牛血清白蛋白和溶菌酶为双模板蛋白质的表面印迹聚合物的制备及吸附性能

・４７６・　色　谱　第３３卷　分子印迹技术…是制备空间结构和结合位点　与模板分子完全匹配的聚合物的技术，通过模板分　子与具有官能团的功能单体相互作用，在交联剂的　存在下引发聚合，形成大孔、网状的聚合物，进而除　去模板，在聚合物中形成与模板分子空间匹配的具　有多重作用位点的印迹孔穴，得到分子印迹聚合物　（ＭＩＰ）。在大多数情况下，分子印迹聚合物的特异　性识别位点是通过一种模板分子而产生的　，然　而分子印迹聚合物的制备过程却可以不局限于使用　单一的模板分子，可以实现同时印迹多种组分　。　Ｓｒｅｅｎｉｖａｓａｎ等　制备了水杨酸和氢化可的松为模　板分子的印迹聚合物，该聚合物对两种模板均呈现　出选择性结合。不久，该研究小组又制备了具有类　似效果的以胆固醇、睾酮和氢化可的松为模板的三　重模板印迹聚合物¨　。Ｄｉｃｋｅｒｔ等　在制备两种　模板同时印迹的交联聚氨酯薄膜时，提出了“双重　分子印迹（ｄｏｕｂｌｅ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｉｍｐｒｉｎｔｉｎｇ）”的概念。　多模板印迹的优点在于可以同时提取、分离、分析和　检测同一样本中多种目标分析物，而单一印迹聚合　物则主要对一种模板分子具有选择性识别能力。这　些关于双／多模板印迹的报道主要集中在小分子印　迹聚合物上，由于生物大分子蛋白质具有庞大的分　子体积、复杂多变的构象及对环境非常敏感等特点，　制成蛋白质印迹　’”　的难度较大，而制成双蛋白质　印迹聚合物的难度就更大了，也更鲜有了。　目前对蛋白质印迹多采用表面印迹法，在开发　新的印迹方法如光接枝聚合法　”　或引入新的印　迹功能单体如丙烯酰基　一环糊精时　，文献中多使　用溶菌酶（Ｌｙｚ）做模板蛋白质。Ｌｙｚ（１３．４　ｋＤａ，ｐＩ　ｌ１．２）的相对分子质量较小，它广泛存在蛋清、泪　液、唾液及其他体液中，是肺结核、真菌脑膜炎等各　种疾病诊断的重要指标。而牛血清白蛋白（ＢＳＡ，　６６．０　ｋＤａ，ｐＩ　４．９）是牛血清中的主要成分，主要用　于生化及医药研究，相对分子质量较大，对大蛋白质　的印迹过程中，通常用到除氢键之外的蛋白质与单　体间其他较强的相互作用　，或直接将较大蛋白质　共价接枝到载体基质表面来实现成功印迹　。　原子转移自由基聚合法（ＡＴＲＰ）是一种可控的　自由基活性聚合反应　，与传统的自由基聚合反应　相比，ＡＴＲＰ的反应条件温和，无需加热和紫外光　照，室温下可在水介质中发生反应，能够避免不均匀　反应等逆向反应和溶胶凝胶现象，适于蛋白质的分　子印迹。本文在以往工作　’　的基础上，采用ＡＴＲＰ　法，以两种相对分子质量和等电点差异较大的蛋白　质——ＢＳＡ和Ｌｙｚ作为模板蛋白质，制备了双模板　蛋白质表面印迹的聚合物（Ｂｉ—ＭＩＰ），考察了Ｂｉ—ＭＩＰ　制备过程中辅助功能单体的加入量对模板蛋白质　ＢＳＡ和Ｌｙｚ印迹效果的影响，通过静态吸附实验，　对Ｂｉ－ＭＩＰ吸附双模板蛋白质的吸附性能进行了　研究。　

