑驳即轻花叶症状,而完全缺失2b 基因的病毒C M -V F 209ә2b 则无明显病毒症状(图2).携带100b p ~350b p 的外源基因片段的重组病毒C M -V F 2092b 61a a -g f p 100,C MV F 2092b 61a a -g f p 200,C MV F 2092b 61a a -g f p 350和C MV F 209ә2b -g f p 350都不表现明显病毒症状反应(表2).图2 本氏烟接种病毒或缓冲液(M o c k )15d 的症状表2 C MVF n y 及重组病毒在本氏烟上的症状反应病毒本氏烟症状C MVF n y 植株严重矮化和叶片卷曲C MV F 2092b 61a a轻花叶C MV F 209ә2b 无明显病毒症状C MV F 209ә2b -g f p 350无明显病毒症状C MV F 2092b 61a a -g f p 100无明显病毒症状C MV F 2092b 61a a -g f p 200无明显病毒症状C MV F 2092b 61a a -g f p 350无明显病毒症状2.2 病毒在本氏烟上的含量分析为了分析改造后的C MV V I G S 载体C MV F 209ә2b ,C MV F 2092b 61a a 和携带外源基因片段的重组病毒是否会影响病毒基因组含量,将100n t ~350n t 不等的外源基因片段插入改造后的C MV V I G S 载体,并将C MVF n y ㊁改造后的病毒载体及重组病毒C MV F 2092b 61a a -g f p 100,C MV F 2092b 61a a -g f p 200,C MV F 2092b 61a a -g f p 350和C MV F 209ә2b -g f p 350通过农杆菌浸润法接52第6期 吴娟,等:黄瓜花叶病毒基因沉默载体的病毒含量和症状分析种本氏烟.在接种后15d ,通过荧光定量P C R 方法,对成功接种的本氏烟相同叶位的上部系统叶(非顶部叶片)中的C MVC P 基因m R N A 水平进行相对定量.结果如图3所示,与野生型病毒C M VF n y 相比,改造后的病毒C M V F 2092b 61a aC P 基因表达量下降了52%,而C M V F 209ә2b 下降96%;与C M V F 2092b 61a a 相比,插入外源基因片段的重组病毒2b 61a a -g f p 100,2b 61a a -g f p 200和2b 61a a -g f p 350分别下降了90%,32%和78%.已有报道C MV F 209ә2b 作为基因沉默载体,最适插入片段为350n t 左右,而装载350n t 片段后C P 基因表达量下降了66%.C P 基因的表达量代表了病毒基因组R N A 水平,以上结果说明,作为基因沉默载体,C MV F 2092b 61a a 比C MV F 209ә2b 在本氏烟上病毒含量高10倍以上,且装载外源基因片段的2b 61a a -g f p 350和2b 61a a -g f p 200其病毒量也是C M V F 209ә2b -g f p 350的10倍以上.由于C M V F 2092b 61a a 装载100~350n t 不等的外源基因片段后,在本氏烟上也不表现明显病毒症状,但其具有更高的表达量,将会产生更高的沉默效率,所以比C MV F 209ә2b 更适合作为基因沉默载体,且本研究初步发现它的最适插入片段是200n t 左右.图3 q R T -P C R 分析病毒侵染烟草中C P m R N A 含量3 结论与讨论病毒诱导基因沉默(V I G S )已经成为一种常用的基因功能研究工具,大约有50多种病毒能用于植物的基因沉默.其中,烟草脆裂病毒(T o b a c c oR a t t l eV i r u s ,T R V )㊁马铃薯X 病毒(P o -t a t oV i r u sX ,P V X )㊁苹果潜隐球形病毒(A p p l eL a t e n t S ph e r i c a lV i r u s ,A L S V )等已经建立起了稳定的用于双子叶植物基因沉默的体系.但是,在单子叶植物中,V I G S 的应用还是非常有限.黄瓜花叶病毒属于雀麦花叶病毒科㊁黄瓜花叶病毒属的一个典型成员.它可以感染1000多种植物,因此是分布最广㊁宿主最多的植物病毒之一.C MV -F n y 属于C MV 中S u b g r o u p Ⅰ,是强致病性的株系.