玉米样品中转基因玉米Bt176含量检测
转基因对环境的破坏
转基因对环境的破坏 尽管欧盟和其他国家政府正在逐步制定有关转基因⾷品相关的法律制度,但各国政府关于转基因⾷品标识并没有统⼀的标准。
下⾯是店铺推荐给⼤家的转基因对环境的破坏，供⼤家参考。
转基因对环境的破坏 通过⼈⼯基因改变，基因错乱⽐例可以达到100%，成为“全突变基因作物”。
⽽“全突变基因作物”不喷农药则不⾏，因为种植起来就会被⾍⼦吃光。
主要原因则是⾍⼦突变成为神经失常的怪物，失去判断能⼒，从诞⽣开始就处在疯狂的繁殖状态，碰上任何植物都会疯狂吞⾷，只因为⾍⼦的基因演变成吃、吃、吃。
其程序是： 全转基因作物→不怕第⼀代⾍害→微⽣物开始突变→多代以后，⾍类以及杂草基因变异为害→导致农药使⽤量是转基因前的数倍→农药化导致⼟壤坏死→种植要不断施肥→农药使⽤量是转基因前的⼗倍以上→⼈类基因变异开始发⽣各种畸形和奇异病。
如加拿⼤的⼀种转基因作物GM油菜，对农药产⽣了抵抗性，成了真正所谓的“超级杂草”。
所以转基因作物有三个主要特点：⼀是对原始的野⽣农作物具有灭绝作⽤。
这⼀点已被实践证明，不再属于理论问题。
⼆是转基因产品都是绝育产品，不能像野⽣农作物那样，可以⽤打下的粮⾷作为来年的种⼦，⽽只能每年都购买新种⼦。
三是对农药化肥具有特殊的要求，只能使⽤转基因种⼦公司指定的农药化肥。
什么是转基因 基因是决定物种⽣命现象的最基本因⼦，是最基本的遗传物质。
⽽转基因技术是对上帝造物密码的第⼀次⼲预。
现代科学家把各种本来不是该动植物细胞核内的遗传基因⼈⼯植⼊该动植物的细胞核内。
为什么?就是让它(外系的基因碎⽚)在该动植物的细胞体部产⽣抗体(毒素)，杀死外来的细菌病毒。
有各种各样作⽤的转基因，有的动植物甚⾄植⼊多达7-8种的外来基因。
以这样的⽣物作为⾷品或以其为原料所加⼯⽣产的⾷品，都被称为“转基因⾷品”。
⼤家知道⼈体内有许多酶，可以把⼈摄⼊⾷物中的蛋⽩质分解成⼈体所需的氨基酸、微量元素、⽔等各种营养成分。
但这些酶不能分解很多有毒物质的成分。
转基因植物
载体介导法
➢ T-DNA区可高效整合到植物受体细胞的 染色体上并得到表达。利用这一特点， 将目的基因转入Ti质粒的T-DNA区构建 根瘤农杆菌的转化载体。
一、转基因植物
通过植物基因工程获得转基因植物在农 业生产发展及植物分子生物学研究中有 十分重要的意义，已获得的有重大经济 价值的转基因植物已经很多。
一、转基因植物
基因工程： 就是重组DNA技术，指在体 外将不同来源的DNA进行剪切和重组， 形成杂合DNA或成嵌合DNA分子，然后将 其导入特定的宿主细胞从而得到大量扩 增和表达，使宿主细胞获得新的遗传特 性，产生新的基因产物。
载体介导法
Vir区（virulence region）： ➢ 该区段上的基因能激活T-DNA转移，
使农杆菌表现出毒性，故称之为 毒性区。T-DNA区与Vir区在质粒 DNA上彼此相邻，合起来约占Ti质 粒DNA的三分之一。
Ti质粒的基因位点及其功能区域
➢ T-DNA区（transferred-DNA regions）：
产生白化苗，且由于 PEG法对原生质体活力 有害，转化率低。
应用这种方法已成功的获得大麦、柑桔、胡
椒等植物的转基因植株。
一、转基因植物
载体介导法 具体方法有农杆菌介导法、病毒介导法。 农杆菌介导可采用“共培养法”，(见
书本图10-1 B)，有根癌农杆菌和发根农 杆菌两种载体系统。
载体介导法
以野生型根癌农杆菌载体系统为例： ➢ 野生型根癌农杆菌Ti质粒大小约200-
转Bt基因作物毒素蛋白降解特性研究进展
转Bt基因作物毒素蛋白降解特性研究进展Abstract: The characteristics of Bt insecticidal proteins, soil remaining and accumulating of toxins released by transgenic Bt crops, and the impact of transgenic Bt crops on ecological environment were summarized. The degradation of Bt Protein in soil and its impacting factors were also discussed. It was suggested that the degradation of transgenic Bt crops stalks should be investigated, to degrade Bt proteins in transgenic Bt crops while degrading transgenic Bt crops stalks.Key words: transgenic Bt crops; toxins protein; soil; degradation自1983年转基因作物问世以来,转基因作物发展迅猛,全球种植面积从1996年的170万hm2增加到2009年的1.34亿hm2,翻了近80倍,累计达10亿hm2,截至2009年累计经济效益达519亿美元｡2009年共有25个国家的1 400万农民种植了转基因作物,其中,美国是世界上最大的转基因作物种植国,占全世界的48%｡