GenePharma 慢病毒载体 140512
一种敲低PXYLP1基因表达的shRNA、慢病毒载体及其构建方法和应用[发明专利]
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(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202111535765.1(22)申请日 2021.12.15(71)申请人 徐州市中心医院地址 221000 江苏省徐州市解放路199号(72)发明人 孟箭 周霖 李欣然 顾徐嘉 陈霖 (74)专利代理机构 南京经纬专利商标代理有限公司 32200专利代理师 曹翠珍(51)Int.Cl.C12N 15/113(2010.01)C12N 15/867(2006.01)A61K 31/713(2006.01)A61P 1/02(2006.01)A61P 25/00(2006.01)(54)发明名称一种敲低PXYLP1基因表达的shRNA、慢病毒载体及其构建方法和应用(57)摘要本发明公开了一种敲低PXYLP1基因表达的shRNA、慢病毒载体及其构建方法和应用，通过RNA干扰靶点设计及双链DNA oligo制备，将双链DNA oligo与线性化的载体相连，将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞进行阳性克隆，构建短发夹RNA慢病毒载体，敲低TSCC内源性PXYLP1基因的表达，抑制了TSCC细胞的增殖能力，诱导了TSCC细胞的凋亡，从而抑制体内肿瘤生长。
权利要求书1页 说明书10页序列表1页 附图9页CN 114457075 A 2022.05.10C N 114457075A1.一种敲低PXYLP1基因表达的shRNA，其特征在于，所述shRNA包括DNA oligo的正链和反链，所述正链为序列表SEQ ID NO.1所示的碱基序列，所述反链为序列表SEQ ID NO.2所示的碱基序列，所述的正链和反链退火，形成带粘性末端的双链DNA：SEQ 1：5’‑CCGGCCCGGTAAGAAACCAGTATCTCTCGAGAGATACTGGTTTCTTACCGGGTTTTTG ‑3’SEQ 2：5’‑AATTCAAAAACCCGGTAAGAAACCAGTATCTCTCGAGAGATACTGGTTTCTTACCGGG ‑3’。
GenePharma 表达载体使用说明书
GenePharma 表达载体使用说明质粒及菌液说明1、GenePharma 所提供的过表达质粒为高纯度的DNA 粉末制品，经过真空冷冻干燥的质粒是呈薄膜状或粉末状附在离心管中，请适当离心(10000r/min 10~15s)后小心开启，以免飞扬丢失。
请根据实验需要的质粒浓度和质粒的总量加入适量的 ddH 2O (通常建议储存液浓度 500ng~1μg/μL ），合上管盖充分震荡使其溶解后可用于细胞转染及其他分子生物学实验。
粉末制品的 DNA 可长期保存（建议最好不要超过6个月），质粒溶解后建议在-20℃的环境中存贮，避免多次冻融处理。
2、甘油菌液为含有重组质粒的菌液的过夜培养物与甘油的混合物，甘油的终浓度为 20% 。
客户收到甘油菌液建议即刻活化（例如取50~100µL 到5m L 含有相应抗性(根据载体种类可以选择25~50μg/m L 卡那霉素或 50~100μg/m L 氨苄霉素）的 LB 培养基过夜活化（12~16h ），活化后的菌液与适量甘油混匀后于-80℃保存。
）3、重组质粒测序峰值图文件结果请参见附件报告中的.abl 文件。
测序序列文件参见与峰值图文件同名的.seq 文件。
测序结果比对文件参见参见附件报告中的.sqd 文件，还可见同名的.pdf 文件。
基因过表达实验设计在使用载体法针对某一基因进行过表达研究过程中，通常会遇到如下几个问题：实验对照组的确立、细胞转染条件的确定、基因表达效率的检测。
1.实验对照组的确立在一个完善的基因过表达实验设计中，必须考虑设立正确合理的实验对照组。
通常，这些对照组包括阴性对照、转染试剂对照。
阴性对照通常是用基因过表达选择的载体对应的空载体来作为对照。
2.细胞转染条件的确定使用DNA 载体转染细胞时，为了选择合适的转染方法和确定转染效率，通常采用报告基因来检测DNA 的导入情况。
最常用的报告基因是绿色荧光蛋白。
吉玛公司提供的过表达载体有一部分载体中包含绿色荧光蛋白(红色荧光蛋白)的表达框架，转入细胞后可以表达绿色荧光蛋白(红色荧光蛋白)，是用荧光显微镜或流式细胞仪可以很容易地确定转染效率；如果您所订购的载体中不含绿色荧光蛋白(红色荧光蛋白)的表达框架，您可以先使用可以表达绿色荧光蛋白(红色荧光蛋白)的表达载体来确定转染效率和转染条件，然后使用同样的条件来转染过表达质粒。
慢病毒载体介导的RNA干扰抑制PC12细胞MyD88基因的表达
