荧光分光光度法 (Fluorescence Spectrophotometry)

荧光分光光度法(Fluorescence Spectrophotometry)

前言：

•1852年，斯托克斯（Stokes）发现萤石在暗处受到光的照射会发出一种蓝白色的光，他把这种光命名为“荧光”。

•1868年Goppelstroeder发表了利用Al-桑色素绿色荧光来分析微量Al的分析方法，可见荧光分析是一种历史悠久的分析方法。

时至今日，荧光分析在方法上取得了极大的进展。促进了诸如：时间分辨、相分辨、荧光偏振、荧光免疫、同步荧光等荧光分析新方法的发展，同时促使各种各样新型荧光分析仪器的出现。

在仪器化方面，微机控制的全自动荧

光分析仪具有灵敏度高（比紫外-可见分光光度法高2~3个数量级）、选择性好、工作曲线线性范围宽，且能提供激发光谱、发射光谱、发光强度、发光寿命、量子产率、偏振和各向异性诸多信息等优点，已成为一种重要的痕量分析技术。

在生物、医学、医药、环境和石油工

业等诸多领域，荧光分析法都有广泛的应用。不仅能直接和间接地分析众多的有机化合物，而且利用与有机试剂间的反应还能进行许多无机元素的测定。

随着科技的发展进步，荧光这种光致

发光（photoluminescence）的本质进一步被揭开：

•物质除了受紫外-可见光照射后会发出紫外和可见（UV-Vis）荧光之外，受其它各种不同波长光的照射后，同样也有发光现象。例如：X-荧光、红外荧光等。

•除了吸收光能使分子激发而发光，根据起

始激发形成的方式，可以将荧光同其它的发光类型（例如：生物发光、热发光、化学发光和摩擦发光）区别开来。

•通过化学反应使分子受激而发光称为“化学发光”。利用化学发光进行分析工作叫“化学发光分析”。

•化学发光分析、荧光分析和磷光分析统称

为“分子发光分析(molecular luminescence)”。

•荧光和磷光同属光致发光。通过测定发光的强度可以定量测定许多痕量的无机物和有机物。

•相对于磷光和化学发光而言，目前荧光法的应用较多。

本章主要讨论荧光分析。

3.1 分子荧光产生的本质（Molecular Fluorescence）

图3-1 吸收光谱和荧光光谱能级跃迁示意图

1.产生荧光的原因

荧光物质的分子吸收了特征频率的光能后，由基态跃迁到能级较高的第一电子激发态或第二电子激发态，然后通过无辐射跃迁返回到第一电子激发态的最低振动能级上，再从该能级降落至基态的各个不同的振动能级上，同时放出相应能量的分子荧光，最后以无辐射形式回到基态的最低振动能级。

需要注意的是：

（1）整个过程是在单线态之间进行的；（2）产生荧光的过程极快，约在10-8秒左右内完成；

（3）荧光的产生是由第一电子激发态的最低振动能级开始，而与荧光分子被激发至哪一个能级无关。因此，荧光光谱的形状和激发光的波长无关。

2. 磷光(Phosphorescence)

当某些物质分子被激发到较高的能级，并通过无辐射跃迁降落至第一电子激发态的最低振动能级之后，尚不能继续直接降落至基态，而是通过另一次无辐射跃迁降至一个中间的亚稳态能级—三重线态上，这些分子在三重线态上经短暂停留后，再降落至基态的各个不同的振动能级上，同时发出辐射光，称这种发出的辐射光为磷光。

磷光与荧光的区别主要为：

（1）产生磷光的过程稍长，约在10-5 秒~0.1秒，有时长达1秒以上；

（2）在辐射停止几秒或更长一段时间后，仍能检测到磷光，而上述荧光现象在照射光一旦停止照射，荧光便立即消失。

3. 迟滞荧光（延迟荧光）

某些分子在跃迁至三重线态之后，通过热激活作用，可以再回升至第一电子激发态的各振动能级上，然后再由第一电子激发态的最低振动能级（v=0）降落至基态的各个不同振动能级而发出荧光，这种光叫做迟滞荧光（或：延迟荧光）。

４. 分子吸收光谱与分子荧光光谱的关系分子吸收光谱和分子荧光光谱都是分子内部振动能级结构的反映，但是分子吸收光谱是反映电子激发态中各个振动能级结构情况。

在大多数分子中，由于电子激发态和电子基态的各个振动能级结构相似，因此吸收光谱和荧光光谱往往呈现大致的镜像对称关系。

3.2 荧光与物质分子结构之间的关系

１. 物质产生荧光的两个必须条件

物质的分子结构与荧光的发生及荧光强度的大小有着紧密有关。

•分子产生荧光必须具备两个条件：

（1）物质分子必须具有能吸收一定频率光的特征结构；

（2）物质分子在吸收了特征频率的辐射能之后，必须具有高的荧光率，即具有较高的荧光效率（f luorescence e fficiency）。

荧光效率（又称量子产率，记为 ）=发射荧光的量子数/吸收激发光的量子数

荧光效率愈大，荧光的发射强度愈大，无辐射跃迁几率就愈小。

当荧光效率等于零时就意味着不能发射荧光。因此，荧光物质必须具有较大的荧光效率。

２. 物质产生荧光与其分子结构的关系(1) 有机化合物的结构与分子荧光的关系

什么样结构的有机化合物会发出荧光？一般可以从以下三方面来分析：

a. 碳原子骨架

一般含有共扼体系的分子可产生荧光。共扼度越大，则离域 电子愈易被激发，愈易产生荧光。所以绝大多数荧光物质含有芳香环或杂环。

b. 分子的几何排布

物质的分子为平面型，且具有一定的刚性结构，这样的分子荧光强烈。

对于顺反异构体，顺式分子的两个基团在同一侧，由于位阻原因不能共平面，而没有荧光。

c. 芳环上取代基的类型和位置

(!) 类型

•有些取代基可增强荧光。

等；

例如：-OH、-NHR、-NR

2

•有些取代基可减弱荧光。

、-Cl、例如：-COOH、-C=O、-NO

2

-Br、-I等；

•有些取代基影响不明显。

例如：-F、-SH、-SO

H等。

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