2009年,转基因耐除草剂大豆仍然是主要的转基因作物,占全球转基因作物种植面积的52%,其次是转基因玉米(占31%)､转基因棉花(占12%)和转基因油菜(占5%)｡2009年发展中国家转基因作物种植面积占世界的46%,中国居世界第六位｡农业生物技术应用国际服务组织(ISAAA)预测:2015年,世界将有40个国家的2 000万农民种植转基因作物,种植面积将扩大到2亿hm2 [1]｡转Bt基因作物是全球商品化程度最快的抗虫转基因作物,目前进行商业化种植的有转Bt基因玉米(Bt11､Mon810､Event176等)､棉花､马铃薯和杨树等｡但转Bt基因作物大规模种植的潜在生态风险是许多科学家争论的焦点｡研究表明,Bt杀虫晶体蛋白可以通过转Bt基因作物根系分泌物或作物残留等形式进入土壤生态系统,并且在土壤和环境中比较稳定,经过较长的时间后仍具有很高的活性,因此可能会对土壤微生物类群､土壤多样性以及周围生态环境产生不利影响｡本研究综述了转Bt基因作物毒素蛋白的降解特性研究进展,旨在为开展Bt杀虫晶体蛋白的降解研究工作和系统评估转Bt基因作物的生态风险提供参考数据｡1Bt杀虫蛋白1.1Bt杀虫蛋白的杀虫机制Bt(Bacillus thuringiensis)是一种革兰氏阳性需氧型芽孢杆菌,1901年Ishiwata首先在染病的蚕蛾中发现这种芽孢杆菌,但是没有保存下来｡1909年,Berliner从德国苏云金省的地中海粉螟上重新分离到Bt,并正式定名为苏云金芽孢杆菌[2]｡苏云金芽孢杆菌在其芽孢形成过程中,能产生一种杀虫晶体蛋白(Insecticidal crystal proteins)｡Bt的毒素可分为内毒素和外毒素｡外毒素指苏云金杆菌在生命活动过程中排出体外的代谢物,包括α-外毒素､β-外毒素､γ-外毒素､不稳定外毒素和水溶性外毒素等｡内毒素又称δ-内毒素､晶体毒素或杀虫晶体蛋白｡其中用于转基因植物的主要是δ-内毒素,δ-内毒素被敏感昆虫幼虫取食后,在其消化道内消化酶的作用下,蛋白被水解释放出Mr约60×103~70×103的活性毒蛋白分子(Toxin),毒蛋白与昆虫中肠上皮细胞上的特异性受体结合,并发生作用而使细胞膜穿孔｡消化道细胞内的离子浓度和渗透压平衡遭破坏,使上皮细胞裂解,并导致昆虫死亡[3-8]｡1.2Bt杀虫蛋白的应用1978年,Stahly等[9]确定了Bt杀虫蛋白基因的位置和可操作性｡此后,各国科学家纷纷将Bt杀虫蛋白基因转入其他微生物,构建或改良可高效产生Bt杀虫晶体蛋白的工程菌株;或将其改造后转入植物体,以期获得抗虫的转基因植物｡1987年,比利时的Vaeck等[10]利用农杆菌介导法将完整的Cry1Ab基因和3’端缺失后仅保留5’端编码毒蛋白核心区的不同长度的Cry1Ab基因导入烟草,获得了第一例转Bt基因的植物,同年还有3个实验室也报道了转Bt基因的烟草或番茄[4,10,11],但这些转基因植物的抗虫性都很弱,难以检测出mRNA的转录,Bt杀虫蛋白的表达量很低,主要原因是未改造的Bt基因具有原核性质不能在真核生物中高效表达｡因此,为了提高Bt基因在转基因植物中的表达水平,科学家们纷纷对Bt基因进行改造或人工合成,将Bt基因的不稳定序列换成植物偏爱的密码子｡Perlak等[12]在不改变Bt杀虫蛋白氨基酸序列的前提下,将CryIAb､CryIAc基因的密码子进行改造,使这两个基因在转基因棉花中的表达水平提高了近100倍,Bt杀虫蛋白的含量提高到占可溶性蛋白的0.05%~0.10%,抗虫功效明显增强｡除了对Bt基因的密码子进行改造外,还可以通过使用组织特异性启动子或强启动子来提高Bt基因在转基因植物中的表达水平,从而达到抗虫的目的｡随着生物技术的发展,近年来科学家们开始尝试用复合的具有非竞争性结合关系的Bt基因来转化植物,以获得对多种害虫都能产生抗性的转基因植物,Salm等[13]用分别属于CryIAb和CryIAc的活性片段构建了一个融合基因,并将其导入烟草和番茄,得到了对甜菜夜蛾､烟芽夜蛾､烟草夜蛾都有抗性的转基因植株｡1.3国内转Bt基因植物研究现状国内有关转Bt基因作物的研究虽然起步较晚,但进展很快｡1992年中国农业科学院生物技术研究所专家,按照高等植物偏爱密码子的原则,在保持杀虫蛋白活性中心与结构的前提下,人工全序合成了Cry1A基因,并与江苏省农业科学院合作采用花粉管通道途径将人工全序合成的Bt基因导入棉花,获得高抗棉铃虫的转Bt 抗虫棉花[14,15],使我国成为继美国之后获得拥有自主知识产权转基因抗虫棉的第二个国家｡此外,中国科学院微生物所､上海植物生理研究所等单位也合成及部分改造了Cry1A基因并导入烟草､甘蓝和大豆,获得了抗虫转基因植株[16]｡丁群星等[17]用子房注射法,将经修饰后Cry1Ac基因导入玉米,使玉米螟的平均死亡率达86.66%｡另外,我国科学家对转Bt基因水稻的研究也较多,华中农业大学､浙江大学､中国科学院遗传与发育研究所､浙江省农业科学院等单位相继都获得了高抗虫的转Bt基因水稻,并已进行环境释放试验｡但是,迄今为止我国只有转Bt基因的抗虫棉得到了商品化生产,转Bt基因抗虫玉米､水稻等粮食作物大部分还处于安全评价阶段｡2009年11月27日,华中农业大学研发的转cry1Ab/cry1Ac基因抗虫水稻华恢1号和Bt汕优63获得了农业部颁发的生产应用安全证书,使转Bt基因水稻向商业化应用迈出了实质性的一步｡