本研究将C MV -F n y 接种于本氏烟,7d 后植株开始呈现叶片蜷曲㊁皱缩的症状,随后症状还有加重的趋势,15d 后植株还明显矮化.以植物病毒作为V I G S 载体,首先该病毒载体在寄主植物上引发的症状反应要轻微,以免引发的严重症状干扰目标基因沉默后植株表型.对C MV -F n y R N A 2进行改造后,2b 基因完全缺失的载体C MV F 209ә2b 在本氏烟上不表现明显病毒症状,保留2b 基因N 端61个氨基酸的载体C MV F 2092b 61a a 虽然表现一定的病毒症状,62植物医学 h t t p ://x b b jb .s w u .e d u .c n 第2卷但插入100~350n t 不等的外源基因g f p 片段后,也都不表现明显病毒症状.由于缺失基因沉默抑制子2b 蛋白,C MV F 209ә2b 能系统侵染本氏烟,但影响病毒C P 含量,病毒基因组含量显著降低,而C MV F 2092b 61a a 的病毒基因组C PR N A 含量高很多,这可能与2b 蛋白其抑制活性位于其N 端61氨基酸有关.虽然装载外源基因片段后,病毒C P 含量都明显降低,重组病毒C MV F 2092b 61a a -g f p 100,C MV F 2092b 61a a -g f p 200和C MV F 2092b 61a a -g f p 350均比装载最适长度的C MV F 209ә2b -g f p 350高很多,且同样不引发明显病毒症状.作为高效的V I G S 载体,不仅在寄主植物上引发的病毒症状轻微,且病毒表达含量高.所以,C MV F 2092b 61a a 更适合作为高效的V I G S 载体,且它的最适插入片段是200~350n t .参考文献:[1]郭惠珊,高峰,赵建华,等.发展基因沉默技术,控制作物土传真菌病害[J ].中国科学院院刊,2017,32(8):822-829.[2] A B R A HAM I A NP ,HAMMO N DR W ,HAMMO N DJ .P l a n tV i r u s -D e r i v e dV e c t o r s :A p p l i c a t i o n s i nA gr i c u l -t u r a l a n d M e d i c a l B i o t e c h n o l o g y [J ].A n n u a lR e v i e wo fV i r o l o g y 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吴娟,等:黄瓜花叶病毒基因沉默载体的病毒含量和症状分析。
草铵膦bar基因
草铵膦bar基因
草铵膦（Bar）基因是一种转基因技术中常用的抗除草剂基因。
Bar基因来自于感染苯妥英酮细菌（Streptomyces hygroscopicus）的质粒，它编码了一种称为PAT （phosphinothricin acetyltransferase）的酶。
这种酶能够催化的
成分是光气磺异氟草酰胺（glufosinate）和植物细胞的谷氨酸，使之之间发生酰基转移反应。
转基因作物携带着Bar基因后，能够耐受抗草剂光气磺异氟草酰胺，在农作物生长中不受抗草剂的伤害，从而提高了作物的产量和质量。
草铵膦（Bar）基因常用于转基因作物的遗传改良中，其中最
常见的转基因作物是抗除草剂转基因作物。
使用抗除草剂转基因技术可以在播种后喷洒抗草剂，消除除了抗草剂外的其他野草和杂草，不对转基因作物造成伤害。
这种转基因技术能够提高农作物的产量，降低对环境和人类健康的影响，并减少农药的使用量。
然而，使用草铵膦（Bar）基因的转基因作物也引
起一些争议，因为部分人认为这种技术会带来环境和健康风险。
因此，对于转基因作物的安全性和可持续性问题，科学界和政府机构都需要进行充分的研究和监管。
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(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610256085.9(22)申请日 2016.04.22(66)本国优先权数据201510193571.6 2015.04.22 CN(71)申请人 湖南人文科技学院地址 417000 湖南省娄底市娄星区氐星路487号(72)发明人 竺锡武 彭日民 王强 张媛媛 吴娟 (74)专利代理机构 杭州中成专利事务所有限公司 33212代理人 金祺(51)Int.Cl.C12N 15/83(2006.01)C12N 15/84(2006.01)A01H 5/00(2006.01)
