瘦素通过GSK3介导的OMA1泛素化降解途径增加OPA1表达以提高骨髓间充质干细胞的抗凋亡能力
瘦素通过GSK3介导的OMA1泛素化降解途径增加OPA1表达以提
高骨髓间充质干细胞的抗凋亡能力
研究背景及目的急性心肌梗死引起心肌细胞缺血缺氧性损害,出现程序性凋亡或坏死,产生左室病理性扩张及左室射血分数降低。心肌细胞再生能力有限导致心肌梗死区的死亡心肌细胞被成纤维细胞替代,产生无收缩功能的胶原瘢痕组织,最终导致缺血性心肌病、心力衰竭的发生。
骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)治疗急性心肌梗死的治疗效果已在许多大型灵长类动物实验及临床试验中得到证实。MSCs具有低免疫
原性、多向分化潜能、干性维持及获取方便等优势。
但是,心梗后不利的微环境导致移植到心梗周边区的细胞存活率很低,这成
为MSCs有效治疗的瓶颈。我们团队以往的研究发现缺氧预处理(hypoxia preconditioning,HP)的MSCs的存活能力明显增强,通过对正常培养的MSCs和缺氧预处理MSCs两组细胞的基因组芯片分析,发现缺氧预处理能明显上调MSCs的瘦素(leptin)水平,并且提出瘦素可能参与了 MSCs治疗心肌梗死的作用。
然而,瘦素是否通过独立保护MSCs抗凋亡而促进其疗效以及相应的分子机
制尚不清楚。为此,本博士研究课题将首先着力于证实瘦素是否具有保护MSCs
抗凋亡的作用。
线粒体的形态结构和稳态的维持是细胞存活的必要条件。线粒体脊结构破坏将导致其中富含的许多前凋亡因子从线粒体中释放到胞浆,而启动凋亡信号通路。
线粒体稳态(融合与分裂)的动态平衡是维持正常细胞线粒体功能的重要条件,线粒体分裂有利于清除细胞内受损的线粒体,但过度分裂也会启动线粒体自
噬导致细胞凋亡。瘦素是脂肪细胞分泌的肽类激素,在平衡能量代谢、神经内分
泌及调节免疫系统方面都有广泛作用。
许多研究发现瘦素对线粒体有潜在调控作用。在乳腺癌细胞(MCF-7)中给予瘦素处理后,发现线粒体的动力学稳态和功能有着明显改善;瘦素这一线粒体调控作用在瘦素缺失的ob/ob小鼠中也得到进一步证实。
已有文献提出瘦素对心肌细胞的抗凋亡保护作用。因此,本博士论文课题同时也将就瘦素是否同样通过对MSCs线粒体形态结构及其稳态的调节而发挥抗凋亡而保护MSCs的生存展开研究。
第一部分:在体内和体外模型中验证瘦素对骨髓间充质干细胞的存活能力的影响目的:在体内和体外模型中验证瘦素对MSCs的存活能力有无影响方法与结果:在体实验部分,首先,分离培养人骨髓来源的间充质干细胞(hMSCs),并利用带有GFP标记瘦素过表达质粒的慢病毒感染hMSCs过表达瘦素,以便将过表达瘦素的hMSCs移植到急性心梗C57BL/6J小鼠心脏治疗备用。我们将C57BL/6J小鼠随机分为三组(每组20只):Ⅰ)心肌梗死(MI)组小鼠给予瘦素过表达hMSCs治疗(hMSClep);Ⅱ)MI组小鼠给予同等细胞数量病毒质粒载体感染hMSCs治疗(hMSCvec);Ⅲ)MI组小鼠给予相同注射体积的DMEM组。
我们的结果显示:Ⅰ)在心梗术后3天取材小鼠心脏,切片荧光共染GFP和TUNEL评估hMSCs存活率。与病毒空载组(vector)相比较,移植病毒过表达瘦素的hMSCs组中的hMSCs细胞存活率明显提高(p=0.01)。
Ⅱ)在心梗后28天进行超声心动图检测心功能和天狼星红染色评价梗死面积发现,瘦素过表达hMSCs组小鼠的心功能和梗死面积均较对照组有明显缓解。通过术后28天检测血管新生相关标记物提示:hMSCs是通过旁分泌效应增强血管新生而改善心梗后心功能。
体外实验建立缺糖缺氧缺血清(glucose and serum deprivation under hypoxia,GSDH)的hMSCs诱导凋亡模型模拟在体心梗体内不良微环境。在常氧下将hMSCs给予瘦素(50 ng/ml)预处理24小时后,再暴露于GSDH刺激24小时。
通过Annexin V/PI染色、TUNEL染色和剪切型caspase 3凋亡蛋白的检测,发现与对照组相比,瘦素预处理hMSCs组的细胞在凋亡应激环境中的抗凋亡能力明显增强。我们收集细胞培养的条件上清液,进行HUVEC细胞的matrigal管腔形成实验,发现与对照组相比,瘦素预处理hMSCs组的条件上清液使HUVEC细胞管腔形成最明显,进一步证实hMSCs的旁分泌效应。
第二部分:在体外研究瘦素对间充质干细胞的线粒体动力及功能的改变及其机制探索目的:线粒体是细胞凋亡中重要的细胞器,通过分析线粒体结构和动力的相关调控因子,进一步探索瘦素对hMSCs的线粒体改变的机制方法与结果:在预处理瘦素(50ng/ml)24小时后,再将hMSCs进行GSDH诱导凋亡24小时。通过细胞透射电镜观察hMSCs的超微结构,发现瘦素预处理hMSCs中的线粒体明显增粗增长、脊膨胀;而对照组的线粒体形态则是稀疏、短小的点状样。
但是细胞氧耗量的检测发现瘦素预处理组的hMSCs比对照组明显减少,提示我们在凋亡模型中瘦素只对线粒体形态的完整性有保护作用,而对改善线粒体的氧化磷酸化功能没有作用。进一步分析线粒体动力相关因子,发现在瘦素预处理hMCSs组中,线粒体上调控内膜融合与分裂的因子Optic atrophy 1(OPA1)的蛋白水平明显上调,但在基因水平无变化。
OPA1是与动力相关GTP酶样蛋白,位于线粒体内膜上,调节线粒体内膜的融合与分裂、维持脊结构。OPA1有至少5个亚型,主要为长亚型(a、b)和短亚型(c、d、e)。
有趣的是,长亚型OPA1(L-OPA1)和短亚型OPA1(S-OPA1)的功能截然相
反,L-OPA1调控线粒体内膜融合,S-OPA1控制线粒体内膜分裂。我们发现,在瘦素预处理组的hMSCs中的L-OPA1明显增多,这符合电镜下观察到的线粒体增粗延长,提示线粒体的病理性融合。
通过siRNA进行细胞OPA1的特异性基因沉默方式,证实瘦素对hMSCs的抗凋亡保护作用依赖于OPA1因子。进一步分析调控OPA1的因子后发现,在瘦素预处理hMSCs组,另一个线粒体内膜蛋白OMA1的降解增多。