2008年,科技部､农业部､财政部等部门联合启动了“转基因生物新品种培育科技重大专项”,专项实施的目标是获得一批具有重要应用价值和自主知识产权的基因,培育一批抗病虫､抗逆､优质､高产､高效的重大转基因生物新品种｡专项的实施必将提高农业转基因生物研究和产业化整体水平,加快我国转基因作物新品种培育和商业化种植的步伐,为我国农业可持续发展提供强有力的科技支撑｡2转Bt基因作物对土壤生态系统的影响转Bt基因作物的Bt杀虫蛋白可以通过根系分泌､残茬分解､秸秆还田以及花粉飘落等进入土壤生态系统,并快速紧密结合于土壤活性颗粒的表面,从而避免了被降解｡研究表明,这些Bt杀虫蛋白能够在土壤中存在一段较长的时间,并且具有一定的活性,有可能对土壤的生态系统造成一定的影响｡因此,最近几年转Bt基因作物对土壤生态系统的影响受到人们的广泛关注,成为转Bt基因作物安全的研究热点之一｡2000年美国EPA将转Bt基因作物对土壤生态系统的影响列为转Bt基因作物风险评价的重要组成部分｡2.1转Bt基因作物Bt杀虫蛋白在土壤中的残留和积累Bt杀虫蛋白在土壤中与土壤颗粒紧密结合,很难降解,并持续产生毒性[18]｡1996年,Palm等[19]将转Bt基因抗虫棉的枝叶埋入5种不同微生态系统土壤中,140 d后,在其中的3种土壤中仍能检测到Bt杀虫蛋白,其含量分别为初始浓度的3%､16%和35%｡1997年,James等[20]研究证实Bt杀虫蛋白可通过枯枝落叶而残留在土壤中,并进一步证明Bt杀虫蛋白可以与土壤黏粒结合,使其毒性难以降解,最长可以持续2~3个月｡Saxena等[21]报道,转基因玉米Bt毒素蛋白通过根系分泌和残体降解释放到土壤中,并在土壤中残留最长可达350 d,Saxena等还研究了残留于土壤中的Bt杀虫蛋白的毒性,结果表明食用转Bt玉米分泌物的幼虫停止进食,5 d后死亡率高达95%~100%,而对照组玉米螟则未有死亡,这表明转Bt基因作物根系分泌物具有较强的Bt杀虫蛋白活性｡虽然,转Bt基因作物分泌的Bt 杀虫蛋白具有较强的杀虫活性,并能够在土壤中残留一段较长的时间,但是Deepak等[22]研究表明,这些残留在土壤中的Bt杀虫蛋白不会被下一季作物吸收｡因此,这些残留在土壤中的Bt杀虫蛋白并不会对下一季作物的抗虫活性产生影响｡但是,农业生态系统相对简单,稳定性差,对干扰较敏感,转Bt基因作物的大面积种植导致的大量Bt杀虫蛋白进入土壤,可能会对土壤生态系统产生较大的影响[23]｡2.2转Bt基因作物对土壤微生物区系的影响任馨等[24]在实验室条件下,比较了克螟稻Bt基因表达最高期秸秆和同一时期亲本稻秸秆的添加对淹水土壤可培养厌氧细菌数量和细菌群落组成的影响｡结果表明,与亲本对照相比,培养初期克螟稻秸秆的添加对淹水土壤厌氧发酵性细菌､产氢产乙酸细菌､反硝化细菌和产甲烷细菌的数量产生了显著性影响,但培养后期这种显著性差异基本消失｡PCR-DGGE指纹图谱和主成分分析(PCA)结果表明,两种秸秆处理土壤细菌群落组曾在培养的第三周和第五周达到显著性差异,随着培养时间的延长,两种秸秆处理土壤间细菌群落组成的差异逐渐减小,到培养的第11周,两种秸秆处理土壤间细菌群落组成的差异基本消失｡王洪兴等[25]通过研究转Bt基因水稻及其亲本秸秆在降解过程中对土壤微生物主要类群的影响,发现在秸秆降解过程中,转Bt基因组细菌和放线菌数量显著低于非转基因组,而真菌数量显著高于非转基因组,转Bt基因组反硝化细菌活性显著低于非转基因组,而解磷微生物活性在各处理组之间无明显差异｡但是,近年来Devare等[26]的一些研究结果显示转Bt基因作物并未给土壤生态系统造成重要影响｡2004年,Devare等[26]经过半年多田间种植转Cry3Bb杀虫蛋白基因的转Bt基因玉米,并通过末端限制片段长度多态性分析评估了其根际与周围的土壤微生物数量､活跃度(包括土壤氮素矿化量､短期土壤消化作用､土壤呼吸作用)和细菌群落结构,发现同时期转Bt基因玉米根际与周围的土壤中,上述指标均不存在显著性差异,转Bt基因玉米未给土壤微生物数量､活跃度及细菌群落生态带来重要影响｡2007年,Devare等[27]报道,经过3年的田间种植转Cry3Bb玉米,并通过测定种植3年转Cry3Bb玉米每年3个时期(作物种植前､开花期､收获期)收集的大批土壤样本的土壤微生物数量､活跃度数据,发现转Bt玉米对土壤微生物数量和活跃度的影响,呈现出明显的周期性变化｡与其2004年报道的试验结论一致,转Bt基因玉米未给土壤生态系统带来重要影响｡但是,目前对土壤中转Bt 杀虫蛋白的生态效应研究明显不足,评价的物种单一,周期短,对土壤中敏感微生物的研究仅局限在土壤微生物不到1%的可人工培养的种类上,尚未有对土壤微生物群落､生物多样性及功能的长期定位研究｡我国在这方面的研究仍未引起足够的重视,而且研究方法和手段也比较落后｡随着人们安全性意识的不断加强,必将增加这方面的研究投入,从而促进转基因生物产业的健康发展｡2.3转Bt基因作物对土壤动物和植物的影响在种植过转Bt基因玉米或者加入其秸秆120~180 d后的土壤上,无论种植非转基因玉米､胡萝卜､萝卜或甘蓝,在这些后茬作物组织中用ELISA检测或幼虫生测均未检测到Bt杀虫蛋白,但是其土壤中仍有活性的Bt杀虫蛋白,表明土壤中已经存在的Bt杀虫蛋白不会被后茬非转基因作物吸收和利用[22],不会对这些非转基因作物的生长和特性产生影响｡将蚯蚓培养在被Bt杀虫蛋白污染的土壤中45 d 后,其肠道内容物和粪便中均能检测到Bt杀虫蛋白,但这些Bt杀虫蛋白对蚯蚓种群的数量和生长状况没有影响,将蚯蚓转移到不含Bt杀虫蛋白的新鲜无污染土壤中培养2~3 d后,其肠道内容物中的Bt杀虫蛋白消失[28],表明结合态Bt杀虫蛋白不会影响蚯蚓的正常生长｡3转Bt基因作物Bt杀虫蛋白在土壤中降解的影响因素目前,关于Bt杀虫蛋白在土壤中降解时间的报道差异较大,可能是因为土壤中Bt杀虫蛋白的降解受到多种因素的影响,其中主要因素可能是土壤微生物､土壤湿度､酸碱度､黏粒组成及含量｡3.1土壤生物对Bt杀虫蛋白在土壤中降解的影响土壤生物是Bt杀虫蛋白在土壤中发生失活或降解的主要作用因子之一,尤其是土壤微生物,它是影响Bt杀虫蛋白在土壤中降解的最关键因子｡Palm等[19]研究发现,在种植转Bt基因棉花的土壤中,Bt杀虫蛋白的量在前14 d快速下降,然后下降趋势逐渐减慢｡而土壤经γ射线处理后,其中的Bt杀虫蛋白降解速度明显减慢｡白耀宇等[29]研究发现,在前6 d内KMD2叶片冻干粉Cry1Ab蛋白的降解速度相当快,这与Palm等[19]的研究结果较为相似,推测其快速降解的主要原因是Cry1Ab杀虫蛋白在自由状态下被土壤微生物作为一种碳源或氮源分解利用｡土壤微生物的数量及其生物活性与土壤的类型密切相关,通常有机质含量高的土壤中微生物数量多,土壤中的Bt杀虫蛋白易被土壤中的微生物降解;同时,一般情况下土壤pH值较高则土壤微生物活性也较高,有利于Bt杀虫蛋白的降解｡另外,土壤生态环境中的昆虫也能消耗一些Bt杀虫蛋白,即土壤中的Bt杀虫蛋白进入昆虫(包括靶标害虫和非靶标昆虫)体内被降解｡3.2土壤湿度对Bt杀虫蛋白在土壤中降解的影响土壤湿度是影响Bt杀虫蛋白在土壤中降解速度的主要因素之一[30]｡白耀宇等[29]研究表明,土壤淹水可显著促进Cry1Ab的降解,且淹水后Cry1Ab的降解动态在不同土壤之间十分相似,但是淹水对Cry1Ab降解的促进作用仅发生在前12 d 之内,此后多数时间内淹水与非淹水处理间Cry1Ab的降解无显著差异｡3.3土壤酸碱度对Bt杀虫蛋白在土壤中降解的影响土壤酸碱度对土壤中Bt杀虫蛋白的降解也有一定的影响,土壤pH值较高,则土壤中Bt杀虫蛋白降解较快,而土壤pH值较低,则不利于Bt杀虫蛋白的降解｡首先,土壤中微生物活性受到土壤酸碱度的影响｡一般情况下,土壤pH值高,则土壤微生物活性就大,微生物分解Bt杀虫蛋白的能力就强,致使大多数的Bt杀虫蛋白被微生物降解｡在pH值为中性的土壤中,利用生物测定法检测Bt杀虫蛋白的活性,结果表明转Bt棉花和玉米中的Bt杀虫蛋白的活性很快被降解,而pH值较低的土壤则不利于微生物对Bt杀虫蛋白的降解[31]｡其次,土壤中具有表面活性的微粒对Bt杀虫蛋白的吸附能力也受到土壤酸碱度的影响｡pH值在4.4~10.0时,蒙脱石和高岭石对Bt杀虫蛋白的吸附量都随pH值的升高而呈线性降低,由于游离态的Bt 杀虫蛋白更容易降解,因此Bt杀虫蛋白的降解率随pH值的升高而呈线性升高[32]｡Tapp等[33]报道Btk和Bt杀虫蛋白与土壤黏土矿物的吸附在pH值为6时达到最大值,因为Bt杀虫蛋白的等电点在5.5左右｡当土壤的pH值接近杀虫蛋白的等电点时,中性杀虫蛋白所受的斥力最小,致使杀虫蛋白与土壤表面有最大的接触机会,从而提高杀虫蛋白与土壤颗粒的吸附力｡结合到高岭石的杀虫蛋白可被ddH2O解吸,而结合在蒙脱石上的Bt杀虫蛋白只能被0.2%的Tris缓冲液解吸｡另外,Bt杀虫蛋白在自然含有或人为加入高岭石的土壤中的杀虫活性比自然含有或人为加入蒙脱石的土壤高,且持续的时间长,其主要原因就是含蒙脱石的土壤pH 值高,细菌活性强[34]｡3.4土壤黏粒对Bt杀虫蛋白在土壤中降解的影响土壤中黏粒的含量和组分也在很大程度上影响Bt杀虫蛋白的降解｡Stotzky等[35]研究发现,土柱中Bt蛋白含量随着黏粒浓度的升高而降低｡Donegan等[36]研究发现在沙壤土和黏壤土中,转Cry1Ab基因棉花叶片和茎秆分解释放杀虫蛋白的高活性状态可分别持续28 d和40 d,这是因为黏壤土中含有更多的土壤活性颗粒,而土壤中的沙粒和泥沙粒由于不具有表面活性的缘故,则不能吸附毒素｡而进一步的研究证实,Bt杀虫蛋白与土壤黏粒的结合,大大减少了其在土壤中的降解｡此外,光照(特别是紫外线)､气候和转Bt基因作物的品种类型､Bt杀虫蛋白浓度也影响其在土壤中的降解速率｡4展望目前的研究表明,转Bt基因作物通过各种形式向土壤生态系统中释放Bt杀虫蛋白｡位于地表的Bt杀虫蛋白,可以很容易被光降解,而土壤中的Bt杀虫蛋白可以与土壤中具有表面活性的颗粒吸附并紧密结合,从而延缓了土壤微生物对Bt杀虫蛋白的降解,致使大量的Bt杀虫蛋白在土壤中长期滞留甚至富集｡由于Bt杀虫蛋白与土壤颗粒结合后其蛋白结构并没有发生改变,依然保持较高的活性,因此,Bt 杀虫蛋白在土壤中的残留和富集可能会对土壤中非靶标生物造成不良影响,从而影响土壤生态系统的平衡｡转基因植物在进入田间释放和商业化应用的过程中应该开展土壤生态学影响的研究和监测,相对而言,发达国家在这方面已开展了不少工作,但由于研究方法和试验条件的限制,许多问题仍未弄清｡