(54)发明名称弱毒力CMV载体表达抗性基因增强植物抗除草剂性能的应用(57)摘要本发明公开了一种黄瓜花叶病毒弱毒力载体表达抗除草剂基因在增强植物抗除草剂性能方面的应用。黄瓜花叶病毒弱毒力载体的构建方法包括如下步骤：1)、改造病毒CMV成缺失2b基因序列的弱病毒表达载体；具体为：将已构建好的病毒CMV侵染性克隆质粒之一pCB-CMVF209采用酶切连接的方法改造，使2b基因缺失，并加入酶切位点，构建成为弱毒力的病毒表达载体---弱病毒载体；2)、将抗除草剂基因编码区(ORF)序列插入步骤1)所得的弱病毒载体构建重组病毒表达载体；构建所得的含抗除草剂基因编码区序列的重组弱病毒表达载体用于增强植物对除草剂的抗性。
权利要求书2页 说明书13页序列表1页 附图1页
CN 105925603 A2016.09.07
CN 105925603 A1.黄瓜花叶病毒弱毒力载体表达抗除草剂基因在增强植物抗除草剂性能方面的应用。2.根据权利要求1所述的黄瓜花叶病毒弱毒力载体在增强植物抗除草剂性能方面的应用，其特征是：所述黄瓜花叶病毒弱毒力载体的构建方法包括如下步骤：1)、改造病毒CMV成缺失2b基因序列的弱病毒表达载体；具体为：将已构建好的病毒CMV侵染性克隆质粒之一pCB-CMVF209采用酶切连接的方法改造，使2b基因缺失，并加入酶切位点，构建成为弱毒力的病毒表达载体---弱病毒载体；2)、将抗除草剂基因编码区(ORF)序列插入步骤1)所得的弱病毒载体构建重组病毒表达载体；构建所得的含抗除草剂基因编码区序列的重组弱病毒表达载体用于增强植物对除草剂的抗性。3.根据权利要求2所述的黄瓜花叶病毒弱毒力载体在增强植物抗除草剂性能方面的应用，其特征是：所述步骤1)中的酶切位点为：Stu I、Mlu I、Spe I、Apa I、BamH I、Sac II。4.根据权利要求2或3所述的黄瓜花叶病毒弱毒力载体在增强植物抗除草剂性能方面的应用，其特征是：所述步骤1)具体包括如下步骤：①、以CMV序列为模板，设计加酶切位点的正、反向引物；加酶切位点Nco I的正向引物NcoIF2:CATGCcatggctgagtttgcctg；加酶切位点Stu I的反向引物2aORF1R为以下任一：gaAGGCCTTCTAaattctttcgctgtttgttgg；gaAGGCCTTCTAaattctttcgctgtttgttg；以质粒pCB-CMVF209为模板，PCR扩增合成PCR产物，纯化，以Nco I、Stu I酶切PCR产物，纯化，备用。②选择Stu I以及Mlu I、Spe I、Apa I、BamH I、Sac II中至少1个酶切位点加入正向引物的5’；设计在5’加入Avr II酶切位点的反向引物；所述正向引物：GAAGGCCTGACGCGTGACTAGTgggcccGGGATCCccgcggAACctccccttccgcatct(为2bORF333F)；或由GAAGGCCT与序列GACGCGTGACTAGTgggcccGGGATCCccgcgg中的至少1个酶切位点的序列与序列AACctccccttccgcatct组成；所述反向引物为AvrIIR:Cttccgaagaaacctaggag；以质粒pCB-CMVF209为模板，PCR扩增合成PCR产物，纯化，以Stu I、Avr II酶切PCR产物，纯化；③以Nco I、Avr II酶切质粒pCB-CMVF209；④、采用T4-DNA连接酶试剂盒将酶切的PCR产物与酶切的质粒产物连接，转化大肠杆菌感受态DH5a；⑤、在上述转化培养长出菌落的平板内挑选菌落再液体培养，提取质粒，采用Nco I、Avr II酶切鉴定和PCR鉴定，得到构建正确的质粒pCB-CMVF209-no2b。5.根据权利要求2或3所述的黄瓜花叶病毒弱毒力载体在增强植物抗除草剂性能方面的应用，其特征是：
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2CN 105925603 A所述步骤2)具体包括如下步骤：①、以抗除草剂基因编码区(ORF)序列为基础，设计加酶切位点Stu I或Mlu I或Spe I或Apa I或BamH I的正向引物，加酶切位点Mlu I或Spe I或Apa I或BamH I或Sac II的反向引物；以含目的基因的质粒为模板，PCR扩增目的基因，纯化，以正、反向引物所加酶切位点的酶酶切PCR产物，纯化；②、以与上述步骤①相同的酶酶切质粒pCB-CMVF209-no2b；③、采用T4-DNA连接酶试剂盒将酶切的PCR产物与酶切的质粒产物连接，转化大肠杆菌感受态DH5a；④、在上述转化培养长出菌落的平板内挑选菌落再液体培养，提取质粒，采用上述步骤①相同的酶酶切鉴定，并采用上述步骤①相同的引物进行PCR鉴定，最后测序鉴定，得到构建正确的含目的抗性基因的质粒pCB-CMVF209no2b-gene。
