基因操作-1
1.2 基因工程操作的基本步骤
高二年级生物【选修】教学案____年____月____日/第____周/第____课时
启动子是位于的一段序列，是的部位。
终止子是，是载体上的核苷酸序列。
标记基因是为了鉴别受体细胞中是否含有，以便筛选出含有的细胞，如抗生素基因。
】目的基因与载体结合可能形成几种不同的结果？
】如何避免目的基因或载体的自身环化？
线性DNA 分子的酶切示意图 科学家将外源目的基因与大肠杆菌的质粒进行重组，并在大肠杆菌中成功表达。
下图表示构建重组质粒和筛选含目的基因的大肠杆菌的过程。
请据图回答问题：
请据上图回答： 基因工程的核心步骤是。
图中位于基因的首端，是识别和结合的部位。
抗生素基因的作用是作为，用于鉴别
受体细胞中是否导入了目的基因。
作为目的基因的运载体
应具备的结构是。
高中生物 1 基因工程 1.2 基因工程的基本操作程序课后习题 新人教版选修3
1.2基因工程的基本操作程序1.下列获取目的基因的方法中需要模板的是( )①从基因文库中获取目的基因②利用PCR技术扩增目的基因③反转录法④通过DNA 合成仪利用化学方法直接人工合成DNAA.①②③④B.①②③C.②③④D.②③解析:PCR技术利用的是DNA双链复制原理。
即将DNA双链之间的氢键打开,变成单链DNA,需要以每条单链DNA作为模板。
反转录法是以目的基因转录成的信使RNA为模板,在逆转录酶的作用下,先反转录形成互补的单链DNA,再合成双链DNA。
①④则均不需要模板。
答案:D2.下列关于基因文库的说法,错误的是( )A.可分为基因组文库和部分基因文库B.cDNA文库属于部分基因文库C.基因组文库的基因在不同物种之间均可进行基因交流D.同种生物的cDNA文库基因数量较基因组文库基因数量少解析:基因组文库只有部分基因能够在不同物种之间进行交流。
答案:C3.聚合酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。
PCR过程一般经历下述30多次循环:90~95 ℃使模板DNA变性、解链→55~60 ℃复性(引物与DNA模板链结合)→70~75 ℃引物链延伸(形成新的脱氧核苷酸链)。
下列有关PCR过程的叙述,不正确的是( )A.变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键,也可利用解旋酶实现B.复性过程中引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成的C.延伸过程中需要热稳定DNA聚合酶催化不同核糖核苷酸之间形成磷酸二酯键D.PCR与细胞内DNA复制相比所需酶的最适温度较高解析:延伸过程需要四种脱氧核苷酸为原料,因此会在脱氧核苷酸之间形成磷酸二酯键。
答案:C4.下列有关PCR技术的说法,不正确的是( )A.PCR技术是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术B.PCR技术的原理与DNA复制的原理不同C.PCR技术的前提是有一段已知目的基因的核苷酸序列D.PCR技术除需特定的温度、原料、目的基因、热稳定DNA聚合酶等条件外,还需要根据已知核苷酸序列设计相应的引物解析:PCR体外扩增与细胞内DNA复制过程原理相同,都是DNA双链复制。
1[1].2基因工程的基本操作程序
![1[1].2基因工程的基本操作程序](https://img.taocdn.com/s3/m/2504a4836529647d2728521d.png)
1.2基因工程的基本操作程序经典例题剖析［例1］下列有关基因工程技术的正确叙述是A．重组DNA技术所用的工具酶是限制酶、连接酶和运载体B．所有的限制酶都只能识别同一种特定的核苷酸序列C．选用细菌作为重组质粒的受体细胞是因为细菌繁殖快D．只要目的基因进入了受体细胞就能成功实现表达【解析】基因操作的工具有限制酶、连接酶，一种限制酶只能识别特定的核苷酸序列。
