柠檬苦素类化合物概述.

柑桔柠檬苦素类化合物的研究：一个综述
摘要：柑橘中柠檬苦素类似物是一种罕见的天然化合物。现已深入研
究了其生物化学性质，生物功能，在食品中的应用，在植物生理学中
的重要性，在不同植物物种和栽培品种的关系，副产品回收，和商业
应用。柠檬苦素类似物作为在食品中存在的潜在预防癌症的化合物，
有着很大的意义。本章总结了前人对柑橘中柠檬苦素类似物的化学和
生物化学研究，以及探讨了以柠檬苦素类似物在人类和植物健康中发
挥着的作用为研究方向的进一步研究项目。
柑橘类水果是世界上最受欢迎的食品之一，每年全球农业产量超
过1亿吨。作为一种被消耗的新鲜水果，柑橘的数量十分可观，越来
越多的消耗来自于柑橘的加工产品，比如果汁、浓缩果汁、柑橘类饮
料、其他食品等，都会消耗很多的水果。除了是一种受喜欢的水果外，
柑橘类水果已被证明具有许多对人体健康有重要影响的成分：维生素
C、类胡萝卜素、叶酸、黄酮类化合物、类柠檬苦素、钾、优质水溶
性纤维等等。然而，在处理柑橘产品中有一个长期存在的问题，即苦
味，尤其是橙汁和柚子汁中苦味更为明显。在不同的栽培品种中苦的
程度各不相同。果汁中存在的苦味使其有着较低的市场价值，有时用
吸附树脂处理，与其他无苦味的果汁混合，或丢弃。在柑橘类果汁中
苦味是由两种化合物导致：二氢黄酮新橙皮，如在柚子相关品种中发
现的柚皮苷，和类柠檬苦素（1,2）。
柠檬苦素类似物是于芸香科、楝科家族的植物中出现的高含氧的
三萜化合物。柠檬苦素作为这组植物化学物质中的第一大化合物，从
1841年以来已经被认为是柑橘的组成部分（3）。1938年从脐橙果汁
中得到分离（4），并在1949年（5）证明了脐橙果汁中的苦味原理。
柠檬苦素结构却是在发现该种物质的120年后才发现。其结构是通过
组合化学的方法和X-射线晶体学在20世纪60年代确定（6，7）。
柠檬苦素的化学成分是C26H30O8，分子质量是470。
柠檬苦素类化合物是柑桔类水果中已被证明具有生物活性的重
要的质量成分。一个柠檬苦素苷元在植物中作为病虫害抑制物发挥着
作用。当需要保护的组织受病原体攻击时它们在新叶和果实中都是丰
富的（8）。
由Guadagni等人进行的关于柠檬苦素味阈值的一个综合性研究
（9，10）。他们发现仔细筛选（苦味）的鉴定人一致能够在较低的
水平中检测出柠檬苦素。约30%的鉴定人能够在含柠檬苦素2 ppm的
果汁中品尝出苦味。75%能在6 ppm的柠檬苦素果汁中品尝出苦味，
这也被认定为是味觉阈值。柠檬苦素在早熟柑橘中尤为严重，比如脐
橙。脐橙果汁从早期到中期的中能够获得差不多25ppm的柠檬苦素
（11）。葡萄柚中柠檬苦素的含量也十分显著，在早期平均水平可达
到15 ppm以上（11）。
近几年，在对柠檬苦素的化学和生物化学研究中取得了重大进
步，也提供了一些关于柠檬苦素的新的信息。通过遗传工程来解决柑
橘果汁中柠檬苦素苦味问题也取得了进步。同时，柠檬苦素类化合物
也被证明在人类饮食中是重要的化合物。
柠檬苦素的分析应用
德雷尔（12）在柠檬苦素类化合物分析领域取得了几个重大贡献，
包括对柠檬苦素进行检测的薄层色谱分析和通过核磁共振（NMR）来
确定柠檬苦素类化合物结构。长谷川和班尼特利用这两种方法进行分
离和鉴定出30多个柠檬苦素糖苷配基和柑橘及其近缘种中的20种柠
檬苦素苷。
对柠檬苦素类化合物的检测和定量分析的重要分析技术是由
Fisher提出的高效液相色谱法（13）、曼塞尔和维勒提出的放射性