解剖科学进展 Progress of Anatomical Sciences 2010 Mar,16(2):131~134慢病毒载体介导的RNA干扰抑制PC12细胞MyD88基因的表达*崔万鹏，刘晓湘，方秀斌（中国医科大学 基础医学院神经生物学教研室， 辽宁 沈阳 110001） 【摘要】 目的 研究慢病毒介导的RNA干扰对PC12细胞的转染效率和对MyD88基因的抑制效率。
方法 构建针对大鼠MyD88基因3个靶点的ShRNA慢病毒载体，PC12细胞按照不同的转染条件分为 正常组（DMEM完全培养液）、DMEM加入polybrene组、EN.iS（Enhance infection solution）组、EN.iS加入polybrene组。
荧光显微镜下观察不同组的转染效率，采用Real-time PCR和Western blot检测不同的靶点对MyD88的不同沉默效率。
结果 病8毒滴度为1 × 10 TU/ml，MOI为100时，PC12细胞在EN.iS组的转染效率最高，转染试剂polybrene对转染效率无明显影响，沉默效率最高的靶点是5'-CATAC GCAACCAGCAGAAA-3'。
结论 慢病毒介导的RNA干扰是一种高效的基因沉默手段，可以对PC12细胞中MyD88的功能进行长期的研究。
【关键词】 PC12细胞；慢病毒；RNA干扰；髓样分化因子初次应答基因88 【中图分类号】 Q189 【文献标识码】 A 【文章编号】 1006-2947（2010）02-0131-04Lentivirus mediated RNA interference knockdowns the expression of MyD88 in PC12 cells【Abstract】 Objective To investigate the transfection efficiency of lentivirus and silencing efficiency of MyD88 by lentivirus mediated RNA interference in PC12 cell line. Methods Recombinant lentivirus vectors with shRNA targeting rat myeloid differentiation primary response gene 88(MyD88) were constructed and transfected into pheochromocytoma cells (PC12) in vitro, the tranfection efficiency was observed under fluorescence microscope and the expression of MyD88 was 8determined by Real-time PCR and Western Blot respectively. Results The viral titer of lentivirus was 1×10 TU/ml and the MOI(multiplicity of infection) was 100, PC12 cells exhibited the highest transfection efficiency in enhanced infection solution(EN.iS), with no remarkable effect on the transfection efficiency in the presence of the transfection reagent polybrene. According to the result of Real-time PCR and Western Blot, the most efficient targeting sequence was 5'-CATAC GCAACCAGCAGAAA-3'. Conclusion Lentivirus mediated RNA interference is an effective means to silence gene expression in PC12 cells，which can generate stable transfected PC12 cell line with MyD88 expression knocking down.【Key words 】 Pc12 cell line; lentivirus; RNA interference; myeloid differentiation primary response gene88*CUI Wan-peng，LIU Xiao-xiang，FANG Xiu-bin （Department of Neurobiology, China Medical University, Liaoning Shenyang 110001 China）[1]Lentivirus 是逆转录病毒的一种，可将自身携带作用。
慢病毒载体构建原理
慢病毒载体构建原理
慢病毒载体是一种常用于基因转染和基因治疗研究的工具，其构建原理主要包括载体选择、基因插入、包装和转染等几个关键步骤。
下面将分别对这些步骤进行详细介绍。
首先，载体选择是慢病毒构建的第一步。
常用的慢病毒载体包括pLenti、pSico、pRetro等，这些载体通常具有较高的转染效率和稳定性。
在选择载体时，需要考虑载体的大小、复制能力、转染效率以及转染细胞类型等因素，以确保最终构建的慢病毒载体能够满足实验需求。
其次，基因插入是慢病毒构建的关键步骤之一。
一般来说，可以利用限制性内切酶切割载体，然后将待插入的基因片段与载体连接，形成重组载体。
在进行基因插入时，需要注意选择合适的限制性内切酶，控制酶切的时间和温度，以确保基因能够正确插入到载体中。
接下来是包装步骤。
包装是指将重组载体导入到包装细胞中，通过包装细胞的辅助，使其产生慢病毒颗粒。
常用的包装细胞包括293T细胞、HEK293细胞等。
在包装过程中，需要利用辅助载体，如
pMD2.G和psPAX2等，通过三质体共转染的方式，使包装细胞产生
慢病毒颗粒。
最后是转染步骤。
转染是将包装好的慢病毒颗粒导入到目标细
胞中，实现基因的转染。
在进行转染时，需要根据目标细胞的特性
选择合适的转染方法，如离体转染、体内转染等，以确保慢病毒能
够有效地转染目标细胞，并表达目标基因。
总的来说，慢病毒载体构建的原理涉及到载体选择、基因插入、包装和转染等关键步骤。
通过合理的实验设计和操作，可以构建出
稳定、高效的慢病毒载体，为基因转染和基因治疗研究提供有力的
工具支持。
小鼠miR-122重组慢病毒载体的构建和鉴定
ｃｐ Ｆ ｏＧ Ｐ感 染 的肝 前体细胞 中 ｍｉ．２ Ｒ １２表达 显著增强 。结论 【 关键词 】 ＭｉｒＲ Ａ一２ ； 体构建 ； ｃ Ｎ １２ 载 ｏ 慢病 毒
中图分 类号 ： ９ ７１ Ｑ ８． 文献标 识码 ： Ａ
成功构建 了小 鼠 ｍｉ １ ２重组慢病 Ｒ．２
毒． 并在 肝前体 细胞 中高 效表达 出 ｍ Ｒ １２ 为进行 ｍ Ｒ １２的功能 和机理奠定 了 良好 的基 础 。 ｉ 一２ ， ｉ 一２
邱 荣林 邓 小耿
【 要 】 目的 摘
机 制奠定 基础 。方 法
谢 平 李 治熹 唐 晶
构建携 带 ｍＲ １２ ｉ． 的重 组慢 病毒 表达 载体 ， ２ 为研究 ｍＲ １２的功 能和作 用 ｉ． ２ 从小 鼠基 因组 Ｄ Ａ采用 Ｐ Ｒ法 扩增 出 ｐｅｍ Ｒ １２基 因 ， Ｎ Ｃ ｒ— ｉ 一２ 测序 后克 隆至
慢病毒载体构建步骤
一、简介慢病毒(Lentivirus)载体是以HIV-1 (人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体。
区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。
慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。
该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。
目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi的研究中。
由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA半衰期短，体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。
采用事先在体外构建能够表达siRNA的载体，然后转移到细胞内转录siRNA的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。
慢病毒载体能够产生表达shRNA的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达shRNA，实现在多种类型的细胞和转基因小鼠中特异而稳定的基因表达的功能性沉默，为在原代的人和动物细胞组织中快速而高效地研究基因功能，以及产生特定基因表达降低的动物提供了可能性。
慢病毒作为siRNA的携带者，不但具备特异性地使基因表达沉默的能力，而且充分发挥了慢病毒载体自身所具备的优势，为基因功能的研究提供了更强有力的工具。
在所构建的siRNA表达载体中，是由RNA聚合酶III启动子来指导RNA合成的，这是因为RNA聚合酶HI有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA不会带poly A尾。
当RNA 聚合酶I遇到连续4个或5个T时，它指导的转录就会停止，在转录产物3’端形成1~4个U。
U6和H1 RNA启动子是两种RNA聚合酶H依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达〜21ntRNA和〜50ntRNA茎环结构(stem loop)。
在siRNA表达载体中，构成siRNA的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录然后两条链互补结合形成siRNA；也可由载体直接表达小发卡状RNA(small hairpin RNA, shRNA),载体包含位于RNA聚合酶I启动子和4〜5T转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有1~4个U 3 ’突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成siRNA。
吉玛慢病毒使用手册(genepharma)
量法
Vg/ml
滴度
和操作要求高 倍 2
TU/ml（估计）
GFP 荧光计数 FACS（流式细胞 TU/ml
感染滴度 经典方法，简单、-
法
计数）
重复性好
抗性克隆计 细胞克隆计数 TU/ml
感染滴度 克隆形成需约 2 周 低估 5~10 倍 3
数法
Dot-blot 法 RNA dot-blot RNA/ml
Lentivirus 表达时间较长，但在一般代谢较旺盛的细胞（如 293T， BHK21 等）上，病毒感染 24hrs 后可以观察到 GFP 荧光；代谢比较缓慢 的细胞（如原代培养细胞，神经干细胞，胚胎干细胞等）GFP 蛋白表达 时间较长，感染后 72-96hrs 甚至更长时间才可以观察到 GFP 荧光。感染 后的细胞可以连续培养一周，通过观察 GFP 的表达时间和表达强度来确 定 Lentivirus 对目的细胞的感染情况。感染后期请根据细胞生长的情况对 细胞进行及时换液和传代，以保证细胞良好的生长状态。
生物安全
1、安全性 （1）删除了全部 HIV-1 的编码基因，在介导目的基因的表达时，没有任 何 HIV-1 蛋白的表达； （2）对 5’和 3’ LTR 分别进行了删除改造，5’LTR 缺失 U3，换上 RSV enhancer/promoter，使载体的复制不再依赖 Tat；3’LTR 删除 U3，使其不 再具有启动/增强活性，成为自灭活（self-inactivating, SIN）载体； （3）病毒包装必需的 3 个蛋白 Gag/Pol、Rev、VSV-G（代替 HIV-1 的 Env）分别独立放置在 3 个质粒上（pGag/Pol、pRev、pVSV-G），且互相 之间没有任何同源序列，大大降低了复制型慢病毒（RCL）的产生几率； （4）与 MuLV 等逆转录病毒载体相比，慢病毒载体的整合更偏向于宿主 细胞基因组的基因表达活跃区，激活沉默的原癌基因的几率可能比逆转 录病毒载体低； （5）慢病毒载体未发现有致肿瘤活性，全世界有 4 千万人感染了 HIV-1，
慢病毒载体的构建
慢病毒载体的构建一．构建原理：慢病毒属于逆转录病毒科, 但其基因组结构复杂, 除gag 、po l 和env 这3 个和单纯逆转录病毒相似的结构基因外, 还包括4 个辅助基因, vif 、vp r 、 nef 、vpu 和2 个调节基因tat 和rev 。
H IV 21 是慢病毒中最具特征性的病毒, 第一个慢病毒载体系统即以此病毒为基础进行构建的。
慢病毒载体的构建原理就是将H IV 21 基因组中的顺式作用元件(如包装信号、长末端重复序列) 和编码反式作用蛋白的序列进行分离。
载体系统包括包装成分和载体成分: 包装成分由H IV 21 基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建, 能反式提供产生病毒颗粒所需的蛋白; 载体成分与包装成分互补, 含有包装、逆转录和整合所需的H IV 21 顺式作用序列。
同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。
为降低两种成分同源重组产生有复制能力的病毒(RCV ) 的可能性, 将包装成分的5′ L TR 换成巨细胞病毒(CMV ) 立即早期启动子, 3′ L TR 换成SV 40 po lyA 位点等。
将包装成分分别构建在两个质粒上, 即一个表达gag 和po l 、另一个表达env 。
二．实验操作举例：一）磷酸钙法转染HEK293T 细胞1. 试剂配制:无菌水ddw: 高温灭菌; 分装;2XHBS: 280mM NaCl10mM KCl1.5 mM Na2HPO412 mM glucose50 mM HEPESAdjust the pH , every 0.05pH from 7.00 to 7.45 using 10N NaOH, then add ddw. to the final volume. 过滤灭菌,分装;2M CaCl2: 过滤灭菌,分装.2. 实验过程:1. 铺细胞: 选择状态良好的293T 细胞传代, 2-3x105个细胞/35mm dish.2. 20-24h 后,待细胞长至铺满瓶底约50-70%的时候,进行转染.下面就35mm dish 为例,采用以下转染体系:ddw: 105ulplasmid: 2 ug (如0.5ug/ul, 即用4ul)2M CaCl2: 16.5ul2XHBS: 125ul按上述顺序,往eppendorf管中依次加入上述四种试剂.先将前三者混匀,最后加2XHBS.一种方法是,加2XHBS时要逐滴加入,吹打至微现乳白色,立即均匀滴入培养皿,轻轻摇匀后置于培养箱中,6-8h后换液.另一种方法是,加入2XHBS后立即吹打约40下(不过这个要根据每个人的力道和吹打的频率而定,建议做一个梯度实验,吹打不同的次数看哪次的转染效率高以后就按这个次数来吹打),之后步骤同上,立即均匀滴入培养皿,轻轻摇匀后置于培养箱中,6-8h后换液.二）转染方法2-Fugene转染病毒包装1．传293T细胞，将T75用明胶包被，每瓶T75加1.5-2mL明胶，置于37度培养箱10min。