１　实验部分　１．１仪器与试剂　日本岛津高效液相色谱仪（ＨＰＬＣ）（ＬＣ一２０Ａ）。　Ｌｙｚ和ＢＳＡ（Ａｍｒｅｓｃｏ公司）；牛血清样品（广　州鑫特生物制品有限公司）；鸡蛋清样品由新鲜鸡　蛋在冷冻离心机中以ｌ０　０００　ｒ／ｍｉｎ离心３０　ｍｉｎ的　上清液得到，冷冻保存备用。　Ⅳ－异丙基丙烯酰胺（ＮＩＰＡＡｍ）（Ａｃｒｏｓ　Ｏｒｇａｎ—　ｉｃｓ公司）；丙烯酰胺（ＡＡｍ）和Ⅳ，Ⅳ　一亚甲基双丙烯　酰胺（ＭＢＡＡ）（Ｓｉｇｍａ—Ａｌｄｒｉｃｈ公司）；Ｎ－（３一二甲氨　基丙基）甲基丙烯酰胺（ＤＭＡＰＭＡ）（日本东京化成　工业株式会社）；Ｎ，Ｎ，Ｎ　，Ｎ　，Ⅳ　一五甲基二乙烯基　三胺（ＰＭＤＥＴＡ）（Ａｌｆａ　Ａｅｓａｒ公司）；ＣｕＣＩ（氮气保　护下在乙酸中进一步提纯，北京市精细化学品有限　公司）；三氟乙酸（化学纯，北京化工厂）；乙腈（色谱　纯，Ｆｉｓｈｅｒ　Ｃｈｅｍ　Ａｌｅｒｔ公司）；四氢呋喃和三乙胺　（北京北化精细化学品有限公司）；２－溴代异丁酰溴　（北京偶合科技有限公司）；以上试剂除有特别说明　外均为分析纯，实验用水均为二次蒸馏水。　１．２双模板蛋白质表面印迹聚合物的制备　据文献　’　，用水热法制备Ｆｅ　Ｏ　粒子，接着采　用溶胶凝胶法对Ｆｅ　０　粒子包覆硅层，得到Ｆｅ　Ｏ　＠ＳｉＯ　。将Ｆｅ，Ｏ　＠ＳｉＯ：分散在四氢呋喃和三乙胺　的混合溶液中，在冰浴中对该体系反复抽真空和充　高纯氮气３次，再逐滴加入２一溴代异丁酰溴，氮气保　护下，室温震荡反应１２　ｈ。反应结束后，洗涤干燥　产物，得到引发剂修饰的Ｆｅ　Ｏ　纳米粒子（Ｆｅ　Ｏ　＠　ｉｎｉｔｉａｔｏｒ）。　采用ＡＴＲＰ法，在Ｆｅ　０　＠ｉｎｉｔｉａｔｏｒ表面得到辅　助功能单体ＤＭＡＰＭＡ加入量不同的Ｂｉ—ＭＩＰ和非　印迹聚合物（ＮＩＰ），模板蛋白质和单体的量见表１。　图１为ＡＴＲＰ法制备Ｂｉ—ＭＩＰ的示意图。具体　制备方法以Ｂｉ—ＭＩＰ一２为例：在１００　ｍＬ的三颈圆底　烧瓶中加入０．２　ｇ　Ｆｅ，Ｏ　＠ｉｎｉｔｉａｔｏｒ，将其分散在２０　ｍＬ　０．０１　ｍｏｌ／Ｌ磷酸缓冲溶液（ＰＢＳ，ｐＨ　７．０）中，　加入０．４０　ｇ单体ＮＩＰＡＡｍ，０．０１　ｇ单体ＡＡｍ，１０　Ｌ辅助单体ＤＭＡＰＭＡ，０．００５　３　ｇ交联剂ＭＢＡＡ，　０．０５　ｇ模板蛋白质ＢＳＡ，０．０ｌ　ｇ模板蛋白质Ｌｙｚ和　３０　Ｌ　ＰＭＤＥＴＡ，在振荡器上预聚合１２　ｈ。然后，对　・４７８・　色　谱　第３３卷　Ｑ＝（Ｃ。一Ｃ　）Ｖ／ｍ　（１）　式中，Ｃ。为初始蛋白质的质量浓度（ｍｇ／ｍＬ），Ｃ　为吸附之后的最终蛋白质的质量浓度（ｍｇ／ｍＬ），Ｖ　是蛋白质溶液的体积（ｍＬ），ｍ是聚合物的质量　（ｇ）。　

２结果与讨论　本文主要考察双模板蛋白质表面印迹聚合物的　吸附性能，对该印迹聚合物的分析表征将在其他工　作中考察。　２．１碱性单体浓度不同的印迹聚合物对模板蛋白　质的吸附　碱性单体ＤＭＡＰＭＡ有助于酸性大的蛋白质　ＢＳＡ的印迹　。在ｐＨ　７．０的印迹聚合物的制备溶　液中，功能单体ＮＩＰＡＡｍ和ＡＡｍ通过氢键作用排　列到模板蛋白质ＢＳＡ和Ｌｙｚ周围，此时碱性单体　ＤＭＡＰＭＡ与Ｌｙｚ均带正电荷，存在斥力，而带正电　的碱性单体ＤＭＡＰＭＡ通过静电引力都自组装到带　负电荷的ＢＳＡ表面。之后，制备溶液发生原子转移　自由基聚合反应得到双模板蛋白质印迹聚合物，该　印迹聚合物经模板洗脱、干燥后，形成了与模板　ＢＳＡ的形状、氢键和离子问相互作用互补的ＢＳＡ印　迹孑Ｌ穴及与模板Ｌｙｚ的形状和氢键作用互补的Ｌｙｚ　印迹孔穴。其中碱性单体ＤＭＡＰＭＡ的量直接关系　到能否同时印迹ＢＳＡ和Ｌｙｚ，并影响制备得到的印　迹聚合物对ＢＳＡ和Ｌｙｚ的选择性。　２．１．１　对模板蛋白质ＢＳＡ的吸附　图２为碱性辅助单体ＤＭＡＰＭＡ加入量不同时　制备的双模板蛋白质表面印迹的聚合物对模板蛋白　质ＢＳＡ的吸附容量图。当碱性单体的量从０　Ｌ增　加到３０　Ｌ时，Ｂｉ—ＭＩＰ对ＢＳＡ的吸附容量随着碱　性单体加入量的增加而增加。印迹聚合物的制备过　３０　