转Bt基因作物环境影响的研究是一个长期而复杂的过程,因此,需要从不同的角度开展系统的研究工作,为全面评价转Bt基因作物释放Bt杀虫蛋白可能引起的生态环境风险提供理论依据｡大面积种植转Bt基因作物后,会产生大量的含有Bt杀虫蛋白的植物秸秆,这些秸秆如果“秸秆还田”则使秸秆中含有的Bt杀虫蛋白进入土壤生态系统,造成Bt 杀虫蛋白在土壤中的累积,从而影响土壤生态系统的平衡｡因此,我们需要对转Bt 基因作物秸秆的处置和综合利用进行研究,开发转Bt基因作物秸秆处置新技术,在利用秸秆的同时降解秸秆中的Bt杀虫蛋白,从而大大降低进入土壤生态系统的Bt杀虫蛋白｡秸秆是一种非常丰富的生物质能源,被广泛地应用于生产生活的各个领域,例如利用植物纤维开发生物燃料,通过微生物处理生产生物肥料､生物饲料,利用植物纤维进行造纸等｡在利用转Bt基因作物秸秆生产沼气､生物肥料的过程中,需要对秸秆中Bt杀虫蛋白的降解情况进行研究和监测,争取通过对生产技术的改进(比如加入特定的微生物和酶)来提高秸秆中Bt杀虫蛋白的降解速度,从而从根本上消除Bt杀虫蛋白对生态系统的潜在影响｡本实验室经过一段时间的研究,从转Bt基因水稻种植田筛选出了一种能够降解Bt杀虫蛋白的细菌,在实验室条件下,4 d内该细菌能够降解转Bt基因水稻秸秆中90%以上的Bt杀虫蛋白,这对于利用转Bt基因作物秸秆生产生物肥料､沼气过程中,降解秸秆中的Bt杀虫蛋白,彻底消除Bt杀虫蛋白对生态系统的潜在影响,具有非常高的应用价值｡参考文献:[1] JAMES C. 2009年全球生物技术/转基因作物商业化发展态势——第一个十四年1996~2009[J].中国生物工程杂志,2010,30(2):1-22.[2] SCHNEPF E, CRICKMORE N, V AN RIE J, et al. 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325玉米
先玉335，是美国先锋公司选育的玉米杂交种。
由敦煌种业先锋良种有限公司按照美国先锋公司的质量标准和专有技术独家生产加工销售。
具有高产、稳产、抗倒伏、适应性广、熟期适中、株型合理等优点。
转基因玉米MON810：美欧生物技术巨头中的德国的巴斯夫公司率先停止向欧洲市场销售它自己的转基因产品（只有一种做工业原料用的土豆），随后美国孟山都公司也宣布停止在法国销售争议多年的大品牌，转基因玉米MON810。
至此，在欧洲种植的转基因农作物只剩下非常少的一点试验田，商业化种植停止。
玉米品系NK603是美国孟山都公司（Monsanto Company）研发的抗草铵膦的一种转基因玉米，商品名为RoundupReady玉米。
其中的草铵膦耐受基因（EPSPS）是从根瘤土壤菌CP4品系中提取出来的，采用重组DNA技术引入玉米中。
NK603通过玉米纯种品系的LH82和B73的杂交并转染一个包含2个相邻的EPSPS表达框的DNA片段（6707bp）产生。
转基因玉米NK603：NK603是美国孟山都公司研制的一种转基因玉米，通过转基因技术，这种玉米对孟山都公司生产的草甘膦除草剂“Roundup”具有抗药性。
因此种植这种转基因玉米的农民可以放心使用“Roundup”，既不会对作物造成影响，又能节省费用。
但凯恩大学研究团队发现，用NK603和被“Roundup”污染的饲料喂养的实验鼠，罹患肿瘤和其他内脏损伤比例非常高。
转基因玉米Bt-176是先正达公司开发的抗虫且耐草铵膦除草剂的转基因玉米品种，是利用基因工程技术分别将苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringien－sis)亚种kurstaki的Cry1A(b)基因、土壤细菌(Strepto－myceshygroscopicus)的bar基因等外源基因导入玉米中而获得的抗玉米螟和耐草铵膦转基因品种。
“星联”玉米中插入了一种基因，对玉米螟具有致死作用，美国批准“星联”可以用于饲用，但是不能用于人类消费，因为担心“星联”可能造成过敏。
转基因耐除草剂大豆ZH10-6多重PCR检测方法的建立
转基因耐除草剂大豆 ZH10-6多重 PCR检测方法的建立摘要本研究通过利用多重PCR(multiplexPCR，MPCR)技术，检测ZH10-6的4个边界序列，建立其分子特征转化体特异性鉴定方法，为该转化体的生物安全评价研究以及知识产权保护和市场行政监管提供重要的基础技术支撑。
关键词：转基因耐除草剂大豆ZH10-6；多重PCR；检测方法1、材料与方法1.1材料转基因耐除草剂大豆(Glycinemax)ZH10-6，非转基因大豆受体ZH10，用于特异性测试的样品有：转基因玉米(Zeamays)混样(MON810，MON863，Bt11，Bt176，GA21，T25，NK603，TC1507，MON88017，3272，MON87427，MON87460，MIR162，MIR604，DAS40278-9，MON89034，4114，59122，5307，BVLA430101每种转化体含量分别为1%，以非转基因玉米作为填充物)；转基因大豆混样(MON87701，MON89788，GTS40-3-2，A2704-12，A5547-127，CV127，356043，305423，MON87769，MON87705，MON87708，FG72，DAS44406-6和SYHT0H2每种转化体含量分别为1%，以非转基因大豆作为填充物)；转基因油菜(Brassicanapus)混样(包括RT73，MS1，MS8，T45，RF1，RF2，Topas19/2，RF3，Oxy235，MON88302，每种转化体含量分别为1%，以非转基因油菜作为填充物)。