已有文献报道,OMA1对OPA1有负性调节作用,OMA1的降解增加符合上述观察到的OPA1的蛋白水平表达增多。同时,我们发现瘦素通过GSK3磷酸化激活而启动OMA1的泛素化降解途径,并且给予GSK3的抑制剂(SB216763)阻止了 OMA1的降解作用,提示OMA1的泛素化降解依赖于GSK3磷酸化激活。
结论:在急性心肌梗死后的恶劣的微环境中,1)瘦素能够通过维持线粒体脊结构的完整性而增强hMSCs的抗凋亡能力;2)瘦素通过依赖于GSK3磷酸化的方式而介导OMA1的泛素化降解,从而减少OMA1对OPA1的剪切而使OPA1的蛋白表达水平增多,促使线粒体融合。我们提出了,瘦素通过作用于GSK3/OMA1/OPA1信号通路而增强hMSCs应激时的抗凋亡能力,为心血管疾病的干细胞治疗提供新的靶点。
内质网内的泛素化机制
内质网内的泛素化机制 当蛋白质经过内质网（endoplasmic reticulum，ER）的时候，会有一套―质控‖系统暂时将那些新合成的蛋白质―扣留‖下来，帮助它们成熟。只有折叠正确的蛋白质才会被―释放‖，而那些不能成熟的蛋白质则会被继续―关押‖，但是这样会损害内质网的功能。因此，为了维持内环境的稳态，蛋白质质控系统会将这些―不合格产品‖移交到胞质溶胶当中，在那里，被蛋白酶体降解掉。随着在越来越多的病理过程当中发现了内质网质控系统功能缺陷的现象，我们也开始逐渐意识到细胞内这条作用机制的重要性。 在所有人类基因组编码的蛋白质当中，大约有20%的蛋白质被认为是分泌性蛋白质。这些分泌性蛋白质在到达它们的最终的目的地之前都需要先经过内质网的处理，这些目的地广泛分布在细胞各种，例如细胞膜上，各种胞内或胞外的腔室（Exocytotic and endocytotic compartments），以及细胞外表面等等。内质网不仅仅只是提供了一个―容器‖，它同时还提供了众多的分子伴侣，帮助蛋白质折叠、成熟。不过虽然细胞提供了这些帮助，蛋白质在合成过程当中仍然非常容易出错。大约有1/3的新生蛋白质会在翻译过程中或者在翻译后数分钟之内被降解掉。这些蛋白质是因为在转录过程、翻译过程、成熟过程或折叠过程中出现了某些错误，或者各个亚基之间的合成不平衡，从而不能形成正确的构象而被降解的。即使是成熟的蛋白质也会因为各种诸如高能辐射、化学损伤、代谢产物等等环境因素而被损伤。这些损伤蛋白会聚集在一起，也会出现功能障碍，这都会影响到内质网以及细胞内环境的稳态。因此，进化机制赋予了内质网控制蛋白质质量的功能，这套质控系统可以在好几个层面对蛋白质进行监控，维持内质网的完好性。 在蛋白质刚刚合成时它们会通过一个特异性的N连接聚糖（N-linked glycan structure）结构被保护起来，可以免遭降解。随后，那些可能发生错误折叠的蛋白质会被内质网中甘露糖苷酶（mannosidase）生成的一种―聚糖密码（glycan code）‖所标记（图1）。然后，锚定在内质网膜上的泛素连接酶会破译该―密码‖，需要被降解的蛋白质被转运出内质网，经由泛素化途径被26S蛋白酶体降解掉，该过程也被称为内质网相关的降解途径（ER-associated degradation，ERAD）。发生错误折叠的蛋白质并不是唯一一个进入ERAD系统的底物，ERAD 系统还可以调控甾醇合成途径，它可以在甾醇过多的情况下降解掉甾醇合成途径中的限速酶，以此来控制合成速度。 图1 蛋白质在内质网内的降解途径。错误折叠的蛋白质在内质网内被降解掉需要以下几个
(完整版)泛素化蛋白检测方法
泛素化蛋白检测方法 蛋白质泛素化简介蛋白质泛素化修饰过程在人体免疫系统调节过程中起到了关键性的作用。与磷酸化修饰过程一样，泛素化修饰过程也是一种可逆的共价修饰过程，它能够调节被修饰蛋白的稳定性、功能活性状态以及细胞内定位等情况。 泛素蛋白是一个由76 个氨基酸残基组成的非常保守的多肽，它能在E1、E2、E3 酶等一系列酶促反应催化下与细胞内靶蛋白上的一个或多个赖氨酸残基发生共价连接。泛素蛋白本身也含有7 个赖氨酸残基，因此它们之间也可以通过这些位点互相连接，形成多泛素蛋白链（polyubiquitin chain）。目前研究显示，如果多泛素蛋白链与被修饰蛋白上的第48 位赖氨酸残基相连，会介导靶蛋白进入蛋白酶体而被降解；如果与被修饰蛋白上其它位点，比如第63 位赖氨酸残基相连，则靶蛋白可以发挥信号通路功能而不会被降解。 与磷酸化修饰途径一样，泛素化修饰途径也是可逆的，即可以通过去泛素化酶（DUB ）将泛素蛋白修饰物去除掉。靶蛋白经泛素化途径修饰之后，连接在靶蛋白上的泛素蛋白单体或多聚体可以被各种泛素蛋白结合结构域（UBD ）所 识别和结合。人类蛋白质组中含有两种E1酶、50种E2酶、600种E3酶、90 种DUB 酶和20 种UBD ，这说明泛素修饰途径在细胞调控中起到了多么重要的作用。E3 酶是泛素修饰途径中决定底物特异性的关键酶，它可以分为两大类，即含有HECT 结构域的E3 酶和其它含有RING 结构域或RING 样结构域（比如U-box 或PHD 结构域）的E3 酶。这两种E3 酶都在免疫调控过程中起到了关键性的作用。 蛋白质泛素化的检测方法研究蛋白质的泛素化首先需要明确的三个基本点：哪些蛋白发生了泛素化；发生了泛素化的蛋白质，具体是哪个位点的赖氨酸残基发生了泛素化；进行定量。 明确了上述几点后，进一步需要弄清楚的是，我们感兴趣的泛素化蛋白，是 如何发生泛素化的，影响这一泛素化过程的关键分子是什么？或者说这一过程中的E3 酶是什么？ 然后需要研究的是，这一蛋白质发生泛素化之后可以产生那些分子效应？对下游
蛋白质泛素化研究进展—探索蛋白修饰的秘密
