慢病毒载体的设计及应用进展

　万方数据　万方数据７２中国生物工程杂志ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＶ０１．２６Ｎｏ．１１２００６

表达时间¨４｜。这些调控元件的发现为构建慢病毒载体，使目的基因在靶细胞中持续高效表达提供了依据。２．３提高转入基因的转录靶向性病毒载体携带的外源基因转入宿主细胞后是否能够表达还与启动外源基因的启动子及宿主细胞的类型均有关系，一般类型的慢病毒载体都选用管家基因的启动子来启动外源基因以保证其有效转录。研究者由此想到了应用靶细胞特异性表达基因的启动子作为载体外源基因的启动序列，从而使转入的外源基因只在特定类型的细胞中表达。有研究报道，利用星形胶质细胞的特异性表达蛋白ＧＦＡＰ的启动子构建的慢病毒载体在注入动物模型的受损脑区后，其携带的外源基因特异性地在星形胶质细胞中表达，并且外源基因的表达水平可以伴随内源性ＧＦＡＰ基因的激活而得到调节¨５｜。这一技术也被应用于生产不同组织特异性表达ＧＦＰ的转基因动物，其方法是利用含不同组织特异表达蛋白启动子的慢病毒载体转染胚胎细胞，如果胚胎发育成功，特定的组织细胞会呈ＧＦＰ阳性。应用组织特异性的启动子和增强子来驱动慢病毒载体中的外源基因能够使其在特定的组织细胞中表达，这一进展为慢病毒载体介导的基因靶向性治疗提供了理论基础。２．４加入可对外源基因进行转录调节的调控元件如何使慢病毒载体携带的外源基因根据机体的需要进行有效调节也是保证基因治疗的有效性和安全性的重要问题。目前应用最多、前景最好的是四环素调节系统，即ｔｅｔ－ｏｎ及ｔｅｔ－ｏｆｆ系统。这一系统是根据大肠埃希氏菌属ＴＮｌ０的四环素抗性操纵子的结构特点构建的，这一抗性操纵子包含一个四环素抑制蛋白（ＴｅｔＲ）、一个特异性的ＤＮＡ结合位点及四环素操纵序列（ＴｅｔＯ）。无四环素存在的条件下，ＴｅｔＲ呈二聚体状态并与ＴｅｔＯ结合。四环素（ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）或四环素类似物——强力霉素（ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ）可以与ＴｅｔＲ结合使其构象发生改变，从而导致ＴｅｔＲ与ＴｅｔＯ分离。后来发现，ＴｅｔＲ存在一种突变体结构，在这种突变体中决定ＴｅｔＲ空间构象的四个核心蛋白发生了突变，形成了一种反式的空间构象，即当ｄｏｘ存在时，ＴｅｔＲ呈二聚体结构结合于ＴｅｔＯ上阻碍了下游基因的转录。利用四环素原核操纵将单纯疱疹病毒的转录激活域（ＶＰｌ６）与ＴｅｔＲ或ＴｅｔＲ的突变体融合分别组成四环素反式激活因子（ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅａｃｔｉｖａｔｏｒ，ｔＴＡ）和ｒｔＴＡ（ｒｅｖｅｒｓｅｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｏｒ）１．１６Ｊ。为了在哺乳动物细胞中表达，研究者将ＣＭＶ启动子与ＴｅｔＯ重复序列融和，与ｔＴＡ结合构成了Ｔｅｔ．ｏｆｆ转录调节系统，与ｒｔＴＡ结合构成了ｔｅｔ－ｏｎ转录调节系统。由于ｔｅｔ．０ｆｆ系统需要长期给予强力霉素来维持外源基因的表达，这对于终身的基因治疗不是一个理想的选择。同时，ｔｅｔ．ｏｆｆ系统的诱导启动需要通过药理作用清除强力霉素，这一过程较ｔｅｔ－ｏｎ系统的诱导过程要缓慢。因此，ｔｅｔ．ｏｎ转录调节系统在目前基因治疗领域的应用更为广泛［１７ｌ。

图３四环素操纵子ｔｅｔ－ｏｎ和ｔｅｔ－ｏｆｆ结构模式图Ｆｉｇ．３Ｐｉｃｔｕｒｅｏｆｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅｏｎａｎｄｏｆｆｓｙｓｔｅｍ