免疫测定（14），和Manners 和 Hasegawa最近提出的质谱法（15）。
大多数这些方法（除了RIA(放射性免疫测定)）需要使用有机溶剂萃
取，分区和固相萃取的样品制备。高效液相色谱法通过其准确性和可
重复性已成为最广泛使用的方法。正相和反相的方法已被用于等度和
梯度的研究方法（16）。
柑橘汁中的延迟苦味
通常来说，如果只食用新鲜的脐橙或者是挤压的果汁并立刻消耗
掉，是感觉不到脐橙的苦味的。然而，果汁榨汁后如果在室温下放置
或隔夜储存在冰箱里几个小时就会变苦。这种逐渐增加的痛苦，或延
迟苦味，在脐橙橙汁中是由从无味前体中形成的柠檬苦素造成的。这
种延迟苦味区别于发生在和蜜柚相关品种的黄烷酮新橙皮糖苷和柠
檬苦素的苦味。由于一定条件下产生的柠檬苦素，许多其他的冬季柑
橘也可能产生苦味的果汁。在柑橘和柑橘杂交种中分离出来了36种
柠檬苦素糖苷配基，其中只有6种是苦的（17）。柠檬苦素在大多数
柑橘类果汁中是主要的类柠檬苦素，也是造成延迟苦味的主要原因。
诺米林也包括其中，但它的作用很小（18）。其他的类柠檬苦素化合
物在商业柑橘类果汁中的浓度存在并不显著。
直到1968，延迟苦味的机制尚未完全理解。最初形成的理论由
Higby首次提出，他首次从华盛顿脐橙的橙汁中分离出柠檬苦素（4）。
多年来对前期理论支持的证据也得到积累。迈耶和贝弗利（1）最终
确定柠檬苦素单内酯为柑橘果实中柠檬苦素的前体。一环闭合反应在
酸性条件下，pH值低于6.5，并被酶（柠檬苦素D—环内酯水解酶）
催化（19）。延迟苦味在柑橘果汁生产中是一个重要的经济问题。它
降低了商品果汁的质量和价值，对柑橘产业有着显著的负面经济影
响。异常的天气和收获条件是造成水果组织破坏的原因，如冷冻或机
械收获损坏，可促进果实中的酸性pH，以及促进柠檬苦素中Α-环内
酯制造苦味。
不管是具有苦味的类柠檬苦素还是无苦味的类柠檬苦素，其结构
都显示出检测口中苦味的一些结构要求（17）。一些其他的甜和苦的
化合物可以改变检测柠檬苦素的苦味的界限（17）。 β-D-呋喃果糖
基-α-D-吡喃葡萄糖苷是柠檬苦素的弱化抑制。其他甜味剂如新橙皮
苷二氢查尔酮、橙皮甙二氢查尔酮，和天冬氨酰—苯丙氨酸甲酯也作
为抑制剂。柠檬酸在柠檬苦素苦味检测中发现有着明显的抑制作用。
柚皮苷，在柑橘中类黄酮苦味的原理，已被证明是一个苦味检测阈值
的抑制物。
柠檬苦素类化合物的生物合成
由Hasegawa等人在放射性示踪器的基础上，提出了柠檬苦素类
化合物的生物合成途径（20）。柑橘苗已被用来准备14 C标记的醋
酸甲羟戊酸诺米林标记（21）。诺米林最有可能是从柑橘及其杂交种
中分离出的所有其他类柠檬苦素的前体。诺米林是在韧皮部的茎组织
中生物合成，通过萜类化合物的合成途径，从醋酸甲羟戊酸到法尼基
焦磷酸（22）。然后是进入茎叶、果实中，果皮和种子，它是进一步
在各组织代谢的过程中使其他类柠檬苦素至少通过四个不同的通路：
柠檬苦素通路、卡拉敏通路、宜昌根辛通路、以及7-醋酸柠檬苦素
途径（23，24）。
在柑橘中有五类酶的参与柠檬苦素的生物合成和其生物降解
（24）。一类是只存在于柑橘茎组织的韧皮部区域是生成诺米林的特
异酶。第二类酶在柑橘的所有组织中存在，包括叶，茎，果汁囊瓣，
果皮和种子，主要是将诺米林转化成其它种类柠檬苦素糖苷配基。柠
檬苦素D环内酯水解酶的活性多发生于种子，即其催化D-环内酯化。
在果实生长过程中，新合成的单内酯通过这种酶来转换。 UDP-D-葡
萄糖：柠檬苦素葡糖基转移酶，在果实组织和种子中出现，其作用是