蛋白质泛素化研究进展——探索蛋白修饰的秘密 泛素是一种含76个氨基酸的多肽，存在于除细菌外的许多不同组织和器官中，具有标记待降解蛋白质的功能。被泛素标记的蛋白质在蛋白酶体中被降解。由泛素控制的蛋白质降解具有重要的生理意义，它不仅能够清除错误的蛋白质，还对细胞周期调控、DNA修复、细胞生长、免疫功能等都有重要的调控作用。 2004年，以色列科学家Aaron Ciechanover、Avram Hershko和美国科学家Irwin Rose就因发现泛素调节的蛋白质降解而被授予2004年诺贝尔化学奖。正是因为泛素调节的蛋白质降解在生物体中如此重要，因而对它的开创性研究也就具有了特殊意义。目前，在世界各地的很多实验室中，科学家不断发现和研究与这一降解过程相关的细胞新功能。现在，研究人员已发现泛素具有多种非蛋白水解功能，包括参与囊泡转运通路、调控组蛋白修饰以及参与病毒的出芽过程等。 鉴于蛋白质降解异常与许多疾病，例如癌症、神经退行性病变以及免疫功能紊乱的发生密切相关，而基因的功能是通过蛋白质的表达实现的，因此，泛素在蛋白质降解中的作用机制如能被阐明将对解释多种疾病的发生机制和遗传信息的调控表达有重要意义。 《生命奥秘》本月专题将介绍泛素系统的来源、研究进展，并重点介绍以“泛素-蛋白酶”为靶位的抗癌疗法，希望能给相关领域的研究人员带来崭新的思路。 一、泛素样蛋白的来源及功能 1. 泛素样蛋白及其相关蛋白结构域 2. 泛素样蛋白连接后的结果 3. 泛素样蛋白修饰途径的起源 4. 前景展望 二、泛素化途径与人体免疫系统调节 1. 泛素修饰途径与NF-κB信号通路的关系 2. 泛素蛋白在天然免疫中的作用 3. 泛素化修饰途径在获得性免疫机制中的作用
自噬与泛素化蛋白降解途径的分子机制及其功能
HEREDITAS (Beijing) 2012年1月, 34(1): 5―18 ISSN 0253-9772 https://www.360docs.net/doc/e416071112.html, 综 述 收稿日期: 2011?06?03; 修回日期: 2011?08?19 基金项目:转基因生物新品种培育重大专项(编号：2009ZX08009-148B)资助 作者简介:陈科, 博士研究生, 研究方向：动物发育遗传学。E-mail: chenke@https://www.360docs.net/doc/e416071112.html, 通讯作者:周荣家, 教授, 博士生导师, 研究方向：动物发育遗传学。E-mail: rjzhou@https://www.360docs.net/doc/e416071112.html, 网络出版时间: 2011-8-24 11:11:40 URL: https://www.360docs.net/doc/e416071112.html,/kcms/detail/11.1913.R.20110824.1111.004.html DOI: 10.3724/SP.J.1005.2012.00005 自噬与泛素化蛋白降解途径的分子机制及其功能 陈科, 程汉华, 周荣家 武汉大学生命科学学院, 武汉 430072 摘要: 细胞内所有的蛋白质和大多数的细胞外蛋白都在不断的进行更新, 即它们在不断地被降解, 并被新合成 的蛋白质取代。细胞内蛋白的降解主要通过两个途径, 即自噬和泛素蛋白酶体系统。自噬是一种由溶酶体介导的细胞内过多或异常蛋白质的降解机制。在细胞内主要有3种类型的自噬, 即分子伴侣介导的自噬、微自噬和巨自噬。泛素蛋白酶体系统是由泛素介导的一种高度复杂的蛋白降解机制, 它参与降解细胞内许多蛋白质并且这个过程具有高度特异性。细胞内蛋白质的降解参与调节许多细胞过程, 包括细胞周期、DNA 修复、细胞生长和分化、细胞质量的控制、病原生物的感染反应和细胞凋亡等。许多严重的人类疾病被认为是由于蛋白质降解系统的紊乱而引起的。文章综述了自噬和泛素化途径及其分子机制, 以及蛋白质降解系统紊乱的病理学意义。 关键词: 蛋白质降解; 自噬; 泛素蛋白酶体系统 Molecular mechanisms and functions of autophagy and the ubiq-uitin-proteasome pathway CHEN Ke, CHENG Han-Hua, ZHOU Rong-Jia Life Science College , Wuhan University , Wuhan 430072, China Abstract: All proteins in eukaryotic cells are continually being degraded and replaced. Autophagy and the ubiq-uitin-proteasome system are two mechanisms for intracellular protein degradation. Autophagy is mediated by lysosome, and is further divided into chaperone-mediated autophagy, microautophagy and macroautophagy. The ubiquitin-proteasome system is highly complex and mediated by ubiquitin, which participates in intracellular protein degradation in a specific manner. It is now known that degradation of intracellular proteins is involved in regulation of a series of cellular processes, including cell-cycle division, DNA repair, cell growth and differentiation, quality control, pathogen infection, and apoptosis. The aberrations in the protein degradation systems are involved in many serious human diseases. The present review sum-marizes the mechanisms of protein degradation and related human diseases. Keywords: protein degradation; autophagy; ubiquitin-proteasome system 细胞内所有的蛋白质和大多数的细胞外蛋白都在不断的进行更新, 即它们在不断地被降解和被新 合成的蛋白质取代。虽然不断降解细胞内的蛋白似乎很浪费, 但是这个过程在功能上却是非常重要