２５　

—２０　１　５　ｌ０　５　Ｏ　

口Ｂｉ．ＭＩＰ　＋　ＮＩＰ　

厂±］　ｌ　０　ｕＬ　ｌ０　２０　３０　Ｖｏｌｕｍｅ　ｏｆ　ＤＭＡＰＭＡ　

图２碱性单体加入量对Ｂｉ－ＭＩＰ吸附模板　蛋白质ＢＳＡ的影响（ｎ＝３）　Ｆｉｇ．２　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｍｏｎｏｍｅｒ　ｖｏｌｕｍｅ　ｏｎ　ｔｅｍｐｌａｔｅ　ＢＳＡ　ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ　ｃａｐａｃｉｔｙ　ｏｆ　Ｂｉ－ＭＩＰ（ｎ＝３）　

程中碱性单体的量越多，其与ＢＳＡ之间的静电作用　越强，吸附容量越大。但由表２可知，Ｂｉ—ＭＩＰ对　ＢＳＡ的选择性（　）随着碱性单体的量的增加先　增大后减小。这是因为适量的碱性单体与模板蛋白　质之间形成的稳定配合物，有利于印迹过程中模板　蛋白质印迹孔穴的形成；当碱性单体量超过一定值　时，形成的印迹聚合物与模板蛋白质之间表现为较　强的静电吸附，掩盖了印迹聚合物对模板蛋白质之　间的印迹作用，表现为印迹聚合物的选择性降低。　因此，碱性单体ＤＭＡＰＭＡ量为２０　Ｌ时制备得到　的Ｂｉ—ＭＩＰ一３，对模板蛋白质ＢＳＡ有较好的吸附容量　和选择性。　２．１．２　对模板蛋白质Ｌｙｚ的吸附　图３为碱性单体ＤＭＡＰＭＡ加入量不同时制备　的双模板蛋白质表面印迹的聚合物对模板蛋白质　Ｌｙｚ的吸附容量图。当碱性单体量从０　Ｌ增加到　３０　Ｌ时，Ｂｉ・ＭＩＰ对Ｌｙｚ的吸附容量随着碱性单体　加入量的增加而减小。制备印迹聚合物过程中所用　碱性单体量越多，其与Ｌｙｚ之间的静电斥力越强，吸　附容量越小。由表２可知，Ｂｉ—ＭＩＰ对Ｌｙｚ的选择性　（　）随着碱性单体量的增加而减小。当碱性单　体量达到３０　Ｌ时，Ｂｉ—ＭＩＰ一４对Ｌｙｚ无印迹作用，可　能因为高浓度的碱性单体使制备过程中与其带相同　

图３碱性单体加入量对Ｂｉ－ＭＩＰ吸附模板　蛋白质Ｌｙｚ的影响（ｎ＝３）　Ｆｉｇ．３　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｍｏｎｏｍｅｒ　ｖｏｌｕｍｅ　ｏｎ　ｔｅｍｐｌａｔｅ　Ｌｙｚ　ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ　ｃａｐａｃｉｔｙ　ｏｆ　Ｂｉ－ＭＩＰ（ｎ＝３）　

表２不同碱性单体ＤＭＡＰＭＡ加入量制备的Ｂｉ－ＭＩＰ的选择性　Ｔａｂｌｅ　２　Ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　Ｂｉ—ＭＩＰ　ｐｒｅｐａｒｅｄ　ｂｙ　ｕｓｉｎｇ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｖｏｌｕｍｅｓ　ｏｆ　ｍｏｎｏｍｅｒ　ＤＭＡＰＭＡ　

Ｑｉｍｐｎｎｔｅｄ／Ｑ…一ｐ　ｒＩｎｔｅｄ　Ｑ　ｐｎｎｔｅｄ　ａｎｄ　Ｑ　一ｐｎｎｔｅｄ　ｗｅｒｅ　ｔｈｅ　ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ　ｃａｐａｃｉｔｙ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎ　Ｂｉ—ＭＩＰ　ａｎｄ　ＮＩＰ，　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｓ　ｄｅｎｏｔｅｄ　ａ　ｓｉｎｇｌｅ　ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ；ｍ　ｄｅ—　ｎｏｔｅｄ　ａ　ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ　ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ．