清心开窍方含药脑脊液对过氧化氢(H2O2)所致PC12细胞损伤的保护作用_朱未名
基于网络药理学和分子对接法的益智清心方治疗阿尔茨海默病作用机制探索
·基础研究·基于网络药理学和分子对接法的益智清心方治疗阿尔茨海默病作用机制探索△刘佳妮1，2，刘剑刚1，3，韦云1，3*，罗增刚3，4*，李浩1，31.中国中医科学院西苑医院，北京100091；2.中国中医科学院研究生院，北京100700；3.中国中医科学院西苑医院老年病研究所，北京100091；4.北京市中医药管理局，北京100053［摘要］目的：运用网络药理学及分子对接方法探讨益智清心方（YZQXF）对阿尔茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）的作用靶点，构建活性成分-靶点-通路网络并分析其作用信号通路，探讨其对AD的防治作用及可能的分子机制。
方法：根据YZQXF药味组成，在中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）检索各药材的有效化学成分及各成分相应的作用靶点；利用GeneCard、OMIM、PharmGKB、TTD、DrugBank数据库搜索AD相关靶点，同时将药物靶点及疾病靶点数据进行比对，获得交集靶点，上传STRING11.5数据库对其进行蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析并找到核心靶点；通过Cytoscape3.7.1构建YZQXF治疗AD的活性成分-作用靶点-通路网络；借助BioConductor软件的R语言包对作用靶点进行基因本体（GO）注释和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析；最后将核心基因分别与关键靶标进行分子对接，验证YZQXF关键成分与核心靶点的作用特征。
结果：YZQXF中共有43个化学成分作用于2871个AD相关靶点，共存在129个化学成分-靶点相互作用关系。
YZQXF治疗AD的关键成分包括槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、四氢小檗碱、豆甾醇、原阿片碱、杨梅酮、氧代小檗碱、巴马汀、马卡因、小檗碱，核心靶点为丝裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、Myc、Fos、MAPK14、Jun、核转录因子-κB p65（RELA）、蛋白激酶B1（Akt1）、MAPK8、白细胞介素-1β（IL-1B）、肿瘤蛋白p53（TP53）。
藁本内酯抑制氧糖剥夺再灌注损伤神经元凋亡的机制
藁本内酯抑制氧糖剥夺再灌注损伤神经元凋亡的机制来自中国医科大学附属盛京医院的毕国荣团队最新研究发现，在体外培养PC12细胞模拟神经细胞氧糖剥夺再灌注损伤的模型中，自噬激活可以抑制氧糖剥夺再灌注诱导的细胞凋亡。
藁本内酯是当归、川芎等传统中药的主要有效成分之一。
在氧糖剥夺再灌注诱导的PC12细胞凋亡中，藁本内酯可通过激活自噬抑制凋亡起到细胞保护作用。
缺血性脑血管疾病具有高致残率和高致死率的特点。
目前针对缺血的标准治疗是快速实现再灌注，但是，缺血再灌注损伤会加重组织损伤。
因此，需要针对缺血再灌注损伤探索新的靶分子进而开展新的治疗策略。
自噬是细胞在应激情况下所做出的一种非损伤性应答反应。
当受到各种生理或病理刺激因子的作用时，自噬介导的降解反应对稳定细胞形态和结构，对维持细胞正常功能具有重要意义。
此外，自噬缺陷可导致细胞碎片不能被及时清除，继而诱导细胞凋亡。
既往研究证实，可通过阻止线粒体自噬发挥拮抗细胞凋亡的作用。
因此，以自噬调控作为潜在靶点对缺血脑血管疾病治疗具有重要意义。
此次，毕国荣等的实验发现，藁本内酯能够抑制氧糖剥夺再灌注诱导的PC12细胞凋亡。
首先发现，藁本内酯可以通过增加Bcl-2，抑制Bax表达抑制氧糖剥夺再灌注诱导的PC12细胞凋亡。
此外，藁本内酯的这种抗细胞凋亡保护作用，可被自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤抑制，说明藁本内酯可能通过调节自噬阴性细胞凋亡。
同时还发现藁本内酯可以上调自噬相关蛋白LC3-II以及p-LKB1和p-AMPK 的表达水平，并通过激活LKB1-AMPK-mTOR通路调节自噬，抑制凋亡发挥对氧糖剥夺再灌注诱导的细胞损伤保护作用，说明藁本内酯是治疗神经系统缺血再灌注损伤的潜在药物。
文章发表在《中国神经再生研究（英文版）》杂志2020年3期。
文章摘要：最近的研究证实自噬对脑损伤具有一定的保护作用，藁本内酯是一种从传统中药川芎中分离出来的生物活性物质，具有保护神经细胞的药理作用，但是藁本内酯的神经保护作用是否通过影响细胞自噬的机制而发挥，目前尚不清楚。
四逆汤水提物对缺氧-复氧损伤心肌细胞的保护作用
四逆汤水提物对缺氧-复氧损伤心肌细胞的保护作用杨兰;郝卫东;尚兰琴;林文翰【期刊名称】《中华中医药杂志》【年(卷),期】2005(20)6【摘要】目的:观察四逆汤水提物(Sinidecoction,SND)对培养乳鼠心肌细胞在缺氧复氧条件下的直接保护作用。
方法:动态采集并分析正常对照组、缺氧复氧组、四逆汤水提物8.0、17.9、40.0、89.4、200μg/ml给药组心肌细胞在缺氧前,缺氧30、60、90、120、150、180min以及复氧30min和60min细胞搏动频率及收缩面积的变化;比色法测定培养液中LDH;使用MTT法测定心肌细胞存活量。
结果:心肌细胞搏动频率及收缩幅度随着缺氧时间延长而逐渐降低,四逆汤水提物给药组(除8.0μg/ml组外)较缺氧复氧组搏动维持时间长,且200.0μg/ml组在复氧后能恢复搏动。
缺氧3h缺氧复氧组乳酸脱氢酶(LDH)漏出率较正常对照组升高(P<0.05);除8.0μg/ml组外,四逆汤水提物不同浓度组LDH漏出率较缺氧复氧组降低,存在浓度-效应关系。
复氧1h,各给药组LDH漏出率也较缺氧复氧组低。
缺氧复氧组与正常对照组比较,存活的心肌细胞减少(P<0.01);给药组心肌细胞存活量较高,呈浓度-效应关系。
结论:四逆汤水提物可延长缺氧状态下心肌细胞的搏动时间,减缓收缩力的衰减,减少细胞膜损伤及提高缺氧复氧心肌细胞的存活量,表现出对心肌细胞的直接保护作用。
【总页数】5页(P338-341)【关键词】保护作用;水提物;四逆汤;损伤心肌细胞;缺氧-复氧;浓度-效应关系;正常对照组;缺氧复氧;搏动频率;细胞存活;比色法测定;乳酸脱氢酶;缺氧状态下;细胞膜损伤;LDH;MTT法;时间延长;收缩幅度;不同浓度;细胞减少;药组;ml;培养液【作者】杨兰;郝卫东;尚兰琴;林文翰【作者单位】北京大学公共卫生学院毒理学系;天然药物及仿生药物国家重点实验室【正文语种】中文【中图分类】R285.5;R289.5【相关文献】1.丹参水提物对乳鼠心肌细胞缺氧-复氧损伤的保护作用 [J], 张东涛;黄伟哲;陈喜珊2.夏枯草提取物对缺氧/复氧诱导心肌细胞氧化应激损伤保护作用及抗凋亡的机制[J], 李锦绣;焦宪法;王红宇;郭宇红;赵云峰3.夏枯草提取物对缺氧/复氧诱导心肌细胞氧化应激损伤保护作用及抗凋亡的机制[J], 李锦绣;焦宪法;王红宇;郭宇红;赵云峰4.升陷汤及单味药材水提物对缺氧/复氧致心肌损伤的保护作用 [J], 金晓玲;陈岚;张凤;黄豆豆;廖丽娜;陈万生5.四逆汤类方提取物对乳鼠心肌细胞缺氧复氧损伤的保护作用 [J], 马天舒;葛迎春;刘平;贾玉红;任慧君;徐亚娟;徐东铭因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
人感染猪链球菌病诊疗方案
人感染猪链球菌病诊疗方案卫生部关于印发《人感染猪链球菌病诊疗方案》的通知卫医发[2006]461号各省、自治区、直辖市卫生厅局，新疆生产建设兵团卫生局:人感染猪链球菌病是由猪链球菌感染人而引起的人畜共患疾病，对人类健康造成严重威胁。
,,,,年，四川省发生了人感染猪链球菌病疫情，导致,,人死亡。
为了提高我国人感染猪链球菌病的诊疗水平，实现人感染猪链球菌病早期诊断、早期治疗，我部委托中华医学会组织编写了《人感染猪链球菌病诊疗方案》。
现印发给你们，以指导各地人感染猪链球菌病医疗救治工作。
二??六年十一月二十九日附件:人感染猪链球菌病诊疗方案人感染猪链球菌病是由猪链球菌(streptococcus suis)感染人而引起的人畜共患性疾病。
从事猪的屠宰及加工等人员为高危人群，本病主要通过皮肤的伤口而感染。
临床表现为发热、寒战、头痛、食欲下降等一般细菌感染症状，重症患者可合并中毒性休克综合征(toxic shock syndrome, TSS)和链球菌脑膜炎综合征(streptococcusmeningitis syndrome, SMS)。
1968年丹麦学者首次报道了3例人感染猪链球菌导致脑膜炎并发败血症病例，1975年荷兰也出现了散发病例的报道。
此后，中国香港、英国、加拿大、德国、法国、美国、澳大利亚、比利时、巴西、西班牙、日本、泰国、瑞典及中国内地陆续有人感染猪链球菌病的报道。
截至2000年，全球已报道了200多例人感染猪链球菌病病例，报道病例较多的国家或地区普遍养殖业发达或有食用猪肉的习惯，病例呈高度散发态势。
在我国，1998年江苏省报告了人感染猪链球菌病，发病25例，死亡14例;2005年6月至8月，四川省发生的人感染猪链球菌病爆发疫情，为国内外迄今为止见于报道的最大规模人感染猪链球菌病疫情，发病数204例，死亡38例。
【病原学】猪链球菌属链球菌(streptococcus)科，革兰染色阳性，呈球形或卵圆形。
中风醒脑液SD大鼠含药血清对体外培养神经细胞缺血再灌注损伤保护作用的实验研究_李艳青
中风醒脑液SD 大鼠含药血清对体外培养神经细胞缺血再灌注损伤保护作用的实验研究李艳青1，张晓云2（1.成都中医药大学，四川成都610075；2.成都中医药大学附属医院，四川成都610072）摘要：目的：探讨中药复方中风醒脑液SD 大鼠含药血清对体外培养的神经细胞缺血再灌注损伤的保护作用，为进一步开展临床研究提供依据。
方法：采用血清药理学和原代神经细胞培养的方法，用SD 大鼠的含中风醒脑液血清体外培养PC －12神经细胞，用连二亚硫酸钠造成细胞缺氧损伤模型，用H 2O 2造成细胞氧化损伤模型，建立缺血再灌注的体外细胞模型，分别在造模后2h 、4h 用alamarBlue 染色，用酶标仪测定吸光度，检测PC －12细胞的生长活力及应用流式细胞技术检测细胞的凋亡率。
结果：中药复方中风醒脑液SD 大鼠含药血清对体外培养的神经细胞缺血再灌注损伤具有保护作用。
结论：中风醒脑液是一种神经细胞保护剂，可以增加神经细胞存活率与活力，抑制其凋亡率。
关键词：中风醒脑液；缺血再灌注；实验研究中图分类号：R255．2文献标识码：B 文章编号：1000－1719（2011）10－2089－03收稿日期：2011－02－16基金项目：国家自然科学基金项目（30973747）作者简介：李艳青（1980－），女，山东潍坊人，博士研究生，研究方向：中西医结合内科学。
通讯作者：张晓云（1953－），女，四川乐山人，教授、主任医师，博士研究生导师，研究方向：中西医结合内科学。
缺血性脑血管病（Ischemic Cerebral Vesscular Dis-ease ，ICVD ）是威胁人类健康与生存的主要疾病之一，致残率极高，是目前重点防治的疾病之一。
在ICVD 的治疗中重建血流或增强缺血区的血流供应是缺血脑组织修复损伤的必需条件，但同时带来的再灌注损伤也是目前最受关注的问题。
全国重点专病“中风病”建设单位、成都中医药大学附属医院急诊科陈绍宏教授是我国著名中医急症专家，他经过多年潜心观察和临床验证，提出了“中风核心病机”理论［1］，认为中风病的核心病机是：元气亏虚、痰瘀互阻、风火相煽；其中以元气虚为本，痰、瘀、风、火都是继发于元气虚的内生之邪。
中药脑脊液药理学方法的建立──清脑益智方对谷氨酸损伤神经保护重点
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茯苓生脉饮对自由基损伤的海马神经元保护作用的研究
茯苓生脉饮对自由基损伤的海马神经元保护作用的研究
陈红;杜家经
【期刊名称】《中国中医药科技》
【年(卷),期】2002(009)005
【摘要】目的:探讨茯苓生脉饮含药血清对自由基损伤的海马神经元的保护作用.方法:在细胞培养的第6d加入黄嘌呤(XO-HPX)体系产生超氧阴离子自由基(O-2)成为衰老模型,观察培养的神经元形态结构的变化,并经尼氏染色,通过计算机图象分析,在细胞培养的第2、4、8d测量尼氏小体的积分光度值.结果:加入XOHPX体系造模后,海马神经元突触、胞体长径和细胞存活数均有不同程度的减少;尼氏染色后经计算机图象分析,在不同时相测得茯苓生脉饮组尼氏小体积分光度值均高于空白对照组(P＜0.01).结论:茯苓生脉饮能有效地清除自由基,促进细胞内蛋白质的合成.【总页数】2页(P294-295)
【作者】陈红;杜家经
【作者单位】武汉市中医医院·武汉,430014;武汉市中医医院·武汉,430014
【正文语种】中文
【中图分类】R2
【相关文献】
1.茯苓生脉饮对离体大鼠海马神经元SOD、MDA、LF水平的影响 [J], 陈红;杜家经
2.睾酮在自由基损伤的海马神经元保护作用中的机制 [J], 蔡志平;李朝晖;石素琴;
崔慧先;贾建新;霍东升
3.雄激素对自由基损伤后海马神经元的保护作用 [J], 蔡志平;崔慧先;李朝晖;李莎;朱劲松;解国圣;薛磊
4.睾酮对自由基损伤的海马神经元神经保护作用中细胞内Ca2+变化 [J], 刘鑫;蔡志平;石素琴;罗永胜;石岩
5.茯苓生脉饮对体外大鼠脑海马神经元、超氧化物歧化酶、丙二醛及脂褐素水平的影响 [J], 陈红;杜家经
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对乙酰氨基酚对心肌细胞H2O2损伤的保护作用
Ａ ｓ ａｔ ｂｔ ｃ：Ｏｂｅｔ ｅ ｈ ｕｐｓ ｆｈｓｎｅｔａ ｏ ａ ｅ ｒ ｉｅｔｅｒ ｅ ｆ ｃｔｍｎ ｐｅ ｎｃｌ ｒｄｎｏ ａ ｌａ ｃｒ ｒ ｊｃｉ Ｔ ｅｐｒｏｅｏ ｉ ｉ ｓｇｔ ｎｗ ｓｔ ｄ ｔ ｍ ｎ ｈ ｏ ｅ ｉｏｈｎｏ ｕ ｕｅ ｅｎｔ ｔ ａ ｖ ｔ ｖ ｉ ｉ ｏ ｅ ｌｏ ａ ａ ｔ ａｒ －
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维普资讯
辽孝 屋 学院 ０８ ＪＬａ ｉｇ Ｍｅ ｉ ａ 学 报 ｒ ｉ ２ｏ ｕ ２ （ ） ｉ ｎ ｄ ｃ Ｕｎｉｅｓｔ Ｊｎ ９ ３ ｏｎ Ｍｅ ｖ ｙ … … ｌ
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对 酰氨 基 酚对 心肌 细 胞 Ｈ Ｏ 损伤 的保 护 作 用 ２２
原代 Ｓ Ｄ大
鼠乳 鼠心肌 细胞培养 ， ８ｈ ４ 后加入 Ｈ （ 造成心肌 细胞损 伤 ，损伤 前 １ｈ加 入不 同浓度的 Ａ Ａ ：２ ） Ｐ Ｐ作 为保 护 剂。损 伤 ６ｈ后 ， 甲基四唑蓝比色 （ ａ ） 法测定线粒体脱氢酶 活性 ，试 剂盒测 定培养液 中乳酸脱氢酶 （ Ｄ Ｍｒ Ｌ Ｈ）活性 、心肌 细胞 中脂 质过氧 化产物 丙二 醛 （ Ａ ＭＤ ）含量 、超氧化物歧化酶 （ Ｏ Ｓ Ｄ）活性 、Ｃ ｓａｅ一 ａｐｓ ３活性 。结果 Ｈ Ｏ 能明显造成心肌 细胞损伤 ， ：： 表
脑缺血-再灌注相关细胞因子表达的TNF-α损伤机制及清开灵的作用
摘要 目的 ： 探讨 缺血 一再灌注 大鼠相 关细胞 因子的 Ｔ Ｆ一０损 伤机 制 以及 清开灵 的作用特征 。方 法： Ｎ 【 健康雄 性 Ｗｉａ 大 鼠， ｓｒ ｔ 利用双侧颈 总动脉 夹闭的方法复制大鼠前脑缺血 一再灌 注模 型 ， 分别给 予 清开灵 注射 液、 Ｎ Ｔ Ｆ一Ⅱ抗体及 该抗 体与 清开灵 共 用 。选择 再 灌 注 ２ ｈ和 ７ ｈ两 个 时 间点 ， 测 血 清 Ｔ Ｆ一０ 血 清 可溶 性 细 胞 间 黏 附 分 子 一１ ｓＣ Ｍ 一１ 、 清 Ｐ一选择 素 （ ４ ２ 检 Ｎ 【 、 （ＩＡ ）血 Ｐ— ｓｌ ｔ ） ｅ ｃｉ 含量 以及 脑组 织细胞间黏 附分子 一１ ＩＡ 一１ 表 达量 。结 果 ： ｅ ｎ （Ｃ Ｍ ） 清开灵 具有 降低 升 高的血 清 Ｔ Ｆ— 含 量 的趋 势 ， Ｎ 而 Ｔ Ｆ— 抗体 的作用随时 间延长 而增 强 ； 开灵和 Ｔ Ｆ～０抗 体均能够有 效地降低外周血 ｓ Ａ 一１水平 、 Ｎ 清 Ｎ 【 ｌ Ｍ Ｃ 脑组织 ＩＡ 一１ ＣＭ 含 量和血清 Ｐ—ｓｌｃｎ含 量 ， ｅｅｔ ｉ 阻断 Ｔ Ｆ— 后更 明显 ， Ｎ 而且使 清开灵的作 用更 为显著 。结论 ： 脑缺 血 一再 灌 注寻致的损 伤与微血
１０ ２ ０ ０ ９）
Ａｂｔａｔ Ｏｂｅｔ ｅ Ｔ ｖｓｇｔ ｉ ｐ ｉ ｅｔ ｃ ａｉ ｆ Ｎ — ｉ ｉ ｈｍｉ ｒｐｒ ｓ ｎｒｔ ａｄｅ ｅｔ ｆ ｉｇａｌ ｇ ｓｒｃ ｊｃｉ ：ｏｉ ｅｔ ａ ａ ｍ ｎ ｈ ｎｓ ｏ Ｆ ｎ ｓ ｅ ａ ｅｅｆ ｉ ｓ ｎ ｆ ｃ ｏ ｎｋｉｎ．Ｍｅｈ ｄ ： ｖ ｎ ｉ ｅｍ ｒ ｍｅ ｍ Ｔ ｃ ・ ｕ ｏ ａ Ｑ ｉ ｔｏ ｓ Ｔ ｅｉ ｈ ｍ ａｒｐｒ ｓ ｎｍ ｄｌ ｆ ａ ａ ｓ ｂｉ ｅ ｙｐｒ ｒ ｎ ｏｂｅｃｍ ｏ ａ ｔ ｌｍ ｉ ｎａ ｕ ａｅＷｉ ａ ｒｔ ｉｇ ｈ ｃｅ ｉ— ｅ ｕｉ ｏｅ ｏ ｔ ｗ ｓ ｔ ｌ ｈｄｂ ｅｆ ｍｉ ｄ ｕｌ ｏ ｍ ｎｃｒ ｉ ｃａ ｐｎ ｏ ｄ ｈｍ ｌ ｓ ｅ ｆ ｏ ｒｓ ｅａ ｓ ｏ ｇ ｏｄ ｇ ｓ ｒ ａｓ ｎ－ ｔ ．Ｑ
清开灵及有效成分对培养大鼠缺血损伤神经胶质细胞分泌NGF的影响
【实验研究】清开灵及有效成分对培养大鼠缺血损伤神经胶质细胞分泌NGF的影响Ξ严 华1,张永祥2,黄璐琦1,王永炎1(11中国中医研究院,北京 100700;21军事医学科学院,北京 100085) 关键词:清开灵;神经生长因子 中图分类号:R2203 文献标识码:B 文章编号:100623250(2003)022******* 脑缺血损伤导致神经元的死亡,不可能再生,但瘫痪肢体的功能却可能恢复,其机制尚未明确。
较多的研究表明,生长因子的诱导与合成可能为潜在的机制之一,其中NG F与脑缺血的关系已倍受关注[1]。
大量研究证明,神经生长因子能促进缺血损伤的神经元的恢复[2],为脑缺血损伤的治疗带来一线曙光。
然而神经生长因子作为大分子蛋白很难透过血脑屏障,脑室内或皮层给药虽然可以达到治疗目的,但也不可避免地对大脑造成损伤,而且操作复杂,不易为临床接受。
因此,寻求一条提高NG F内源性表达的途径对治疗与预防缺血性脑损伤尤为重要。
神经胶质细胞是中枢神经系统重要的细胞,其数目大约是神经元的10倍,脑缺血损伤时,神经胶质细胞大量合成分泌NG F,对缺血损伤神经元的再生修复起到重要作用[325]。
为进一步探索清开灵的疗效机制,辨析清开灵中有效成分作用的异同,我们对缺血培养神经胶质细胞分泌NG F及清开灵各有效成分对其影响进行了观察分析。
1 材料与方法111 材料11111 动物 Wistar大乳鼠,出生后7d,军事医学科学院动物中心提供。
11112 仪器 超净台:北京半导体设备一厂;细胞培养箱:美国NAPC O M odel5410;酶标仪Π多孔扫描充光光度计:Multiskan MCCΠ340MKⅡ美国;96孔培养板:丹麦NUNC;倒置显微镜:O LY MPUS日本。
11113 药品与试剂 清开灵:课题组提供;黄芩甙、栀子甙、绿原酸:中国生物制品检定所;NG F试剂盒:帮定公司分装,美国Sant Crus公司产品;常规试剂均为分析纯。
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国家项目点击中华中医药学刊清心开窍方含药脑脊液对过氧化氢（H2O2）所致PC12细胞损伤的保护作用朱未名1，胡海燕2，陈翔2，王文花2（1．温州鹿城精神病医院，浙江温州325003；2．温州医学院，浙江温州325003）摘要：目的：从细胞水平研究清心开窍方含药脑脊液对过氧化氢（H2O2）损伤的PC12细胞的保护作用，为该方剂的临床应用提供依据。
方法：SD大鼠灌胃给予清心开窍方水煎液（7．9g·kg－1），每日2次，连续3．5d，制备清心开窍方含药脑脊液。
采用PC12细胞和终浓度200μmol·L－1的过氧化氢共培养，造成神经细胞损伤模型。
RT－PCR方法检测Bax mRNA、Bcl－2mRNA、Caspase－3mRNA表达水平，MTT法检测清心开窍方含药脑脊液对PC12细胞活性的影响。
结果：清心开窍方含药脑脊液组PC12细胞活性明显高于模型组，清心开窍方含药脑脊液组PC12细胞活性明显高于模型组，Bax mRNA、Caspase－3mRNA表达水平降低，Bcl－2mRNA表达增高，与模型组比较，差异显著（P＜0．05 0．01）。
结论：清心开窍方对H2O2损伤的PC12细胞有明显的保护作用。
关键词：清心开窍方；PC12细胞；过氧化氢（H2O2）；保护作用中图分类号：R285．5文献标识码：A文章编号：1673－7717（2013）03－0466－04Protective Effect of Cerebrospinal Fluid Containing Qianxin KaiqiaoDecoction on PC12Cell Injury Induced by Hydrogen peroxide（H2O2）ZHU Weiming1，HU Haiyan2，CHEN Xiang2，WANG Wenhua2（1．Wenzhou Lucheng Mental Disease Hospital，Wenzhou325003，Zhejiang，China；2．Wenzhou Medical College，Wenzhou325003，Zhejiang，China）Abstract：Objective：To observe the protective effect of cerebrospinal fluid containing Qianxin Kaiqiao decoction onPC12cell injury induced by Hydrogen peroxide（H2O2）and provide clinical proof of the formula．Methods：Sprague Daw-ley rats underwent intragastric administration of Qianxin Kaiqiao decoction twice a day for three and a half days，the ad-ministration dose for rats was（7．9g·kg－1）．Thus the cerebrospinal fluid containing Qianxin Kaiqiao was prepared．Themodel of neurocytes damaged by H2O2had been established by adding200μmol·L－1H2O2to culture medium of PC12 cells．The expressions of Bax mRNA，Bcl－2mRNA and Caspase－3mRNA were tested by immunohistochemistry in thePC12cells．Results：The cell activity in cerebrospinal fluid containing Qianxin Kaiqiaofang decoction groups were in-creased，the expressions of Bax mRNA and Caspase－3mRNA decreased and the expression of Bcl－2mRNA increasedin cerebrospinal fluid containing Qianxin Kaiqiao decoction groups，compared with comparison group，the difference wasnotable（P＜0．05，P＜0．01）．Conclusion：Qianxin Kaiqiao decoction showed an apparent protective effect on neurocytesdamaged by H2O2．Key words：Qianxin Kaiqiao formula；PC12cells；hydrogen peroxide（H2O2）；neurop rotective effect收稿日期：2012－10－05基金项目：国家自然科学基金资助项目（30973780）；浙江省自然科学基金资助项目（Y2080273）；温州市科技局资助项目（Y20080106）作者简介：朱未名（1962－），男，副主任医师，研究方向：老年精神疾病。
通讯作者：胡海燕（1963－），女，副教授，硕士，研究方向：中医科研、教学及临床。
清心开窍方窍源自明代著名医学家张景岳《景岳全书》中的“蛮煎”，由生地、麦冬、芍药、石菖蒲、石斛、牡丹皮、茯神、陈皮、知母等组成，具有清心凉血开窍功效。
是用于治疗AD的有效方剂，已广泛运用于临床多年，且疗效显著，尤其对早期出现症状者效果更佳，临床治疗AD能明显改善患者的认知功能障碍、行为和精神症状等［1－3］。
前期的实验研究证实该方水煎剂能明显改善AD小鼠学习记忆能力，降低AD小鼠脑组织中NO、NOS含量及Ache活性，降低氧自由基对机体的损伤，对海马神经细胞具有保护作用［4－7］。
本研究从细胞水平探讨清心开窍方含药脑脊液对过氧化氢（H2O2）损伤所致神经细胞的保护作用。
1材料与方法1．1动物及细胞株SD大鼠60只，雄性，SPF级，体重（250ʃ20）g，健康状况良好，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供。
许可证号：SCXK（湘）2009－0004。
PC12细胞株购自中南大学细胞生物学实验中心。
664中华中医药学刊1．2药材与试剂清心开窍方（生地6g ，麦冬6g ，白芍6g ，石斛6g ，丹皮6g ，茯神6g ，苦参6g ，陈皮4g ，知母5g ，石菖蒲6g ）：湖南中医药大学附属第一医院药剂科提供。
过氧化氢（H 2O 2）：国药集团化学试剂有限公司生产。
尼莫地平：山东新华制药有限公司生产，批号：20100711。
DMEM 髙糖培养基：美国Hyclone 公司提供。
胎牛血清：Gibco 公司提供。
胰蛋白酶：上海生工提供。
二甲基亚砜：国药集团化学试剂有限公司提供。
MTT ：美国SIGMA 公司提供。
一步法RT －PCR 试剂盒：宝生物工程有限公司提供。
Trioz ：国药集团化学试剂有限公司提供。
100bp 标准DNA 分子：美国Por-mega 公司提供。
焦碳酸二乙酯（DEPC ）：国药集团化学试剂有限公司提供。
引物：上海生工生物工程公司合成。
1．3实验用主要仪器二氧化碳培养箱：日本三洋公司产品。
倒置显微镜COVER －018：日本Olympus 公司产品。
WZ －ZA 微量振荡器：北京海淀电子医疗仪器厂产品。
TGL16M 台式高速离心机：长沙英泰仪器有限公司产品。
XW －80A 旋涡混合器：上海医科大学仪器厂产品。
电热恒温水浴箱（DZ －84）：上海跃进医疗器械厂产品。
净化工作台：苏州净化仪器厂产品。
酶标仪：美国Thermo 公司产品。
紫外分光光度仪：美国Thermo 公司产品。
DNA 热循环扩增仪：美国Ther-mo 公司产品。
超低温冰箱：青岛海尔公司产品。
凝胶扫描成像分析系统：美国Startganee 公司产品。
1．4含药脑脊液的制备SD 大鼠20只，雄性，体重（250ʃ20）g 。
给药组10只，灌胃给予清开方水煎液（7．9g ·kg －1），每日早晚2次，连续3．5d 。
空白组为正常对照组，给予同体积（10mL ·kg －1）的生理盐水。
第7次给药后1h ，以水合氯醛（350mg ·kg －1）麻醉大鼠，颈后部备皮，75%酒精消毒，将大鼠颈部弯曲以暴露枕骨大孔，用1mL 无菌注射器，从枕骨大孔刺入延髓池，取50μL 脑脊液后迅速抽出针头，合并脑脊液，4ħ条件离心（3000r /min ˑ10min ），收集上清，过滤，－20ħ冻存备用。
1．5PC12细胞培养与分组将复苏后的PC12细胞接种于75mL 培养瓶，用含15%，53ħ灭活胎牛血清的高糖DMEM 培养基（内含100U /L 青霉素、100U /L 链霉素），37ħ、饱和湿度、5%CO 2的培养箱中培养。
细胞呈单层贴壁生长，加入0．25%胰蛋白酶消化，调整细胞浓度为0．5－1ˑ106/mL ，接种于涂有多聚赖氨酸的96孔培养板，置于37ħ、5%CO 2下继续培养24h ，细胞进入对数生长期后开始加药。
取长满单层PC12细胞的96孔培养板，弃去培养液，用D －Hank ’s 液洗涤2次，加入无血清DMEM ，细胞分为①正常组、②模型组、③尼莫地平组、④10%正常脑脊液组、⑤10%含药脑脊液组、⑥20%正常脑脊液组、⑦20%含药脑脊液组，4孔/组。
①组加入无血清的DMEM ，② ⑦组每孔加入终浓度200μmol ·L －1的过氧化氢造模，然后③组加入终浓度为1ˑ107mol ·L －1尼莫地平，④组、⑥组分别加入10%正常脑脊液和20%正常脑脊液，⑤组和⑦组分别加入10%的清开方含药脑脊液和20%的清开方含药脑脊液。
37ħ、5%CO 2培养箱作用4h 后，弃去培养液，用D －Hank ’s 液洗涤2次，加入无血清DMEM 培养24h ，在造模过程中及造模后，③ ⑦组均加入相应浓度的药物及脑脊液。
1．6四甲基偶氮唑盐（MTT ）检测称取MTT0．5g ，溶于100mL 磷酸缓冲液（PBS ）中使其浓度为5mg ·ML －1，用0．22μm 滤膜过滤除菌，4ħ避光保存。
将贴壁率约为80%的PC12细胞用吸管轻轻吹打调成细胞悬液，移至离心管500r /min 离心5min ，弃上清，加入3mL 完全培养基重复洗一遍，加入完全培养基用吸管轻轻吹打调节PC12细胞密度约0．5－1ˑ106/mL ，接种于96孔培养板，每孔100μL ，置37ħ，5%CO 2细胞培养箱培养24h 。