泛素降解途径
蛋白质降解的泛素—蛋白酶体途径 泛素(ubiquitin，Ub)是76个氨基残基组成的小分子多肽，可以以共价结合的方式与蛋白质的赖氨酸相连。蛋白质一旦接有泛素，称为发生泛素化(uhiquitylation)。泛素化在A TP的参与下被三种酶依序催化，形成蛋白质与一条泛素聚合链相结合的复合结构，进入蛋白酶体，然后降解为肽段(图8—15A)。此为生物大分子在胞质中降解的泛素—蛋白酶体途径(ubiquitim proteosome pathway)。泛素化是一个具有普遍意义的免疫生物学现象。例如第一章提到NF-~B激活中抑制成分I-~cB的降解，以及免疫调节一章中将提到细胞因子信号转导抑制蛋白(SOCS)对底物的作用，皆涉及这一泛素—蛋白酶体途径。 蛋白质泛素化系统由3个组分构成，一个称为泛素激活酶n，它可利用水解A TP释放的能量以其胱氨酸残基(Cys)的巯基与泛素C端的甘氨酸残基(Gly)形成高能硫酯键。然后连接在殿上的泛素被转移到另一个泛素结合酶E2上，同时，被选中的靶蛋白与第三个组分即靶蛋白泛素连接酶E3结合(图8—15A)。E2然后将与其连接的泛素转移到靶蛋白上，并与靶蛋白赖氨酸残基(Lys)—NH2基团形成异肽键(isopeptidebond)，E2被释放。选择什么样的蛋白质进行泛素化主要取决于E2和E3。 内源性抗原在胞内的降解 A．泛素蛋白酶体降解途径；B．泛素化的内源性被28S免疫蛋白酶体降解成肽段。 单个连接的泛素残基尚不足以引起底物降解，活细胞中有一系列的泛素残基可加到前一个泛素赖氨酸残基上，形成泛素聚合链(polyUb)，这一过程受细胞活性的调控。连接到降解蛋白质底物上的多聚泛素链可为蛋白酶体提供识别的信号，也是调控蛋白质降解的环节之一。 内源性抗原肽依据该途径实施降解，具体涉及两个作用环路。其一是泛素与底物结合，然后在分解酶(deconjugatmg enzyme)DUB的作用下重新游离，已如上述；二是结合有调节复合物的28S免疫蛋白酶体，对带有泛素聚合链的内源性抗原肽实施降解，然后再回复到19S 调节复合物及20S蛋白酶体，构成第二个环路。两者共同作用的结果是，泛素化的内源性抗原进入免疫蛋白酶体的孔道后，在蛋白水解酶的作用下降解成为5～15个氨基酸残基的短肽。
泛素化蛋白检测办法
精心整理 泛素化蛋白检测方法 ● 蛋白质泛素化简介 蛋白质泛素化修饰过程在人体免疫系统调节过程中起到了关键性的作用。与磷酸化修饰过程一样，泛素化修饰过程也是一种可逆的共价修饰过程，它能够调节被修饰蛋白的稳定性、功能活性状态以及细胞内定位等情况。 泛素蛋白是一个由76个氨基酸残基组成的非常保守的多肽，它能在E1、E2、E3酶等一系列酶7个赖氨蛋白链（位赖氨酸）将泛素E2酶、600种E3E3E3E3酶都● 影响这一泛素化过程的关键分子是什么？或者说这一过程中的E3酶是什么？ 然后需要研究的是，这一蛋白质发生泛素化之后可以产生那些分子效应？对下游的信号通路有什么影响？ 研究上述内容的实验方法和实验流程： 方法一：westernblotandstrip 通过WB 检测所有发生泛素化的蛋白条带，拍照后，将膜strip 。然后与特定蛋白的抗体和特定泛素化位点的抗体反应，显色拍照。通过阳性条带的对比来初步判断某一特定蛋白的特定
位点发生了泛素化。【具体实验流程附后】 方法二：westernblotandimmunoprecipitations 通过免疫共沉淀方法将某一特定蛋白以及与其结合的蛋白分离出来。分离出来的蛋白再进行SDS电泳和westernblot分析。【具体实验流程附后】。这一方法可以明确具体哪个蛋白的哪个赖氨酸残基发生了泛素化修饰。 方法三：invitroubiquitinationassay 将要研究的目的基因转染293细胞，使其大量表达。24h后提取并分离目的蛋白。在体外反应buffer中将我们要研究的蛋白A（被泛素化的那个蛋白）与UBE1， A泛 。 SDS电
泛素介导的蛋白质降解与肿瘤发生
李艳凤, 张强, 朱大海 (中国医学科学院基础医学研究所中国协和医科大学基础医学院, 北京100005) 摘要: 泛素介导的蛋白质降解途径是降解细胞内蛋白质的主要途径, 在维持细胞正常的蛋白质代谢中起着至关重要的作用。泛素介导的蛋白质降解途径的异常与许多疾病特别是肿瘤的发生密切相关。通过介绍泛素介导的蛋白质降解途径在细胞周期、DNA修复、细胞凋亡中的作用, 系统阐述了泛素介导的蛋白质降解途径与肿瘤发生的关系。 关键词: 基因表达调控; 泛素; 蛋白质降解; 细胞周期; DNA修复; 细胞凋亡; 肿瘤发生 中图分类号: Q519 文献标识码: A 文章编号: 0253-9772(2006)12-1591-06 The Ubiquitin-Proteasome Proteolytic Pathway and Tumorigenesis LI Yan-FenG, ZHANG Qiang, ZHU Da-Hai (Department of Biochemistry and Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 10005, China) Abstract: The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway, a major pathway for protein degradation in cells, plays a critical role in the protein metabolism. So abnormality of the ubiquitin-proteasome proteolytic pathway is closely related to many