目前应用的Ｔｅｔ－ｏｎ基因调节系统多分别构建于两个质粒中，其中一个含有由外源启动子驱动的ｒｔＴＡ，另一个质粒中含有ＴＲＥ及受其调控的外源基因。二者通过共同转染同一细胞来发挥ＴＲＥ和ｒｔＴＡ问的调控作用，这一过程需要通过两步筛选来完成，即首先筛选出成功转染ＴＲＥ的细胞群，再用含ｒｔＴＡ的质粒来转染ＴＲＥ阳性的细胞群，然后通过第二次的分筛筛选出二者都转染成功的细胞群。这一系统更适合于体外的实验，在在体实验中的可控性较差。有研究者正试图将二者构建于同一载体中。但是，Ｔｅｔ－ｏｎ系统不足之处在于背景效应的存在，所谓背景效应是指在四环素不存在的情况下，ｒｔＴＡ也会与ＴｅｔＯ结合，这种情况会导致受其调控的蛋白表达量的下降，这对于在低剂量水平发挥作用的蛋白表达更为不利，如生长因子类蛋白。针对这一问题，有些实验室正对ｒｔＴＡ作进一步的改进，如经过改建后的反式转录激活因子ｒｔＴＡ２ｓ．Ｍ２６，经过ＴｅｔＲ区的突变和遗传密码的优势选择，以及ＶＰｌ６区的激活域改建为含１２个氨基酸的重复序列，其特异性、稳定性、可调性都得到了很大提高。它可以在四环素浓度较最初的ｒｔＴＡ低１０倍的情况下发挥作用，在四环素不存在的情况下，没有背景效应的产生。并且外源基因的表达水平与四环素的浓度在一定范围内呈剂量依赖关系，即随着外源给予四环素浓度的增加，外源基因的表达量也会相应增加【ｌ８｜。因此，通过对ｒｔＴＡ的改

　万方数据２００６，２６（１１）王淑艳等：慢病毒载体的设计及应用进展７３建，对逆转录病毒载体中加入的外源基因表达水平可以进行准确的调节，使载体和外源基因的可控性更强，为慢病毒载体应用于临床打下了基础。最新型的四环素可调控系统与慢病毒载体相结合，使基因的条件性表达和基因敲除都成为可能，为探索基因的功能提供了有利的工具。Ｓｚｕｌｃ等¨９ｊ利用ＫＲＡＢ结构域（Ｋｒｕｐｐｅｌ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｂｏｘ）的结构和功能特点构建了一种新型的ＴＥＴ－ｏｎ／ｏｆｆ调控系统。接近三分之一的参与转录调控的锌指结构中包含ＫＲＡＢ结构域，当ＤＮＡ与锌指结构相互作用时，ＫＲＡＢ结构域环化成为多分子复合体，引发组蛋白的脱乙酰作用和甲基化，从而导致染色体的变构而抑制转录激活。ＫＲＡＢ结构域与ｔｅｔＲ结构相融合构成了转录激活抑制结构，研究者证实利用这种结构与四环素操纵子结构相互作用（图４）在体外细胞培养试验和在体试验中都能得到了更为严格的基因调控表达效果。３讨论与展望现阶段将目的基因导入靶细胞和组织的方法主要包括真核表达质粒的转染，和病毒载体介导的基因转移方法等。其中真核表达质粒的转染对于分裂增殖比较旺盛的体外培养细胞转染效果较好，但表达的目的基因常常随时间的延长而发生丢失。与真核表达质粒相比，病毒载体介导的基因转移可以整合入宿主的基因组中，具有更好的稳定性。最初研究的鼠干细胞病毒和后来的腺病毒载体在转染分裂增殖旺盛期的细胞时都取得了较好的效果，但对于分裂增殖缓慢和处于静息期的细胞基因转染的效果却不尽人意。