1.2仪器和主要试剂LEGENDMICRO21R高速冷冻离心机Ther‐mo；Nanodrop1000核酸定量仪NanoDrop；Veriti96WellPCR仪ABI；电泳仪BIO-RAD；C150凝胶成像系统AzureBiosys‐tems。
植物基因组DNA提取试剂盒DP305；PCR试剂2×GoTaqGreenMasterMix;DL1000DNAMarker;琼脂糖;SuperGelred10000×inwater；引物由GE‐NEWIZ合成。
mCry1Ac基因在抗虫转基因玉米Bt799中的表达特征
mCry1Ac基因在抗虫转基因玉米Bt799中的表达特征杨丽丽;董姗姗;刘燕;王长永;袁艺【摘要】采用双抗夹心酶联免疫法(ELISA)定量检测转mCry1 Ac基因抗虫玉米Bt799在不同生育期不同植株部位的mCry1Ac蛋白含量.结果显示:mCu1 Ac基因在整个生育期玉米叶、茎、根和种子中均能表达,mC ry1 Ac蛋白含量为(0.82±0.10)～(15.83±1.77)μg·g-1;随着生育期和植株部位的不同,mCry1Ac蛋白含量呈现明显的时空动态变化,其中,叶、茎和根中mC ry1 Ac蛋白含量随转基因玉米生育期的推移均呈增加趋势,并均在完熟期达最高;在除苗期外的其他各生育期叶中mCry1 Ac蛋白含量均显著高于其他植株部位,而在完熟期种子中mCry1Ac蛋白含量在各植株部位中最低,为(2.86±1.71) μg·g-1.【期刊名称】《生态与农村环境学报》【年(卷),期】2014(030)005【总页数】4页(P670-673)【关键词】mCry1Ac基因;转基因玉米;双抗夹心酶联免疫法(ELISA);Bt蛋白【作者】杨丽丽;董姗姗;刘燕;王长永;袁艺【作者单位】安徽农业大学生命科学学院,安徽合肥230000;环境保护部南京环境科学研究所,江苏南京210042;环境保护部南京环境科学研究所,江苏南京210042;环境保护部南京环境科学研究所,江苏南京210042;环境保护部南京环境科学研究所,江苏南京210042;安徽农业大学生命科学学院,安徽合肥230000【正文语种】中文【中图分类】X176;Q71玉米是世界主要粮食作物之一。
由于玉米虫害严重，造成玉米每年减产约10%，严重时可达20%以上［1］。
利用生物基因工程技术将外源抗虫Bt基因导入玉米培育抗虫转基因玉米已成为防治玉米虫害的有效途径。
自1996年美国率先将抗虫转Bt基因玉米进行商业化种植以来，截至2012年底，全球转基因玉米的种植面积已达到5 520万hm2，占玉米种植总面积的35%，而且转基因玉米是获得监管机构批准进口并用于食物和饲料以及释放到环境中最多的转基因作物，在23个国家中共有121个事件［2］。
国内转基因食品类农作物清单
国内转基因食品类农作物清单（王洛克根据中国生物安全网资料统计）[转cry1Ab/cry1Ac基因抗虫水稻华恢1号华中农业大学转cry1Ab/cry1Ac基因抗虫水稻Bt汕优63 华中农业大学转植酸酶基因玉米BVLA430101 中国农业科学院生物技术研究所转基因抗黄瓜花叶病毒甜椒PK-SP01 北京大学转基因抗黄瓜花叶病毒番茄PK-TM8805R 北京大学转基因抗黄瓜花叶病毒甜椒“双丰R” 北京大学抗CMV和TMV转基因线辣椒中国农业科学院生物技术研究所转基因贮藏番茄大东9号中科院微生物所转番木瓜环斑病毒复制基因的番木瓜华农1号华南农业大学耐除草剂转基因大豆GTS40-3-2 孟山都公司耐除草剂转基因玉米GA21 孟山都公司抗虫转基因玉米MON810 孟山都公司耐除草剂转基因油菜GT73 孟山都公司抗虫转基因玉米MON863 孟山都公司耐除草剂转基因玉米NK603 孟山都公司抗农达大豆GTS40-3-2 孟山都公司抗除草剂油菜GT73 孟山都公司抗农达玉米GA21 孟山都公司抗虫耐除草剂玉米MON88017 孟山都公司抗农达大豆MON89788 孟山都公司抗农达甜菜H7-1 孟山都公司抗虫和耐除草剂转基因玉米Bt176 先正达种子有限公司抗虫和耐除草剂转基因玉米Bt11 先正达种子有限公司抗农达玉米GA21 瑞士先正达农业服务亚洲公司抗虫玉米MIR604 瑞士先正达农业服务亚洲公司抗虫和耐除草剂转基因玉米TC1507 杜邦中国集团有限公司陶氏益农中国有限公司抗虫耐除草剂玉米59122 杜邦中国集团有限公司陶氏益农中国有限公司耐除草剂转基因玉米T25 拜耳作物科学公司转基因油菜Ms1Rf1 拜耳作物科学公司转基因油菜Ms1Rf2 拜耳作物科学公司转基因油菜Ms8Rf3 拜耳作物科学公司耐除草剂转基因油菜T45 拜耳作物科学公司耐除草剂转基因油菜Topas19/2 拜耳作物科学公司耐除草剂转基因油菜Oxy-235 拜耳作物科学公司抗除草剂大豆A2704-12 拜耳作物科学公司2010-2-12举报饼干点心类承诺不使用含有转基因成分原料的食品品牌：奥利奥鬼脸嘟嘟蓝罐曲奇甜趣富丽嘉顿康师傅菜园小饼好丽友乐之统一趣多多御林军太平达能积士佳蘑古力闲趣哥本哈根曲奇没有承诺不使用含有转基因成分原料的食品品牌：雀巢徐福记休闲零食类承诺不使用含有转基因成分原料的食品品牌：天喔黑皮脆明治小浣熊百醇康师傅奇多欣欣杯百力滋浪味仙旺旺百奇乐事旺仔好友趣立体脆小当家没有承诺不使用含有转基因成分原料的食品品牌：波力海苔妙脆角四洲芥末小生品客卡乐B 十月初五糖果和巧克力承诺不使用含有转基因成分原料的食品品牌：不二家吉百利瑞莎雪莎大大泡泡糖箭牌瑞士三角牌巧克力伊华德芙江户瑞士糖怡口莲东洋劲浪士力架益达费罗列妙卡巧克力旺仔真知棒荷氏摹纱喜之郎没有承诺不使用含有转基因成分原料的食品品牌：阿尔卑斯凯撒威登雀巢宝路薄荷糖徐福记比巴卜曼妥思雀巢奇巧雅客孚特拉雀巢四洲珍宝珠冲调饮品：承诺不使用含有转基因成分原料的食品品牌：阿华田多力亨氏立顿冰泉高乐高皇室麦斯威尔超级麦片果珍捷荣旺仔大排档好立克金禾雅士利没有承诺不使用含有转基因成分原料的食品品牌：摩卡雀巢方便面：承诺不使用含有转基因成分原料的食品品牌：康师傅来一桶日清统一啤酒：承诺不使用含有转基因成分原料的食品品牌：百威哈尔滨蓝带雪堡北京嘉士伯青岛燕京朝日金威生力珠江没有承诺不使用含有转基因成分原料的食品品牌：喜力力波百加得调味酒虎牌三得利调味品：承诺不使用含有转基因成分原料的食品品牌：鼎丰金麦李锦记威顺多力卡夫美味源俞龙凤球老干爹陶华碧珠江桥牌海天老干妈陶大没有承诺不使用含有转基因成分原料的食品品牌：百味佳老才臣天添鲜粤皇红碗味精魔厨高汤味好美家乐四季宝味之素辣得劲太太乐悠浓。
转基因-玉米育种学校
Target tissue
Callus
Selection
Regeneration Medium II
Plantlets
农杆菌介导法和基因枪转化法比较
农杆菌介导法 宿主范围 转化受体类型 基因型依赖程度 转化频率 基因重排 整合拷贝数 稳定性和可重复性 较窄 少 依赖 高 很少 单拷贝或寡拷贝 较好 基因枪转化法 较宽 多 不依赖 中等 较多 多拷贝 较差
3000 2500 2000 1500 1000 500 0 1996 1998 2000 2002 年 份 2004 2006
面 积
转基因玉米产业化进程（万公顷）
中国农大主要研究历程
1981～1987年：组培研究 1988～1992年：转基因技术体系建立，1992得到中国第一株可育转基因玉米 1993～1996年：基因枪转化体系完善，（博士点基金等课题支撑） 1997～1999年：后补进入“863” 1999～2001年：农杆菌转化体系；“863”重点项目 2001～2005年：转基因植物与产业化专项，“863”重点项目；转基因品种大田 实验、环境释放与生产性试验 2006～2007年：大规模转化体系的建立，无标记转基因体系建立，自主知识 产权基因的克隆
1974
农杆菌研究简史
1977 1983 1984 冠瘿瘤细胞的基因组中含有Ti质粒的T-DNA区，TDNA是致瘤因子 农杆菌第一次被用于植物的转基因 从T-DNA区鉴定出合成生长素和分裂素的基因
1985 VirA / VirG双元调控系统在农杆菌感知外界信号和TDNA区的转移过程中起重要作用 1986-今 进一步深入研究T-DNA的转移机制
基因工程研究的基本步骤
分离得到目的基因（DNA片段） 在体外将目的基因插入载体得到重组DNA分子 将重组DNA分子导入受体细胞 对目的基因的表达进行研究和利用
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Ｌ Ｎ ４Ｄ Ａ提取
Ｌ ３探针和引物设计
叫泌、２呵卜 和众 ２呵汕 的 准样品 对５ １ ５ Ｌ ３ １ ５ 标 。
方程为：于Ｚ５ ２ ８７，， ｙ ｅｏ ｘ ２ １ ｘ和、分别为 Ｚ ． ＋ ４ ｓ３ 所有玉米 和转基因玉米Ｂ１ 的 ｔ ７ 浓度对数值， 和ｈ分别为 ６ ｙ ，
Ｄ Ａ提取参照 Ｄ Ａ提取试剂盒操作说明书。 ｚ 和Ｂ１ 基因的Ｃ 值， 卜 Ｎ ｅ ｎ ｉ ｔ７ ６ ｔ ｒ为方程的 相关系数。 因 提取的Ｄ Ａ用分光光度计进行质量分析。 Ｎ 此，只要测出 未知样品及ｉ基因 ｎ 和＆１ 乃基因的ｃ ｔ 值， 就可以获得玉米样品转基因玉米 Ｂ１ 的含量： ｔ７ ６ ＬＳＲｅ ｌ山刀 ＣＲ ａ一 ｅＰ
定 反 用 套 剂 ａ ａ又ｉｒ ＰＲ ａ 量 应 配 试 盒Ｔ Ｍ ｊ ｅａ Ｍ － ｑｎ ｎ ｓ ｃ ｓ ｖｌ
个梯度的标准样品进行ｒ ． ｅ Ｒ ｅ ｔ Ｐ ，每个样品设 ｌ ｍ ａｌ ｃ 个重复， 源基因和目 内 的基因（协和Ｂｌ 分 ｅ ｚ ｔ劝 根据转基因玉米 Ｂ ７ 的外源基因３端序列 置３ １ Ｔ６ ， 以及玉米基因组的旁测序列 （即 ａ ｎｍｅ 管扩增。两个基因实时荧光定量扩增图及标准曲线 Ｇ Ｂｌ ｕ ｂ ： ｌ ｋ ｒ 、 ， ｔ 。 月５５０ ７６乃，利用Ｐｍ ｒ ｘｒ阳论．软件（ ｌｄ 见图 １图２对 Ｃ 值统计分析结果见表 １从结果可 ｉ ｒ ｅＥｐ ｓ ０ ｅ 助ｐｅ ｉ 两个基因扩增稳定， 浓度较低的样品用较多 ｉ ｙｅ） Ｂ ｓｌ ｓ Ｏ ｓｌ 设计特异引 ｎ 物和探针， 序列如下毋ｔ６ １ 一 以看出， ７Ｆ ： 其ｔ ５橄 ｇｃ ｃ ｇ 枷ａ ３ Ｂ１ 一：５ｃ宜 ｔ ｃ ９ 的循环次数才能产生较高的荧光信号， Ｃ 值也相 ， ｄｇ ｇ ａ ｇ ， ｔ ６ 一 ａ 龟 ｃ － ， ７ Ｒ ，ａｇ ｇ 多 ． 