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9
LV9 穿梭质粒
10
LV10 穿梭质粒
11
LV11 穿梭质粒
5'LTR Amp
RRE pUC ori
LV11
8.3Kb
CMV
Eco RI (2804) Xho I (281 0) Spe I (281 6) Xba I (2822) Not I (2829) BamHI (2836)
3'LTR IRES WPRE NEO
HIV-1 3 LTR
LV14
9580 bp
WPRE EF-1a
Not I (3932)
Luciferase17 CMV
Nsi I (3964) Avr II (3969) BamHI (3978)
6
LV6 穿梭质粒
Amp CMV HIV-1 5 LTR HIV-1 psi pack RRE HIV-1 3 LTR
LV6
8527 bp
WPRE EF-1a Puromycin CMV
Sph I (3798) Not I (3932) Nsi I (3964) Avr II (3969) Bam HI (3978)
HIV-1 3 LTR
RRE
LV13
91 00 bp
WPRE EF-1a Puromycin T2A Luciferase05 CMV
Sph I (3798) Not I (3932) Nsi I (3964) Avr II (3969) BamHI (3978)
Amp
CMV HIV-1 5 LTR HIV-1 psi pack RRE
8
LV8 穿梭质粒
Amp CMV HIV-1 5 LTR HIV-1 psi pack HIV-1 3 LTR RREຫໍສະໝຸດ LV89262 bp
WPRE EF-1a Puromycin T2A RFP CMV
Sph I (3798) Not I (3932) Nsi I (3964) Avr II (3969) Bam HI (3978)
慢病毒相关载体：
编号 LV1 LV2 LV3 LV4 LV5 LV6 LV7 LV8 LV9 LV10 LV11 LV12 LV13 LV14
启动子 U6 U6 H1 EF-1a EF-1a EF-1a EF-1a EF-1a U6 U6 CMV u6 EF-1a EF-1a
荧光标签 GFP -GFP GFP GFP -RFP RFP RFP RFP -luci05 luci05 luci17
7
LV7 穿梭质粒
Amp
CMV HIV-1 5 LTR HIV-1 psi pack RRE
HIV-1 3 LTR
LV7
861 1 bp
WPRE EF-1a RFP CMV
Sph I (3798) Not I (3932) Nsi I (3964) Avr II (3969) Bam HI (3978)
Amp
CMV HIV-1 5 LTR HIV-1 psi pack
HIV-1 3 LTR
LV12
8087 bp
RRE
WPRE Puromycin T2A Luciferase05 CMV
U6
Hpa I (2936) Xho I (2951 )
Amp
CMV HIV-1 5 LTR HIV-1 psi pack
Amp
CMV HIV-1 5 LTR HIV-1 psi pack
HIV-1 3 LTR
RRE
LV5
9337 bp
WPRE EF-1a Puromycin T2A GFP CMV
Sph I (3798) Not I (3932) Nsi I (3964) Avr II (3969) Bam HI (3978)
Amp CMV HIV-1 5 LTR HIV-1 psi pack
RRE HIV-1 3 LTR
LV4
8663 bp
WPRE EF-1a
Sph I (3798)
GFP CMV
Not I (3932) Nsi I (3964) Avr II (3969) Bam HI (3978)
5
LV5 穿梭质粒
真核核抗性 -Puro Puro -Puro Puro -Puro -Puro Neo Puro Puro --
原核抗性 Amp Amp Amp Amp Amp Amp Amp Amp Amp Amp Amp Amp Amp Amp
1
LV1 穿梭质粒
2
LV2 穿梭质粒
3
LV3 穿梭质粒
4
LV4 穿梭质粒