慢病毒载体出现以后，先后在造血干细胞，胚胎干细胞，以及在体的神经胶质细胞，神经元的基因转移中都取得了成功。随着慢病毒载体的构建更加完善和基因组学蛋白质组学的进展，基因治疗成为一些疾病的最佳选择。而慢病毒载体的一些生物学特性使许多基因治疗的设想具备了可行性。由于慢病毒家族中的ＨＩＶ．１及其他类型的病毒对人类和动物有极大的危害性，因此慢病毒载体的生物安全性成为阻碍其应用的主要问题。第三代的慢病毒载体虽然已经进一步提高了载体系统的安全性，并且在以前的研究中并没有在载体生产过程中产生野生型病毒的报道。但要使慢病毒载体系统应用于临床，还需要从以下几个方面作出进一步的努力。首先在载体设计过程中应进一步缩短载体及包装质粒中的病毒编码序列，这样可以降低病毒基因重组的几率，但是载体中的包装信号和包装质粒中的ｇａｇ序列之间的重复不可能完全避免，因此有必要在生产过程中通过长期培养和ＰＣＲ技术对生产出来的病毒载体进行分析。另外在载体设计时应避免出现潜在的自杀基因，这类基因一旦被激活，会导致靶细胞的死亡。如果慢病毒载体真正应用于临床，那么机体的免疫系统会引发针对注入的病毒颗粒的免疫应答，这些病人就可能在ＨＩＶ抗原检测中呈阳性结果，导致诊断的混淆和病人心理上的压力。因此为进一步提高慢病毒载体的生物安全性，应在临床应用前对其进行多方面的安全检测和分析。通过以上的介绍，慢病毒载体是理想的真核细胞基因转移工具，通过对其结构和功能的进一步的完善，在科学研究中有着广泛的应用前景。慢病毒载体可以转化处于分裂静止期和分化终末状态的细胞，今后应用在一些可以通过基因治疗方式治愈的疾病的实验和临床研究中。比如一些神经系统疾病。在神经系统中，绝大多数的神经元和胶质细胞处于一个相对静止的时期，其它的逆转录病毒载体对于神经系统疾病的基因治疗显得无能为力，而实验证实，慢病毒载体无论是在体外细胞及组织培养实验中，还是在在体的基因治疗实验中，对神经元和胶质细胞都具有稳定的转染能力。因此，慢病毒载体为一些神经系统疾病的基因治疗带来了希望。近期的研究表明，由慢病毒载体系统介导的应用ＧＤＮＦ（胶质源性神经营养因子）对帕金森氏病进行基因治疗已经在灵长类和啮齿类动物实验中得到证实，由慢病毒载体介导的ＧＤＮＦ基因可以整合入移植部位细胞的基因组ＤＮＡ中，长期表达分泌，促进损伤部位的多巴胺能神经元的存活，突触延长，并能改善动物模型的行为学异常。随着慢病毒载体和一些基因调控元件的结合应用，可以对载体携带的外源基因进行基因表达调控的研究。这种组合会克服基因治疗过程中所遇到的一些问题，比如如何调控外源基因在靶细胞和组织中的表达水平，持续表达时间，以及如何将外源基因特异地导入某一类型的靶细胞中等等。目前，以四环素的原核操纵子结构为基础的药物调节系统已经被构建于慢病毒载体系统中，并迸一步提高了基因表达调控的敏感性，准确性和特异性。使这一系统成为基因的转录调控研究和基因治疗研究的重要工具。虽然慢病毒载体的设计进展为进行深入的基因表　万方数据７４中国生物工程杂志ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＶ０１．２６Ｎｏ．１ｌ