一 ａｇ ｌ ｔ ｃｃ 一 ｐ ｂ沈电“ ｇｃ多ｃ ） ｔｔ ， ｏ ａａ ３ ｒ ｅ ｃ ｃ加ｇ ｃ 。玉米的内 ｃ ｇ ｔ 源基 应增大；另外同一参照样品重复间ｃ 值变异不大， ｉ ｅ 基因最大变异系数（Ｖ ） 夕 ， ｌ Ｃ ％ 为０ ２ Ｂ 乃 ９ｔ 因 Ｚｉ探针和引物序列参照中华人民共和国出入境 其中：ｎ ｅｎ ． 以样品 ６ ２ 浓度对数值对 检验检疫行业标准（ ０ ， ０） ２４ 探针５端分别用荧光报告 基因最大变异系数仅为。 ９。 ， ｔ 线， 其中２ｉ基因的 冶 ｎ 基团Ｆ Ｍ标记， 端用荧光淬灭基团Ｔ Ｍ Ａ标 Ｃ 值作标准曲 获取回归方程， Ａ ３ ， Ａ Ｒ 回归方程为：，１３ ｌ ７０， ｌ ｌ ７ ｘ２ １ ｔ ｙ ． ４＋ ， Ｂ 万基因的回归 ４ 记。所有探针和引物由Ａ Ｉ Ｂ 公司合成。
２方法验证和灵敏度检测 盒， 反应在２ 泌 的 ５ 体系中 进行， 其中ＺＴｑ ａｕ ２ ｘａ ｌ Ｍｌ ． － ｅ ａ Ｒ ｅ ｉＺ ｖ ｓ ｃ ａｔ ｎ ｌ ｍ ｒ Ｐ Ｍ ｓ ｌｘ ．泌， Ａ模板１ Ｌ ｌ ｒ ５ Ｄ Ｎ 卜， 正 为了验证该方法的特异性、 准确性和灵敏度， 设 反向引物各。 泌 （ 卜 ｏ ， ‘ ５ ２ ０ ２ ｍ 比）探针 １ １ 置５ 泌（ ０ 个己知的 转基因玉米样品，其中含Ｂｌ 的３ ｔ７ ６
２ １ Ｒ 血吃 ｅ ａ， ｏ３ Ｈ ｒａｄｚｅ ａ， ０３ ０ ；ｏ ｔ ｉ Ｚ ； ｅ ｎｅ ｔ ｉ ２ ； ． ｎ ．
基金项目 北京市科技计划重点项目Ｎ Ｚ ｓቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ） ： （Ｆ ｏ 一１
万方数据
转基因 玉米参照样品归ｔ ６ １ 购自刊 公司， ７ ） 业ａ 其
分子植物育种
Ｍ（ ｕ Ｐａｔ ｒｅｉ ， 址 ｌ ｎＢ ｄ ｇ ｌ ｃ ｅ ｅ ｎ
随着转基因产品的不断增加，在国际进出口贸 易中， 一些输入国 不仅要知道进口的产品是否含有 转基因成分， 而且还要查明该转基因成分来自 哪个 作物品系， 该品系是否获准进入本国， 其含量是否超
Ｙ ｇ ａ，ｏｓ Ｙｎ ａａ，ｏｓ 黄文胜等， 曲 ｅｌ Ｚ ａ ａ ｔｌ Ｚ ｂ ｔ． ； ｇ ． ； ２５ ０） ．本文根据已发 表的Ｂ１ 玉米其外源基因３ ｔ７ ６ ’ 末端序列以及与其相连的基因组序列 （ ｖｍｅ ｅ Ｔ ｅｉ ｔ ａ ｓ ｒ ．０ ｌ ２５ 设计特异引物和探针， ａ， ０） 建立了针对Ｂ１ 玉 ｔ７ ６
过 法 域 （ 本国 定的 值 桂枝等 ２ ５ 因 对某 ， ） 此针 个转 米定量检测技术，可以有效对玉米样品中转基因玉 ０ 。
基因作物品系的定量检测技术建立显得日 益重要。 米Ｂ１ 含量进行检测。 ｔ７ ６
转化体 特异检测方法 ｖ ｔ ｅｆ） 于检测外 伪 即一ｃｉ 由 Ｐ ｃ ｓ ｉ 源基 因末端（ 或３与玉米基因组Ｄ Ａ相接区伽ｔ ａ １材料与方法 ’ ５ 〕 Ｎ ｅ． ｒ ｇ 石 ｉ） 的ｓ 而表现强的特异性， 前多个作物转基因转 Ｌｌ材料 ｔ ｅ 目 化体都建立相应检测方法 （ｅ ｌ ｄ ｌＪ ｓ ｌ Ｂｒ ａ Ｈｓ ｅ ａ ｄ Ｏｏ ｔ 一 ｎ ｎ ｅ
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新思路、 新技术、 新方法 ｏｅ Ｔ ｎＯ Ｎ ｖ１ ｉ ｉ ＆Ｔ ｈＯ ｇ ｈ ｋ９ ｅ Ｉ ｃ ｏ ｎ ｙ
玉米样品中转基因玉米 Ｂ１ 含量检测 ｔ７ ６
吴明生， 田雷 云晓敏 贾希海 律宝春
北京市 种子管理 北京，侧〕 站 １洲 吕 １８
． 通讯作者， 曲 以２钾 的加口血 二 交） 曲 返 ．
摘 要 根据其检测特异性， 转基因产品检测技术可分为筛选、 基因、 构建和转化体特异性检测四 类。 于转 由 化体特异性检测方法的具有高度特异性， 前， 目 一些发达国家对于转基因产品 检测方法正逐步过渡到转化体 特异性序列的检测方法。 本研究针对转基因玉米Ｂｌ 的外源基因３端与玉米基因 ｔ７ ６ ， 组Ｄ Ａ相接区序列设 Ｎ 计具有转化体特异性的引物和荧光探针。利用实时荧光定量Ｐ Ｒ 以已 ｔｌ 含量样品为标准样品建立 ｃ ， 知Ｂ ７ ６ 内 外源基因 标准曲 利用该标准曲 线， 线对多个玉米样品Ｂ１ 玉米成分含量进行检测， ｔ７ ６ 结果显示该方法检测
ｔ７ Ｂ１ 玉米含 ６ 量为５％ｗ 哟 阴 ． （八 。 性玉米 。 样品由 本实 Ｉ ； ５℃２ ５ ｎ ｌ 变性９ ０ ， ０℃Ｉ ， 个循环。 退火６ ｎ ０ ｌ ４
验室收集。
２结果与分析
． ２１标准 曲线建立
１ 生化试荆 ． ２ Ｄ Ａ提取试剂盒购自 Ｎ 香港基因晶片有限公司，
利用Ｄ Ａ提取试剂盒提取含量为５ ｔｌ Ｎ ％的Ｂ７ ６ Ｎ， ｒ ｅ 玩购自 应用生物系统公司 （ｐｌ Ｂ ｓ－ 转基因玉米样品的Ｄ Ａ 通过四倍稀释制备五个玉 ｔＭ 美国 Ａｐｅｉ ｙ ｉ ｏ ｄ ０ Ｌ２ ０ ５ ｔｎ， Ｄ 其余试剂由 Ｏｓ Ｂ Ａ 。 上海生物工程有限公司提供。 米总基因组浓度分别为 ８ 侧卜 、 喇汕、