光温条件对三叶青愈伤生长及黄酮积累的影响

皿圆　澎江右　种学　２０１３年第９期　文献著录格式：钱丽华，毛碧增．光温条件对三叶青愈伤生长及黄酮积累的影响［Ｊ］．浙江农业科学，２０１３（９）：１０９８—１１００　光温条件对三叶青愈伤生长及黄酮积累的影响　

钱丽华　，毛碧增　（１．浙江大学，浙江杭州３１００５８；２．杭州市农业科学研究院，浙江杭州３１００２４）　

摘要：以三叶青叶片诱导的愈伤组织为试材，接种继代增殖，进行不同温度和光周期培养试验。结果表　明，三叶青愈伤组织的最适培养温度为２８℃，其愈伤平均鲜重增长率达到３９４．２０％，显著高于其他各处理；而　３４℃下愈伤组织全部死亡。光照能诱导三叶青愈伤组织中黄酮类化合物的形成和积累，２４　ｈ・ｄ　光照为其适宜　光周期，总黄酮含量达到２０．２３　ｍｇ・ｇ～。　关键词：愈伤组织；继代；温度；光周期；鲜重增长率；总黄酮　中图分类号：Ｓ　５６７　文献标志码：Ａ　文章编号：０５２８—９０１７（２０１３）０９—１０９８—０２　

三叶青是中国特有珍稀中药植物，又名三叶崖　爬藤、金线吊葫芦、蛇附子等，含有黄酮、多糖等　生物活性成分，对多种癌症细胞株系具有促进细胞　凋亡的作用，且对ｄ，ＪＬ高热、支气管炎、病毒性脑　膜炎、血液病、心脑血管疾病、抗艾滋病毒和抗肿　瘤治疗方面具有疗效，被称为安全无毒的“植物　青霉素”。目前因过度采挖其野生资源已濒临灭　绝。虽三叶青组培快繁和扦插技术均已得到解决，　但其块根形成周期长，产量低，无法满足市场需　求，因此利用组织培养生产次生代谢物是解决供需　矛盾的可行途径之一。　目前对三叶青黄酮的研究集中在药理作用上，对　愈伤组织的研究集中在诱导分化上，对光照和温度条　件的研究还较少　。本研究旨在探索温度、光周期　等培养条件对三叶青愈伤生长及次生代谢物形成积累　的影响，为规模化生产三叶青黄酮提供参考。　ｌ材料与方法　１．１材料、试剂及仪器　外植体试验材料采自建德市，取其叶片为外植　体诱导愈伤组织，并以此为试验材料。　培养基采用ＭＳ基本培养基，芦丁标准品（德　国Ｄｒ．Ｅｈｒｅｎｓｔｏｒｆｅｒ　ＧｍｂＨ），微波萃取仪（美国　ＣＥＭ公司生产），ｕＶ一２５５０紫外分光光度计。无水　乙醇（国药集团化学试剂有限公司），亚硝酸钠　（天津博迪化工股份有限公司），硝酸铝（上海山　浦化工有限公司），ＮａＯＨ（杭州化工试剂有限公　司），以上均为分析纯。　１．２处理设计　１．２．１　温度试验　将三叶青叶片来源愈伤组织接种在・ＭＳ＋６一ＢＡ　２．０　ｍｇ・Ｌ　＋ＮＡＡ　０．２　ｍｇ・Ｌ‘。中，每处理８瓶，　每瓶接５个。称取愈伤块原始质量　，分别放置　在２３℃，２５℃，２８℃，３０℃，３４℃的光照培养　箱中１２　ｈ・ｄ　培养３０　ｄ后，再称取愈伤块质量　

，计算３０　ｄ内愈伤鲜重增长率。愈伤鲜重增长　率／％＝（　一　）／Ｗｏ×１００。　１．２．２光周期试验　将三叶青叶片来源愈伤组织接种在ＭＳ＋６－ＢＡ　２．０　ｍｇ・Ｌ　＋ＮＡＡ　０．２　ｍｇ・Ｌ　培养基中，每个处　理５．瓶，每瓶接种７个愈伤块，培养温度为（２７．－Ｉ－　１）℃，分别进行２４　ｈ・ｄ　和１２　ｈ・ｄ　光照及暗　培养３０　ｄ后，测定各处理愈伤组织中总黄酮的　含量。　１．３总黄酮测定　洗去愈伤组织表面琼脂，吸干表面水分，置于　电热干燥箱中于１０５℃下干燥０．５　ｈ，使酶失活；　然后６０℃干燥后，用研钵磨细，继续干燥至恒重。　测定方法参照文献［６］（经改良）。　对照品溶液。精密称取１２０℃干燥至恒重的芦丁　标准品２．３９４　５　ｍｇ于２５　ｍＬ容量瓶中，加适量５０％乙　醇超声溶解，放冷，用５０％乙醇定容至２５　ｍＬ，即为　对照品溶液（芦丁浓度为０．０９５　７８　ｍｇ・ｍＬ　）。　供试品６０％乙醇溶液。称取０．３　ｇ供试品于萃　取管中，加入７．５　ｍＬ，于微波萃取仪８０　ｃｌＣ下提取　２５　ｒａｉｎ，提取２次，合并提取液。其他同文献［６］。　