２｜Ｄ０１６

达研究带来了希望，但我们在实际的研究应用过程中还应该考虑到外源性载体转入对细胞及组织生物学特性的潜在影响。在改进载体结构的同时，还应该在体外细胞水平进行详细深入的探讨。如目前较为热点的干细胞治疗和基因治疗相结合的研究领域，不应该单纯追求外源基因表达后的一些正面的结果，还应该对慢病毒载体转化成功的干细胞进行单克隆培养取得生物学性质均一的细胞克隆，然后进行基因表形分析，在确保转化后干细胞的生物安全性后再迸行移植治疗。另外，慢病毒载体的另一应用热点是将其作为基因转移载体直接作用于病变组织局部，如帕金森氏病，脊髓侧索硬化，神经损伤等，虽然在动物实验中都取得了比较理想的结果，但大多数载体不能对病变细胞进行特异性的转化，因此在发挥治疗作用的同时也可能带来一些副作用，应该在今后的实验中得到重视。

参考文献［１］ＬｏｉｓＣ，ＨｏｎｇＥＪ，ＰｅａｓｅＳ，ｅｔａ１．Ｇｅｒｍｌｉｎｅｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎａｎｄｔｉｓｓｕｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｄｅｌｉｖｅｒｅｄｂｙｌｅｎｆｉｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２。２９５：８６８～８７２［２］ＰｆｅｉｆｅｒＡ，ＩｋａｗａＭ，ＤａｙｎＹ。ｅｔａ１．ＴｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓｂｙｌｅｎｆｉｆｉｒＭｖｅｃｔｏｒｓ：ＬａｃｋｏｆｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇｉｎｍａｍｍａｌｉａｎｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｅｅＵｓａｎｄｐｒｅｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎｅｍｂｒｙｏｓ．ＰｒｏｃＮａｄＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，２００２，９９：２１４０～２１４５，２９８８—２９９３［３］ＬＯｉＺ，ＢｒａｄｙＲＯ．Ｇｅｎｅｔｒａｎｓｆｅｒｉｎｔｏｔｈｅｃｅｎｔｒａｌｓｙｓｔｅｍｉｎｖｉｖｏｕｓｉｎｇｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓｖｅｃｔｏｒ．ＪＮｅｕｒｏｓｃｉＲｅｓ，２００２，６７：３６３～３７１［４］ＺｕｆｆｅｒｅｙＲ．Ｓｅｌｆ．ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓｖｅｃｔｏｒｆｏｒｓａｆｅａｎｄｅｆｆｉｃｉｅｎｔｉｎｖｉｖｏｇｅｎｅｄｅｌｉｖｅｒｙ．ＪＶｉｒａｌ，１９９８，７２：９８７３—９８８０［５］ＹｕＸ，ＺｈａｎＸ，ＣｈｅｎｇＬ，ｅｔａ１．Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒｓｗｉｔｈｔｗｏｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｉｎｔｅｒｎａｌｐｒｏｍｏｔｅｒｓｔｒａｎｓｆｅｒｈｉｇｈ－ｌｅｖｅｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｍｕｌｔｉｐｌｅｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｔｏｈｕｍａｎｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃｓｔｅｍ—ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌｓ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＴｈｅｒａｐｙ，２００３，７：８２７～８３８［６］ＺｕｆｆｅｒｅｙＲ，ＤｕｌｌＴ，ＭａｎｄｅｌＲＪ，ｅｔａ１．Ｓｅｌｆ．ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓｖｅｃｔｏｒｆｏｒｓａｆｅａｎｄｅｆｆｉｃｉｅｎｔ轨ｖｉｖｏｇｅｎｅｄｅｌｉｖｅｒｙ．ＪＶｉｒｏｌ，１９９８，７２：９８７３～９８８０［７］ＮａｋａｊｉｍａＴ，ＮａｋａｍａｒｕＫ，ＨａｓｅｇａｗａＭ，ｅｔａ１．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｎｏｖｅｌｓｉｍｉａｎｉｍｍｕｎｏｄｅｆｌｃｉｅｎｅｙｖｉｒｕｓｖｅｃｔｏｒｓｃａｒｒｙｉｎｇｄｕａｌｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍ．ＨｕｍＧｅｎｅＴｈｅｒ，２０００，１１：１８６３～１８７４［８］ＣｈａｎｇＬＪ，ＺａｉｓｓＡＫ．Ｓｅｌｆ－ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇｌｅｎｔｉｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒｓａｎｄｓｅｎｓｉｔｉｖｅｅｒｅ—ｌｏｘＰｒｅｐｏＡｅｒｓｙｓｔｅｍ．ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌＭｅｄ，２００３，７６：３６７～３８２［９］ＹｏｄｅｒＪＡ，ＷａｌｓｈＣＰ，ＢｅｓｔｏｒＴＨ．Ｃｙｔｏｓｉｎｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎａｎｄｔｈｅｅｃｏｌｏｇｙｏｆｉｎｔｒａｇｅｎｏｍｉｃｐａｒａｓｉｔｅｓ．ＴｒｅｎｄｓＧｅｎｅｔ，１９９７，１３：３３５～３４０［１０］ＰａｎｎｅＨＤ，ＯｓｂｏｒｎｅＣＳ，ＹａｏＳ，ｅｔａ１．Ｒｅｔｍｖｉｒｕｓｖｅｃｔｏｒｓｉｌｅｎｃｉｎｇｉｓｄｅｎｏｌｏｍｅｔｈｙｌａｓｅｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔａｎｄｍａｒｋｅｄｂｙｒｅｐｒｅｓｓｉｖｅｈｉｓｔｏｎｅｃｏｄｅ．ＥＭＢＯＪ，２０００，１９：５８８４～５８９４［１１］ＰａｎｎｅＨＤ，ＥｌｌｉｓＪ．Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇｏｆｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｆｏｒｄｅｓｉｇｎｏｆｒｅｔｒｏｖｉｍｓｖｅｃｔｏｒｓ．ＲｅｖＭｅｄＶｉｒｏｌ，２００１，ｔ１：２０５～２１７［１２］ＧｉｎｎＳＬ，ＦｌｅｍｉｎｇＪ，ＲｏｗｅＰＢ，ｅｔａ１．ＰｒｏｍｏｔｅｒｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｍｅｄｉａｔｅｄｂｙｔｈｅＵ３ｒｅｇｉｏｎｉｎｅａｒｌｙ－－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎＨＩＶ－·１·ｒｄｅｒｉｖｅｄｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓｖｅｃｔｏｒｓｃａｎｉｎｆｌｕｅｎｃｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｔｒａｎｓｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｃｅｌｌ·ｔｙｐｅａｎｄｓｐｅｃｉｅｓ—ｓｐｅｃｉｆｉｃｍａｎｎｅｒ．ＨｕｍＧｅｎｅＴｈｅｒ，２００３，１４：１】２７—１１３７［１３］ＭａｙＣ，ＲｉｖｅｌｌａＳ，ＣａｌｌｅｇａｒｉＪ，ｅｔａ１．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｈａｅｍｏｇｌｏｂｉｎ