diseases, especially cancer. In this paper, we reviewed the study of the significant role of the ubiquitin-proteasome proteolytic pathways during the cell cycle, DNA repair and apoptosis, especially the relationship between these pathways and tumorigenesis. Key words: gene expression and regulation; ubiquitin; protein degradation; cell cycle; DNA repair; apoptosis; tumorigenesis 蛋白质是执行生命活动的基本分子, 细胞中的蛋白质不断地处于合成、修饰与降解的代谢更新过程中。保持细胞正常的蛋白质代谢对于生命的正常功能至关重要。目前所知蛋白质的降解主要通过两种途径: 溶酶体降解途径和泛素介导的蛋白酶体降解途径。溶酶体降解途径是一个非选择的蛋白质降解途径, 主要降解通过摄粒作用或胞饮作用进入细胞内的外源蛋白质; 而泛素介导的途径是一个受到严格的时空调控的特异性蛋白质降解途径, 被降解的蛋白通过E1(泛素激活酶, Ubiquitin-activating enzyme)、E2(泛素偶联酶, Ubiquitin-conjungating enzyme)和E3(泛素连接酶, Ubiquitin ligase)一系列的作用与多个泛素共价结合后被蛋白酶复合体(Proteasome)识别并降解。泛素介导的蛋白质降解参与到细胞周期[1]、炎症反应[2]、细胞凋亡[3]、抗原提呈[4]等许多生命过程中。因此, 泛素介导的蛋白质降解途径的异常与许多疾病, 如恶性肿瘤、肌肉萎缩等的发生密切相关。本综述主要从细胞周期、DNA修复和细胞凋亡几个方面来介绍泛素介导的蛋白降解与肿瘤发生之间的关系。
真核细胞内蛋白质的降解途径
真核细胞内蛋白质的降解途径 作者:valley 日期:2009-3-9 11:13:00 1 推荐 真核细胞内蛋白质的降解途径主要有三种，溶酶体途径、泛素化途径和胱天蛋白酶(caspase)途径。 1、溶酶体途径：蛋白质在同酶体的酸性环境中被相应的酶降解，然后通过溶酶体膜的载体蛋白运送至细胞液，补充胞液代谢库。胞内蛋白：胞液中有些蛋白质的N端含有KFERQ信号，可以被HSC70识别结合，HSC70帮助这些蛋白质进入溶酶体，被蛋白水解酶降解。胞外蛋白：通过胞吞作用或胞饮作用进入细胞，在溶酶体中降解。 2、泛素-蛋白水解酶途径：一种特异性降解蛋白的重要途径，参与机体多种代谢活动，主要降解细胞周期蛋白Cyclin、纺锤体相关蛋白、细胞表面受体如表皮生长因子受体、转录因子如NF-KB、肿瘤抑制因子如P5 3、癌基因产物等；应激条件下胞内变性蛋白及异常蛋白也是通过该途径降解。该通路依赖ATP，有两步构成，即靶蛋白的多聚泛素化?多聚泛素化的蛋白质被26S蛋白水解酶复合体水解。 (1)、物质基础： 泛素(ubiquitin)：一种76个氨基酸组成的蛋白质，广泛存在于真核生物中，又称遍在蛋白。在一系列酶的作用下被转移到靶蛋白上，介导靶蛋白的降解。 蛋白水解酶(proteasome)：识别、降解泛素化的蛋白质的复合物，由30多种蛋白质及酶组成，其沉降系数为26S，又称26S蛋白酶体，由20S的圆柱状催化颗粒和19S的盖状调节颗粒组成，是一个具有胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、胱天蛋白酶等活性的多功能酶。所有蛋白酶体的活性中心都含有Thr残基。经泛素化的底物蛋白可以被26S蛋白酶体的盖状调节颗粒识别，并被运送到20S的圆柱状核心内，在多种酶的作用下水解为寡肽，最后从蛋白酶体中释放出来。泛素则在去泛素化酶的作用下与底物解离后回到胞质重新利用。 (2)、具体过程： ①靶蛋白的多聚泛素化：泛素激活酶E1利用ATP在泛素分子C端Gly残基与其自身的半胱氨酸的SH间形成高能硫脂键，活化的泛素再被转移到泛素结合酶E2上，在泛素连接酶E3的作用下，泛素分子从E2转移到靶蛋白，与靶蛋白的Lys的ε-NH2形成异肽键，接着下一个泛素分子的C-末端连接到前一个泛素的lys48上，完成多聚泛素化(一般多于4个) ②多聚泛素化的蛋白质被26S蛋白水解酶复合体水解：经泛素化的底物蛋白可以被26S蛋白酶体的盖状调节颗粒识别，并被运送到20S的圆柱状核心内，在多种酶的作用下水解为寡肽，最后从蛋白酶体中释放出来。泛素则在去泛素化酶的作用下与底物解离后回到胞质重新利用。 3、胱天蛋白酶(caspase)途径：细胞凋亡的蛋白质降解途径。 Caspase的含义指该类蛋白酶的活性部位为极为保守的半胱氨酸(cysteine)及特异性切割底物的天冬氨酸(aspase),简称caspase。根据其具体功能分为调控caspase(caspase1,2,4,5,8,9,10)和效应caspase(caspase3,6,7,11)。 Caspase以酶原形式存在于正常细胞中，细胞凋亡启动后被激活。一条途径是由死亡信号分子和受体结合后的
蛋白质的泛素化降解总结
仅作参考，如有抄袭，依法追究目录： 1.研究背景 2.泛素化降解途径 2.1泛素的基本结构 2.2泛素化的过程 2.3 E3酶对蛋白底物的识别 2.4 蛋白底物在26S蛋白酶体中的降解 3.研究的意义以及应用 4.研究展望