运载体是基因的运输工具，目的基因进入受体细胞后，受体细胞表现出特定的性状，才说明目的基因完成了表达，基因工程的结果是让目的基因完成表达，生产出目的基因的产物，选择受体细胞的重要条件就是能够快速繁殖。
【答案】C［例2］应用基因工程技术诊断疾病的过程中必须使用基因探针才能达到探测疾病的目的。
基因探针是指A．用于检测疾病的医疗器械B．用放射性同位素或荧光分子等标记的DNA分子C．合成β—球蛋白的DNAD．合成苯丙羟化酶DNA片段【解析】基因诊断是用放射性同位素、荧光分子等标记的DNA作探针，利用DNA分子杂交原理，鉴定被检测标本上的遗传信息，达到检测疾病的目的。
基础试题训练1、构建基因组DNA文库时，首先雷分离细胞的A、染色体DNAB、线粒体DNAC、总mRNAD、tRNA2．在基因工程中，把选出的目的基因（共1000个脱氧核苷酸对，其中腺嘌岭脱氧核苷酸是460个）放入DNA扩增仪中扩增4代，那么，在扩增仪中应放入胞嘧啶脱氧核苷酸的个数是( )A.540个B.8100个C.17280个D.7560个2．在基因工程中，科学家常用细菌、酵母菌等微生物作为受体细胞，原因是（）A.结构简单，操作方便B.遗传物质含量少C. 繁殖速度快D.性状稳定，变异少3．因工程的操作步骤：①使目的基因与运载体相结合，②将目的基因导入受体细胞，③检测目的基因的表达是否符合特定性状要求，④提取目的基因，正确的操作顺序是（）A．③②④① B.②④①③C．④①②③D．③④①②4．工程是在DNA分子水平上进行设计施工的，在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是（）A．人工合成基因B．目的基因与运载体结合C．将目的基因导入受体细胞D．目的基因的检测和表达5．就分于结构而论，质粒是A、环状双链DNA分子B、环状单链DNA分于C、环状单链RNA分子D、线状双链DNA分子6．聚合酶链反应可表示为A、PECB、PERC、PDRD、PCR7．在已知序列信息的情况下，获取目的基因的最方便方法是A、化学合成法B、基因组文库法C、C DNA文库法D、聚合酶链反应8．有关基因工程的叙述正确的是（）A.限制性内切酶只在获得目的基因时才用B.重组质粒的形成在细胞内完成C.质粒都可作运载体D.蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料9．不属于目的基因与运载体结合过程的是（）A．用一定的限制酶切割质粒露出黏性末端B．用同种限制酶切割目的基因露出黏性末端C. 将重组DNA导入受体细胞中进行扩增D．将切下的目的基因插入到质粒切口处10．科学家通过基因工程的方法，能使马铃薯块茎含有人奶蛋白。
4第四章 基因克隆的载体-1质粒
4、载体分子中有一段不影响它们扩增的非必须区域， 插入其中的外源基因可以象载体的正常组分一样进行 复制和扩增； 5、具有较好的安全性，不能任意转移，避免基因非控 制性扩增。
载体的种类和特征
（二）根据质粒自身传递的性质分为两大类： 1、结合型质粒：能自我复制，含转移基 因组，可自我控制质粒从一个寄主细胞传到 另一个寄主细胞。 如：F质粒，部分R质粒、Col质粒。 2、非结合型质粒：能自我复制，不含转 移基因组，不能自主在细胞间传递。 如：R质粒、Col质粒
（三）根据质粒的复制特性分为两大类： 1、严紧型质粒：是一类低拷贝数的质粒， 每个细胞中仅含有一个或几个质粒； 拷贝（数）是指一种质粒在一个寄主细 胞中存在的数目。 2、松弛型质粒：是高拷贝数的质粒， >20拷贝/细胞。该类基因工程中常用。
Example: a. 在pBR322质粒的BamHⅠ或SalⅠ位点 插入外源DNA片断，切断了tetr基因编码 序列的连续性，使之失去活性，产生出 AmprTets表型的重组pBR322质粒，转化 入AmpsTets的大肠杆菌细胞。先涂布在 含氨苄青霉素的选择培养基上，筛选出 具Ampr菌落，再将它们涂布于含四环素 的选择性培养基上。插入外源片断的重 组质粒不能在这种培养基上生长。
它的分子量为4363bp。克隆载体的大小不要超 过10kb。 2、具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的