在成熟过程中催化柠檬苦素苷元到各自的糖苷的转化。柠檬苦素β糖
苷酶的活性是在种子萌发过程中催化柠檬苦素糖苷配基释放苷元和
葡萄糖，只发生在种子。
柠檬苦素类似物的糖基化：一个自然脱苦过程
柠檬苦素苦味是在季节初期至中期的冬季水果中的一个问题，但
不是在晚季水果。随着果实成熟，柠檬苦素Α环内酯浓度降低（25）。
一个多世纪以来，这种自然脱苦过程都被认识到，但其机理直到柑橘
组织柠檬苦素糖苷的发现才被认识到。 1989年，长谷川等人（26）
在柑橘中发现柠檬苦素苷的存在，并在果实生长后期果实组织和种子
成熟过程中确定了柠檬苦素苷元转化为其各自苷元的过程。（25）之
后，20种柠檬苦素糖苷在柑橘和其杂交种中被分离（24）。这些化
合物都含有一个D-葡萄糖分子通过β糖苷键连接到一个相应的糖苷
配基。在这个位置中的葡萄糖基团的存在可以防止形成闭合的D型
环，也是苦味感觉所要求的一个关键结构。
在加州种植的脐橙和巴伦西亚橙的糖基苷从九月开始，一直持续
到水果收获（25，27）。从初期到中期收获的脐橙果汁开始延迟苦味，
而来自瓦伦西亚橙的果汁则没有。不同之处在于在脐橙的短成熟时
期，在十一月成熟期的前两个月。在这短短的时间内，没有足够的糖
苷配基转换。在另一方面，在三月成熟期之前，巴伦西亚橙有至少六
个月成熟季节。在这额外4个月成熟的过程中，柠檬苦素糖苷配基几
乎完全转化为无味苷。
负责这种转化的酶已被鉴定出，命名为UDP-U-葡萄糖：柠檬苦
素葡萄糖基转移酶（28）。柠檬苦素糖苷配基只有在成熟的果实组织
和种子中才能发现，而不是在未成熟的果实组织和种子中，也没有在
叶和茎中发现。一般甜橙有比较高水平的柠檬苦素葡萄糖基转移酶活
性，因此，它们含有高浓度的柠檬苦素糖苷配基。相比之下，柚中这
种酶的活性很低，所以其果汁中即使在很晚的季节也有低水平的柠檬
苦素糖苷配基和高水平的苦柠檬苦素苷元。在加州成熟的柚子汁中，
平均含有18 ppm的柠檬苦素和29 ppm的总柠檬苦素糖苷配基（29）。
柚杂交品种如葡萄柚，Oroblanco和酸橙也具有相对低浓度的柠檬苦
素糖苷配基，这表明具有活性的柠檬苦素葡萄糖基转移酶在这些栽培
品种中也非常低（30）。
柠檬苦素中17β-D-吡喃葡萄糖苷β葡萄糖苷酶催化的柠檬苦素
糖苷水解并释放柠檬苦素和葡萄糖。这种酶是参与柠檬苦素生物降解
和只存在于休眠成熟种子和发芽种子中（31）。存储在果实组织的柠
檬苦素糖苷是非常稳定的。然而，在种子发芽过程中，糖苷水解解放
葡萄糖和柠檬苦素苷元。在萌发过程中，类柠檬苦素有可能作为杀虫
剂发挥作用，而葡萄糖将在一般代谢中发挥作用。商业果汁加工过程
中，破碎的种子可能释放β葡糖苷酶的活性在果汁中。这可能会增加
苦柠檬苦素苷元的水平，如如柠檬苦素，水解无味柠檬苦素苷。
商业果汁脱苦方法
许多种使柑橘汁中脱苦的方法都是（32，33）利用吸附剂和离子
交换树脂。虽然这些方法都有效地从极度苦的果汁中完成脱苦，但它
们的商业市场有限。果汁中苦味是由真正的类柠檬苦素界定的，每种
方法都有它的缺点。当然，这些脱苦方法都不会在全部水果中使用。
目前，最广泛使用的脱苦方法是融合苦汁与非苦汁，来稀释苦味。
一个比较好的解决这个问题的方法是通过遗传工程来生产出新
的柑橘品种。创建转基因柑橘植物的方法早已深入人心。通过适当的
遗传物质插入，它可能是创造出不生产柠檬苦素的水果。我们广泛的
新陈代谢研究已经表明，插入的三个基因中的一个基因编码特定柠檬
苦素代谢酶，可以使在转基因植物中收获无苦味水果。这些酶中已有