真核生物细胞中的蛋白质泛素化降解 摘要： 蛋白质是执行生命活动的基本分子,细胞中的蛋白质不断地处于合成、修饰与降解的代谢更新过程中。保持细胞正常的蛋白质代谢对于生命的正常功能至关重要。目前所知蛋白质的降解主要通过两种途径:溶酶体降解途径和泛素介导的蛋白酶体降解途径。溶酶体降解途径是一个非选择的蛋白质降解途径,主要降解通过摄粒作用或胞饮作用进入细胞内的外源蛋白质;而泛素介导的途径是一个受到严格的时空调控的特异性蛋白质降解途径。泛素系统广泛存在于真核生物中，是精细的特异性的蛋白质降解体系。泛素是一种序列保守的小分子蛋白质，蛋白质与泛素结合后，被蛋白酶体通过消耗ATP的方式降解。泛素系统由泛素、26S 蛋白酶体、多种酶（E1、E2、E3去泛素酶等）组成。其中E1和E2被称为泛素活化酶和泛素载体酶。泛素连接酶E3负责连接泛素与特异性底物，这样泛素化底物可以被26S蛋白酶体降解为若干肽段。泛素系统在真核生物中有非常重要的作用，通过降解蛋白质，调节细胞的分化、免疫，参与转录、分泌调控和细胞形成等，与人类的某些疾病有关。本文就泛素系统的组成、调控机制和研究进展做一介绍。 关键字：泛素系统；E3；26S蛋白酶体 正文： 1.研究背景 蛋白质在细胞内的降解是一个复杂的过程，但是又是一个高度有序的过程。真核生物中蛋白质的降解绝大多数都是由泛素系统完成。蛋白质首先是由泛素分子所特异性识别结合，在泛素分子的介导下，由泛素活化酶E1、泛素载体蛋白E2以及泛素连接酶E3特异性作用，与26S蛋白酶体作用，被切割成多肽。多聚泛素链可以还原成单体，循环使用。泛素与细胞的多种生命活动有关，例如细胞生长发育过程中组织抑制因子的选择性降解；细胞周期中，周期蛋白选择性降解等。许多疾病和泛素化的过程有关，利用泛素系统治疗疾病也成为了热点。 2.泛素蛋白酶系统 2.1泛素的基本结构 泛素是一种热稳定性蛋白，含有76个氨基酸，相对分子质量8.6kDa。结构保守，如图一是人和酵母细胞中泛素分子序列比对，我们可以看到，只有三个氨基酸的差别。 图一人和酵母的泛素分子序列比对
(完整版)泛素化蛋白检测方法
泛素化蛋白检测方法 ●蛋白质泛素化简介 蛋白质泛素化修饰过程在人体免疫系统调节过程中起到了关键性的作用。与磷酸化修饰过程一样，泛素化修饰过程也是一种可逆的共价修饰过程，它能够调节被修饰蛋白的稳定性、功能活性状态以及细胞内定位等情况。 泛素蛋白是一个由76个氨基酸残基组成的非常保守的多肽，它能在E1、E2、E3酶等一系列酶促反应催化下与细胞内靶蛋白上的一个或多个赖氨酸残基发生共价连接。泛素蛋白本身也含有7个赖氨酸残基，因此它们之间也可以通过这些位点互相连接，形成多泛素蛋白链（polyubiquitin chain）。目前研究显示，如果多泛素蛋白链与被修饰蛋白上的第48位赖氨酸残基相连，会介导靶蛋白进入蛋白酶体而被降解；如果与被修饰蛋白上其它位点，比如第63位赖氨酸残基相连，则靶蛋白可以发挥信号通路功能而不会被降解。 与磷酸化修饰途径一样，泛素化修饰途径也是可逆的，即可以通过去泛素化酶（DUB）将泛素蛋白修饰物去除掉。靶蛋白经泛素化途径修饰之后，连接在靶蛋白上的泛素蛋白单体或多聚体可以被各种泛素蛋白结合结构域（UBD）所识别和结合。人类蛋白质组中含有两种E1酶、50种E2酶、600种E3酶、90种DUB酶和20种UBD，这说明泛素修饰途径在细胞调控中起到了多么重要的作用。E3酶是泛素修饰途径中决定底物特异性的关键酶，它可以分为两大类，即含有HECT结构域的E3酶和其它含有RING结构域或RING样结构域（比如U-box或PHD结构域）的E3酶。这两种E3酶都在免疫调控过程中起到了关键性的作用。 ●蛋白质泛素化的检测方法 研究蛋白质的泛素化首先需要明确的三个基本点：哪些蛋白发生了泛素化；发生了泛素化的蛋白质，具体是哪个位点的赖氨酸残基发生了泛素化；进行定量。 明确了上述几点后，进一步需要弄清楚的是，我们感兴趣的泛素化蛋白，是如何发生泛素化的，影响这一泛素化过程的关键分子是什么？或者说这一过程中的E3酶是什么？
去泛素化在NF-κB信号通路调节中的作用
去泛素化在NF-κB信号通路调节中的作用 Edward W Harhaj1, Vishva M Dixit2 1Department of Microbiology and Immunology, Sylvester Comprehensive Cancer Center, The University of Miami, Miller School of Medicine, 1550 NW 10 Avenue, Miami, FL 33136, USA; 2Department of Physiological Chemistry, Genentech Inc., 1 DNA Way,South San Francisco, CA 94080, USA 核因子kappa B（NF-κB）是一种非常关键的调控因子，参与多种生物功能，包括先天和适应性的免疫以及细胞的生存等。NF-κB的激活严格受到一种慢性信号的调节，这一信号会导致持续性的炎症以及癌症。由关键信号分子E3连接酶介导的泛素化途径对NF-κB信号通路具有重要的调控作用。去泛素化(DUBs)可抵抗E3连接酶，因此在下调NF-κB信号通路以及维持稳态时，其有重要的作用。通过特异的去泛素化，如A20和CYLD，可以了解NF- κB信号通路的下调途径，进而为慢性疾病以及癌症提供治疗的可能。 核因子kappa B(NF-κB)/Rel代表了一种真核转录因子家族，这一家族是基因的主要调控因子，可以控制先天和适应性的免疫反应。NF-κ B 家族的蛋白都含有约300个氨基酸组成的RHD 结构域，这一结构域包括DNA结合区、核定位区以及二聚化区。NF-κ B 家族成员可以形成同源或异源的二聚体，包括p65/RelA, c-Rel, RelB, p105/p50 以及p100/p52。在细胞质中，NF-κB被抑制蛋白或IκBs抑制，所以呈现非活性状态，这些抑制蛋白可以阻止NF-κB的核定位以及与DNA的结合。IκB家族成员包括IκBα, IκBβ, IκBε, NF-κB1, NF-κB2, IκB δ (或称为MAIL)以及Bcl-3,这些成员都包含锚定重复结构域，可以与NF-κB的亚基结合。虽然大多数的IκBs抑制NF-κB的活性，但是在细胞核中IκBδ和Bcl-3可以使N F-κB发生反式激活。NF-κB1和NF-κB2蛋白（也被称为p105和 p100）是p50和p52 NF-κB亚基的前体形式。 存在两种不同的NF-κB信号途径，经典途径和非经典途径，它们具有不同的作用。