选择记号。
共有24种核酸内切酶识别位点（单一的）。其中7种 内切酶的识别位点在四环素抗性基因内部，2种识 别位点在于这个基因的启动区内，所以9个限制酶 切位点插入外源片断可以导致Tetr 基因的失活； 另外有3种限制酶在氨苄青霉素抗性基因Ampr有单一 的识别位点，
第3章第1节第2课时基因工程的基本操作程序课件--苏教版2019 高中生物选择性必修3
(2)从RNA方面检测受体细胞 ①方法：分子杂交技术。 ②操作：从待测转基因生物细胞中提取mRNA分子，用已标记 的目的基因片段 作为探针与mRNA杂交，观察是否出现杂交带。
(3)从蛋白质方面进行检测 ①方法：抗原—抗体杂交 。 ②操作：从待测转基因生物中提取蛋白质，再用相应的抗体进 行抗原—抗体杂交，观察是否出现 杂交带。 (4)从个体水平进行鉴定：检测转基因生物是否表现出目的基因 控制的性状。
③过程 将目的基因插到农杆菌Ti质粒的 TDNA 特定区段上→转入 农杆菌→侵染植物细胞→整合到受体细胞染色体的 DNA 上→目的 基因稳定的遗传和表达
(2)将目的基因导入动物细胞 ①主要方法：显微注射法。 ②操作对象： 受精卵。 ③其他方法：也可用 病毒DNA 与目的基因一起构建的载体， 去感染受体动物细胞。
限制酶 BamHⅠ
HindⅢ
EcoRⅠ
Sma Ⅰ
识别序
列及切
割位点
图2 图1
①构建基因表达载体时，能否用Sma Ⅰ酶切割质粒？为什么？
提示：不能；因为Sma Ⅰ会破坏质粒的抗性基因。质粒上的抗 性基因是标记基因，便于重组DNA分子的筛选，若被破坏，无法进 一步筛选。
②与只使用EcoRⅠ相比较，使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶 同时处理质粒、外源DNA的优点是什么？
NO.1 必备知识·聚焦概念
一、基因工程的基本操作程序 1．目的基因的获取 (1)通过化学合成法直接人工合成目的基因 ①对于比较小的目的基因，在明确脱氧核苷酸序列后，可以通 过DNA合成仪直接人工合成。 ②全基因或较大基因，使用半合成 的生物体 全部基因片段 的重组DNA 的克隆群体。 特点：受体菌群中的不同个体含有该种生物的不同基因拷贝， 整个菌群所含有的基因拷贝便可能涵盖了该生物的所有基因 。 筛选方法：一般采用核酸探针杂交 的方法。
2024届高考一轮复习生物课件(人教版)：基因工程的基本工具和基本操作程序
4.目的基因的检测与鉴定
拓展 提升科学思维
PCR是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各 种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。在 该过程中，引物非常关键，回答下列有关引物的问题： (1)什么是引物？ 提示 引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。 (2)PCR技术为什么需要引物？ 提示 DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3′端延伸DNA链。
拓展 提升科学思维
构建基因表达载体时，需要选择合适的限制酶切割含有目的基因的DNA
片段和载体。
已知限制性内切核酸酶Ⅰ的识别序列和切点是
，限制性内切
核酸酶Ⅱ的识别序列和切点是
，根据图示分析回答下列问题：
(1)请用图示法写出限制性内切核酸酶Ⅰ和限制性内切核酸酶Ⅱ切割后形 成黏性末端的过程。
提示 限制性内切核酸酶Ⅰ： 限制性内切核酸酶Ⅱ：
本质
DNA
DNA
mRNA
mRNA
位置 目的基因上游 目的基因下游 mRNA首端 mRNA尾端
RNA聚合酶识 别和结合的部 功能 位，驱动基因 转录出mRNA
翻译的起始 使转录在所需要
信号(编码氨 的地方停下来
基酸)
翻译的结束信 号(不编码氨 基酸)
3.将目的基因导入受体细胞
生物种类
植物
动物
微生物