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3CN 105925603 A弱毒力CMV载体表达抗性基因增强植物抗除草剂性能的应用技术领域[0001]本发明涉及病毒载体的用途，特别是黄瓜花叶病毒弱毒力载体在增强植物抗除草
剂性能方面的应用。
背景技术[0002]现有研究开发的植物病毒载体可分为三种用途：一是主要用于表达药用蛋白、抗
体等；二是用于分析或利用外源基因功能；三是用于病毒诱导的基因沉默分析被沉默基因的功能。在病毒载体用于外源蛋白表达的研究方面，早期研究开发病毒载体的目的主要用于外源蛋白表达。利用植物病毒载体表达外源基因的方法主要有两种：一是在体外转录携带目的基因的侵染性cDNA克隆,将病毒基因组cDNA进行基因取代、插入融合等[14],外源基因被加入后，便置于原核启动子下游，然后以其转录物RNA直接侵染植物或者用基因枪的方法将病毒载体转入植物中完成侵染，接种植物后病毒在寄主细胞内自主增殖进行外源基因的表达[15]；二是将侵染性病毒的基因组cDNA克隆插入到Act2、CaMV35S转录启动子等下游构建携带目的基因的侵染性重组病毒体,采用农杆菌转化法浸润接种植物,从而在寄主细胞内完成一系列转录、合成及装配过程，实现外源基因的表达过程。Marillonnet等在前人的基础上建立了农杆菌浸润接种技术，便使得病毒载体用于外源蛋白表达达到了一个令人满意的水平，使外源蛋白的表达又踏上了一个新台阶[16]。至今用于表达药用蛋白的主要病毒载体及表达的药用蛋白或抗原如下[17-18]：豇豆花叶病毒(cowpea mosaic virus，CPMV)表达的口蹄疫病毒(FMDV)VP1抗原、人免疫缺陷病毒(HIV-1)gp41抗原、人鼻病毒(HRV-14)抗原、犬细小病毒(CPV)抗原、慢性肺炎病菌(Pseudom aeruginosa)外层腊蛋白F抗原、stahylococcus aureus D2domain肽、疟疾抗原、水貂肠炎病毒(MEV)抗原、对传染性肠胃炎病毒(TGEV)具有特异性小分子免疫蛋白(SIP)、乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)。TMV载体表达的有血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)、流感病毒血凝素、人免疫缺损病毒(HIV-1)抗原、疟疾抗原、鼠带状疮疹ZP3糖蛋白、口蹄疫病毒(FMDV)VP1抗原、α-天花粉蛋白、38C13鼠B细胞淋巴瘤单链抗体、肠癌病毒单抗、口蹄疫病毒(FMDV)VP1、牛孢疹病毒I型(BHV-1)gDC、猪传染性腹泻病毒(PEDV)中和表位；TBSV表达的人免疫缺损病毒(HIV-1)V3环抗原、犬细小病毒(CPV)抗原；PVX载体表达的有人免疫缺损病毒(HIV-1)gp41抗原、轮状病毒VP6抗原、人类乳突病毒16(HPV-16)E7蛋白抗原、人乳铁蛋白N叶、人粒细胞巨噬细胞集落剌激因子(GM-CSF)、肺结核抗原ESAT-6；ALMV载体表达的有呼吸道合胞病毒(RSV)G蛋白抗原；PPV病毒载体表达的兔出血热病毒(RHDV)VP60抗原；三叶草黄脉病毒Clover yellow vein virus(ClYVV)载体表达可溶性甲烷单加氧酶C亚单位(sMMO-C)；CMV载体表达的aFGF蛋白等。在病毒载体用于分析或利用外源基因功能方面，植物病毒载体除了用于表达疫苗抗原、抗体和药用蛋白生产外，还可用于表达外源基因，分析基因功能，分析外源蛋白与植物中蛋白质的相互作用。例如，含番茄叶霉病菌avr9无毒基因的PVX重组表达载体通过农杆菌浸润接种带有抗病(R)基因cf-9的番茄植株叶，番茄植株会发生过敏反应，表明R基因表达的产物可与avr9基因产物发生了直接的相互作用[18]。植物病毒载体也可用于植物利用外源基因的功
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