在经典的NF-κB信号途径中，促炎症因子，如TNF-α或IL-1β,或病原体（如细菌脂多糖LPS）可以引起NF-κB亚基快速的核定位。在很多生理过程中，如先天和适应性的免疫以及细胞生存，经典的NF-κB信号途径具有重要作用。多种刺激物可以激活经典的NF-κB信号通路，这些刺激物都可以使IκB激酶激活，IκB激酶包含两个催化亚基IKKα和IKKβ以及调节亚基IKK γ（也被称为NEMO）。在激活NF-κB信号通路的过程中，IKKβ和IKKγ亚基是非常关键的，必不可少的。IKK可以磷酸化IκB蛋白N端的2个丝氨酸残基，引起IκB的泛素化，导致其被蛋白酶体降解，最终NF-κB进入核中，激活靶基因的转录。在应答特异刺激物比如促炎症细胞因子时，NF-κB被短暂激活，因为NF-κB会引起负反馈调节，包括抑制蛋白的表达比如IκBα，其可以下调NF-κB信号通路。NF-κB反应的终止非常关键，它可以阻止持续性NF-κB活性，因为NF-κB活性可以导致慢性炎症以及肿瘤的发生。 在非经典途径中，NF-κB2可以被蛋白酶体加工形成p52，其可以与RelB相互作用进而调节一类控制B淋巴细胞存活及淋巴器官再生成的靶基因。非经典途径由一类超家族配体引起，比如BAFF、LT-β、CD40L。在非经典途径中MAP3激酶MAP3K14，也被称为NF-κB诱导激酶或NIK，具有非常重要的作用。在多数细胞中，NIK水平极低时，NIK主要由翻译后修饰调
泛素化途径
这是一般蛋白质降解的一般泛素化途径，首先，在ATP供能的情况下，泛素的C末端与非特异性泛素激活酶E1的半胱氨酸残基共价结合，形成E1-泛素复合体。E1泛素复合体再将泛素转移给另一个泛素结合酶E2。E2则可以直接将泛素转移到靶蛋白赖氨酸残基的ε-氨基团上，在通常情况下，靶蛋白泛素化需要一个特异的泛素蛋白连接酶E3。当第一个泛素分子在E3的催化下连接到靶蛋白上以后，另外一些泛素分子相继与前一个泛素分子的赖氨酸残基相连，逐渐形成一条多聚泛素链。然后，泛素化的靶蛋白被一个相对分子质量很大的称为proteasome的蛋白质复合体逐步降解。多聚泛素也将解聚为单个泛素分子，重新被利用。 细胞周期各个时相的过渡需要细胞周期蛋白（细胞周期蛋白cyclin、细胞周期依赖激酶CDK, 及CDKs抑制蛋白等）其他蛋白质的降解,而这些蛋白的降解又与泛素化途径密不可分，因此泛素化途径与细胞周期有着十分密切的关系。 泛素(ubiquitin)是一种存在于大多数真核细胞中的小蛋白。它的主要功能是标记需要分解掉的蛋白质，使其被水解。当附有泛素的蛋白质移动到桶状的蛋白酶的时候，蛋白酶就会将该蛋白质水解。泛素也可以标记跨膜蛋白，如受体，将其从细胞膜上除去。泛素76个氨基酸组成，分子量大约8500道尔顿。它在真核生物中具有高度保留性，人类和酵母的泛素有96%的相似性，只差三个氨基酸。C-terminal是GG β-Grasp 需要被蛋白酶体降解的蛋白质会先被连接上泛素作为标记，即蛋白质上的一个赖氨酸与泛素之间形成共价连接。这一过程是一个三酶级联反应，即需要有由三个酶 闭锁小带（zonula occludens）又称紧密连接。它是由网格样的封闭索（sealing strand）连接而成的。封闭索是由相邻细胞膜内连接起来的膜蛋白构成。它是闭锁小带的封闭成分，由两排蛋白质颗粒紧密粘着、状似拉链，且不留细胞间隙。封闭索之间的细胞间隙约为 10-15nm。 闭锁小带具有封闭细胞间隙的作用，是阻碍物质扩散的屏障，使细胞和外部的体液分隔。闭锁小带在细胞层内具有透性屏障（permeability barrier）的功能，如小肠肠腔内保留大量的内含物，通过上皮细胞层选择性地输送营养物质，经过细胞间隙后再进入血液。经两组不同的特异性细胞膜进行运送，一组膜是位于上皮细胞的顶端表面，使分子泵入细胞内；另一组膜是位于细胞的基部和两侧，称基侧面，使分子从细胞的基侧面泵出。泵送过程有一定的方向，从细胞顶端泵入的分子不能扩散到细胞的基侧面，而从细胞的基侧面泵出的分子也不能扩散到细胞的顶端。这样，闭锁小带可以防止输送的分子漏出到肠腔，发挥透性障体的功能。 蛋白酶体(proteasomes) 是在真核生物和古菌中普遍存在的，在一些原核生物中也存在的一种巨型蛋白质复合物。在真核生物中，蛋白酶体位于细胞核和细胞质中。蛋白酶体的主要作用是降解细胞不需要的或受到损伤的蛋白质，这一作用是通过打断肽键的化学反应来实现。 从结构上看，蛋白酶体是一个桶状的复合物，包括一个由四个堆积在一起的环所组成的“核心”（右图中蓝色部分），核心中空，形成一个空腔。其中，每一个环由七个蛋白质分子组成。中间的两个环各由七个β亚基组成，并含有六个蛋白酶的活性位点。这些位点位于环的内表面，所以蛋白质必须进入到蛋白酶体的“空腔”中才能够被降解。外部的两个环各含有七个α亚基，可以发挥“门”的作用，是蛋白质进入“空腔”中的必由之路。
泛素化蛋白检测方法
泛素化蛋白检测方法 蛋白质泛素化简介 蛋白质泛素化修饰过程在人体免疫系统调节过程中起到了关键性的作用。与磷酸化修饰过程一样，泛素化修饰过程也是一种可逆的共价修饰过程，它能够调节被修饰蛋白的稳定性、功能活性状态以及细胞内定位等情况。 泛素蛋白是一个由76个氨基酸残基组成的非常保守的多肽，它能在E1、E2、E3酶等一系列酶促反应催化下与细胞内靶蛋白上的一个或多个赖氨酸残基发生共价连接。泛素蛋白本身也含有7个赖氨酸残基，因此它们之间也可以通过这些位点互相连接，形成多泛素蛋白链（polyubiquitin chain）。目前研究显示，如果多泛素蛋白链与被修饰蛋白上的第48位赖氨酸残基相连，会介导靶蛋白进入蛋白酶体而被降解；如果与被修饰蛋白上其它位点，比如第63位赖氨酸残基相连，则靶蛋白可以发挥信号通路功能而不会被降解。 与磷酸化修饰途径一样，泛素化修饰途径也是可逆的，即可以通过去泛素化酶（DUB）将泛素蛋白修饰物去除掉。靶蛋白经泛素化途径修饰之后，连接在靶蛋白上的泛素蛋白单体或多聚体可以被各种泛素蛋白结合结构域（UBD）所识别和结合。人类蛋白质组中含有两种E1酶、50种E2酶、600种E3酶、90种DUB 酶和20种UBD，这说明泛素修饰途径在细胞调控中起到了多么重要的作用。E3酶是泛素修饰途径中决定底物特异性的关键酶，它可以分为两大类，即含有HECT结构域的E3酶和其它含有RING结构域或RING样结构域（比如U-box 或PHD结构域）的E3酶。这两种E3酶都在免疫调控过程中起到了关键性的作用。