常用方法 农杆菌转化法、花__粉__管__通__道__法__ 显微注射法 Ca2＋ 处理法
(6)若一个DNA分子在PCR中经过n轮循环，理论上需要消耗多少个引物？ 第n轮循环需要消耗多少个引物数？ 提示 经过n轮循环需要消耗引物数为(2n＋1－2)个，第n轮循环需要消耗 的引物数为2n个。
第三章大肠杆菌基因工程-1
Plac -lacI 调控模式的问题与策略
问题1： 葡萄糖是宿主最适碳源，而启动子受葡萄糖阻遏， 不便于发酵培养基设计 对策： 采用突变型Plac UV5（不受葡萄糖阻遏）
突变型乳糖启动子Plac UV5
CAP正调控
野生型的Plac上游附近拥有
代谢激活蛋白（CAP）结合 区，cAMP激活CAP，CAP 结合启动子控制区，进而促 Plac O cAMP 高效转录
目的基因
cI857 PL B
吲哚丙烯酸，IAA）。
T7启动子 ——来自T7噬菌体的异源启动子
T7启动子——最成功的启动子
*只有T7 RNA 聚合酶才能识别 T7 启动子 * T7 RNA 聚合酶合成 mRNA 的速度比大肠杆菌RNA 聚合
酶的快 5 倍
*由于大肠杆菌本身不含 T7 RNA 聚合酶 ，需要将外源的 T7 RNA 聚 合酶引入宿主菌。 *通过调控T7 RNA 聚合酶 的表达间接调控外源基因的表达 *以 Novagen 公司的 pET 系统为杰出代表。
P
O
乳糖启动子Plac
转录受 CAP 正调控和 lacI 负调控 lacI 负调控
野生型的Plac与其控制区Olac 偶联在一起，在没有诱导物 存在时，整个操纵子处于基 底水平表达；诱导物可以使 启动子Plac介导的转录大幅 提高 高效转录 P 乳糖 异丙基-b-D-硫 代半乳糖苷（IPTG） 诱导 O 基底水平转录 阻遏蛋白
Ptac = 3 Ptrp = 11 Plac
启动子的筛选
采用鸟枪法策略，将合适大小的DNA片段 克隆到启动子探针质粒pKO1上 宿主细胞染色体DNA上的galE、galT与质
Apr pKO1 galK
粒上报告基因galk的表达产物联合作用，
第一代基因编辑ZFN
ZFN应用实例2
• 2013年复旦大学朱焕章等首次利用ZFN技术证实一种HIV治疗策略的有效性。 研究人员设计并获得了一对能特异靶向多数HIV亚型基因保守区LTR的ZFN， 在多个HIV感染及潜伏细胞系上证实了ZFN能特异靶向HIV-1前病毒LTR并介导 整合的全长HIV-1前病毒的高效切除，获得了显著抗HIV感染的效果，提示了 该方法将可能为一个可选择的根除HIV的治疗手段。
染色体自发丢失；使用ZFN在
一条21号染色体上插入Xist基
因，使这整个染色体失去功能。
Hongmei Lisa Li, Takao Nakano, and Akitsu Hotta. (2014) Genetic correction using engineered nucleases for gene therapy applications. Development Growth Differentiation, 56(1): 63-77
+
非特异性 核酸内切酶
基因组编辑技术
简史
1993年前ZFN就已开始出现，为第一代基因编辑技术； 2009年底出现的TALEN短期内取代了ZFN，成为第二代基因编辑技术； 2012年CRISPR/Cas的出现，使得基因编辑大放异彩，基本取代了前两代基
因编辑技术，而且其系统还在进一步优化中。
荣誉
应用
定点突变，定点修饰（包括转基因），转录调控 基因治疗（如遗传病），中国、美国已经率先开启相关医学应用研究。 ……
第一代基因编辑技术——ZFNs
是一种常出现在DNA结合蛋白质中的一种结构基 元。锌螯合在氨基酸链中形成锌的指状结构。
第1课时 基因工程的操作工具
第1课时基因工程的操作工具第1课时基因工程的操作工具课程一.1 DNA重组技术的基本工具【课前导学】1.1 DNA重组技术的基本工具一、基因工程的原理：基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外赋予生物新的基因特征，创造更符合人们需求的新生物类型和生物产品。