蛋白质泛素化的检测方法 研究蛋白质的泛素化首先需要明确的三个基本点：哪些蛋白发生了泛素化；发生了泛素化的蛋白质，具体是哪个位点的赖氨酸残基发生了泛素化；进行定量。 明确了上述几点后，进一步需要弄清楚的是，我们感兴趣的泛素化蛋白，是如何发生泛素化的，影响这一泛素化过程的关键分子是什么？或者说这一过程中的E3酶是什么？ 然后需要研究的是，这一蛋白质发生泛素化之后可以产生那些分子效应？对下游的信号通路有什么影响？ 研究上述内容的实验方法和实验流程： 方法一：western blot and strip 通过WB检测所有发生泛素化的蛋白条带，拍照后，将膜strip。然后与特定蛋白的抗体和特定泛素化位点的抗体反应，显色拍照。通过阳性条带的对比来初步判断某一特定蛋白的特定位点发生了泛素化。【具体实验流程附后】 方法二：western blot and immunoprecipitations 通过免疫共沉淀方法将某一特定蛋白以及与其结合的蛋白分离出来。分离出来的蛋白再进行SDS电泳和western blot分析。【具体实验流程附后】。这一方法可以明确具体哪个蛋白的哪个赖氨酸残基发生了泛素化修饰。 方法三：in vitro ubiquitination assay 将要研究的目的基因转染293细胞，使其大量表达。24h后提取并分离目的蛋白。在体外反应buffer中
瘦素通过GSK3介导的OMA1泛素化降解途径增加OPA1表达以提高骨髓间充质干细胞的抗凋亡能力
瘦素通过GSK3介导的OMA1泛素化降解途径增加OPA1表达以提 高骨髓间充质干细胞的抗凋亡能力 研究背景及目的急性心肌梗死引起心肌细胞缺血缺氧性损害,出现程序性凋亡或坏死,产生左室病理性扩张及左室射血分数降低。心肌细胞再生能力有限导致心肌梗死区的死亡心肌细胞被成纤维细胞替代,产生无收缩功能的胶原瘢痕组织,最终导致缺血性心肌病、心力衰竭的发生。 骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)治疗急性心肌梗死的治疗效果已在许多大型灵长类动物实验及临床试验中得到证实。MSCs具有低免疫 原性、多向分化潜能、干性维持及获取方便等优势。 但是,心梗后不利的微环境导致移植到心梗周边区的细胞存活率很低,这成 为MSCs有效治疗的瓶颈。我们团队以往的研究发现缺氧预处理(hypoxia preconditioning,HP)的MSCs的存活能力明显增强,通过对正常培养的MSCs和缺氧预处理MSCs两组细胞的基因组芯片分析,发现缺氧预处理能明显上调MSCs的瘦素(leptin)水平,并且提出瘦素可能参与了 MSCs治疗心肌梗死的作用。 然而,瘦素是否通过独立保护MSCs抗凋亡而促进其疗效以及相应的分子机 制尚不清楚。为此,本博士研究课题将首先着力于证实瘦素是否具有保护MSCs 抗凋亡的作用。 线粒体的形态结构和稳态的维持是细胞存活的必要条件。线粒体脊结构破坏将导致其中富含的许多前凋亡因子从线粒体中释放到胞浆,而启动凋亡信号通路。 线粒体稳态(融合与分裂)的动态平衡是维持正常细胞线粒体功能的重要条件,线粒体分裂有利于清除细胞内受损的线粒体,但过度分裂也会启动线粒体自 噬导致细胞凋亡。瘦素是脂肪细胞分泌的肽类激素,在平衡能量代谢、神经内分
泛素化蛋白检测方法
泛素化蛋白检测方 法
泛素化蛋白检测方法 蛋白质泛素化简介 蛋白质泛素化修饰过程在人体免疫系统调节过程中起到了关键性的作用。与磷酸化修饰过程一样，泛素化修饰过程也是一种可逆的共价修饰过程，它能够调节被修饰蛋白的稳定性、功能活性状态以及细胞内定位等情况。 泛素蛋白是一个由76个氨基酸残基组成的非常保守的多肽，它能在E1、E2、E3酶等一系列酶促反应催化下与细胞内靶蛋白上的一个或多个赖氨酸残基发生共价连接。泛素蛋白本身也含有7个赖氨酸残基，因此它们之间也能够经过这些位点互相连接，形成多泛素蛋白链（polyubiquitin chain）。当前研究显示，如果多泛素蛋白链与被修饰蛋白上的第48位赖氨酸残基相连，会介导靶蛋白进入蛋白酶体而被降解；如果与被修饰蛋白上其它位点，比如第63位赖氨酸残基相连，则靶蛋白能够发挥信号通路功能而不会被降解。 与磷酸化修饰途径一样，泛素化修饰途径也是可逆的，即能够经过去泛素化酶（DUB）将泛素蛋白修饰物去除掉。靶蛋白经泛素化途径修饰之后，连接在靶蛋白上的泛素蛋白单体或多聚体能够被各种泛素蛋白结合结构域（UBD）所识别和结合。人类蛋白质组中含有两种E1酶、50种E2酶、600种E3酶、90种DUB 酶和20种UBD，这说明泛素修饰途径在细胞调控中起到了多么重
要的作用。E3酶是泛素修饰途径中决定底物特异性的关键酶，它能够分为两大类，即含有HECT结构域的E3酶和其它含有RING 结构域或RING样结构域（比如U-box或PHD结构域）的E3酶。这两种E3酶都在免疫调控过程中起到了关键性的作用。 蛋白质泛素化的检测方法 研究蛋白质的泛素化首先需要明确的三个基本点：哪些蛋白发生了泛素化；发生了泛素化的蛋白质，具体是哪个位点的赖氨酸残基发生了泛素化；进行定量。 明确了上述几点后，进一步需要弄清楚的是，我们感兴趣的泛素化蛋白，是如何发生泛素化的，影响这一泛素化过程的关键分子是什么？或者说这一过程中的E3酶是什么？ 然后需要研究的是，这一蛋白质发生泛素化之后能够产生那些分子效应？对下游的信号通路有什么影响？ 研究上述内容的实验方法和实验流程： 方法一：western blot and strip 经过WB检测所有发生泛素化的蛋白条带，拍照后，将膜strip。然后与特定蛋白的抗体和特定泛素化位点的抗体反应，显色拍照。经过阳性条带的对比来初步判断某一特定蛋白的特定位点发生了泛素化。【具体实验流程附后】 方法二：western blot and immunoprecipitations 经过免疫共沉淀方法将某一特定蛋白以及与其结合的蛋白分