因为基因工程是在水平水平上设计和建造的，所以也被称为基因工程。
二、限制性核酸内切酶1.切割DNA的工具是，也称为。
2、这类酶在生物体内能将外来的dna切断，即能够限制异源dna的侵入并使之失去活力，但对自己的dna却无损害作用，这样可以保持细胞原有的遗传信息。
3.由于这种切割是在DNA分子内进行的，因此被称为限制性内切酶（简称限制性内切酶）。
4.DNA分子的限制性内切酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式，即和。
三、dna连接酶――“分子缝合针”根据DNA连接酶的不同来源，它们可分为两类：一类是从大肠杆菌中分离得到的，称为e?colidna连接酶。
e?colidna连接酶只能将连接起来，不能将双链dna片段平末端之间进行连接。
另一种是从T4 DNA连接酶中分离出来的。
T4 DNA连接酶可以“缝合”互补和双链DNA片段，但连接效率相对较低。
四、基因进入受体细胞的载体――“分子运输车”1.在基因操作过程中，载体有两个用途：一是作为载体将目标基因转移到宿主细胞；第二种是利用它在宿主细胞中复制大量目标基因。
2、现在通常使用的载体是，它是一种相对分子质量较小、独立于拟核dna之外的环状dna，有的细菌中有一个，有的细菌中有多个。
3.质粒可以通过细菌之间的连接从一种细菌转移到另一种细菌，这种连接可以复制或整合到细菌假核DNA中，并通过假核DNA的复制进行复制。
4、其他载体还有和等。
5、作为载体必须具备以下条件：能在宿主细胞中复制并稳定保存；具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接；它有一些用于筛选的标记基因，如抗生素耐药基因、产品颜色反应基因等[摘要]归纳点1基因工程的概念基因工程的别名操作环境操作对象操作水平基本过程结果归纳点2基因工程的工具及其比较基因剪接技术或DNA重组技术→ 拼接→ 介绍→ 在生物体外的基因DNA分子水平上表达人类所需的基因产物1。
基因工程作业1
基因工程作业1.同尾酶和同裂酶有何区别？同尾酶是指许多不同的限制性内切酶切割DNA长生的末端是相同，且是对称的，即它们可以产生相同的粘性末端，这些酶统称为同尾酶。
同裂酶是识别相同序列的限制酶称同裂酶，但它们的切割位点可能不同，他切割的位点有以下几种①：同序同切酶，这些酶识别位点和切割位点都相同②：同序异切酶，识别的序列是相同的但它们的切割位点不同。
③：同功多位许多识别简并序列的限制酶包含了另一种限制酶的功能。
④：其他，识别的序列有交叉。
2.简述书上各种酶的催化活性与用途，上网查查是否还有其他工具酶，请在作业上用红色标明。
①：限制性内切酶：是一类能够识别双链DNA分子中的某一种特定的核苷酸序列，并在此处切割DNA双链的核酶作用：自我保护作用（细菌的修饰和保护系统）、在制备重组载体时经常用到限制性内切酶长生相同的粘性末端。
②：甲基化酶原核生物和真核生物中存在大量的甲基化酶，原核生物中的甲基化酶作为限制与修饰系统中的一员，用于保护宿主DNA不被相应的限制酶切割，甲基化酶可以在腺嘌呤或者嘧啶上引入甲基。
在转录修复系统中有依赖甲基化的错配修复。
③：DNA聚合酶主要活性是催化DNA的合成（在具备模板、引物、dNTP的情况下）及其向辅的活性。
用途：合成大量的DNA、进行末端标记、补平末端。
④：连接酶就是将两段核酸连接起来的酶，主要作用是连接双链DNA中的缺口，及切口。
⑤：核酸酶有核酸内切酶和核酸外切酶核酸外切酶是一类从多核苷酸链的一头开始按序催化降解核苷酸的酶。
分为单链核酸外切酶和双链核酸外切酶主要用途是催化单链DNA/RNA的降解，切掉双链中的单链区。
⑥反转录酶即依赖于RNA的DNA聚合酶，有5'-3'聚合酶活性,但没有有3'-5'的外切酶活性，主要作用：cDNA克隆中第一条链的合成、合成cDNA探针。
⑦琼脂糖酶：琼脂糖酶英文名称：agarase定义：催化琼脂糖的1，3-β-D-半乳糖糖苷键水解的酶。