收稿日期：２０１３－０６－０２　作者简介：钱丽华（１９７５一），女，浙江杭州人，高级农艺师，在职硕士，从事植物生物技术研究工作。Ｅ—ｍａｉｌ：ｍｅｎｏｙ＠ｈｚ．ｃｎ。　堡　：等　光温条件对三叶青愈伤生长及黄酮积累的影响皿囡　比色测定同文献［６］方法。　标准曲线。分别移取供试品溶液１．０，２．０，　３．０，４．０，５．０，６．０　ｍＬ，按比色测定步骤执行。　

２结果和分析　２．１　不同培养温度对叶片愈伤继代培养的影响　在５个不同温度处理下，以３４℃效果最差，　叶片愈伤死亡率高达１００％。说明三叶青叶片愈伤　对３４　ｃＩ＝以上高温较敏感；另外４个温度处理中，　２８℃下的叶片愈伤组织鲜重增长率达到３９４．２０％，　显著优于其余各处理；其他３个处理间无显著差　异。故２８　ｃＩ＝培养温度最适于三叶青叶片愈伤的生　长；超过３４℃，则愈伤组织受到高温伤害后无法　修复而逐渐死亡（图１）。　婴　培养温度／℃　图１　不同培养温度下愈伤鲜重增长变化　２．２不同光周期对叶片愈伤中总黄酮含量的影响　３种光周期处理后，２４　ｈ・ｄ　光照有利于三叶　青叶片来源愈伤组织中次生代谢物黄酮类化合物的　积累。该处理下愈伤组织颜色深绿，结构致密，但　表层有褐化现象，总黄酮含量达２０．２３　ｍｇ・ｇ一１・　ＤＷ　（表１）；１２　ｈ・ｄ　光照下愈伤组织浅绿，　结构致密；黑暗条件下愈伤颜色为淡黄色，表层组　织疏松，总黄酮含量明显低于２４　ｈ・ｄ　的光照处　理。因此，２４　ｈ・ｄ　的光照处理是三叶青愈伤组　织中黄酮类化合物积累的适宜培养条件。　表１　光周期对愈伤鲜重增长及总黄酮含量的影响　３小结与讨论　植物组织培养中，光温条件是影响生长发育的　关键因子，如何根据植物特性控制培养条件是组培　中的重要问题　。植物生长发育具有温度三基点，　即最低温度、最适温度和最高温度。在最适温度　下，植物细胞生长、分裂活跃，植物生长最快。本　试验中，２８℃是三叶青愈伤生长的最适温度。　研究表明，光照在诱导分化时可激活某些酶的　活性和光诱导的叶绿体代谢产物，从而影响细胞的　生长和次生代谢物的积累　，但影响的效果因植　物种类、试验材料而异。光照对许多植物中黄酮类　化合物的合成有诱导作用　ｊ，叶绿体分化也与黄　酮积累有关　，或者光照对苯丙氨酸解氨酶具有　激活作用　。试验中，２４　ｈ・ｄ　连续光照有利于　三叶青叶片来源愈伤组织中次生代谢物黄酮类物质　的积累，而黑暗抑制黄酮化合物的合成。这与彭昕　等　的研究结果一致。这为今后利用组培技术规　模化生产三叶青黄酮提供了技术支撑。　另外，蔗糖、无机盐、ｐＨ、前体物质等对植　物组培次生代谢物的形成和积累都存在一定的影　响，后期可开展上述因素对三叶青愈伤组织中黄酮　积累的影响研究，建立起三叶青愈伤组织生产黄酮　的可行技术工艺。　

参考文献：　［１］　卢爱芳，祁明君，李宗亮，等．三叶青愈伤组织培养及其总黄　酮含量的研究［Ｊ］．中药材，２０１０，３３（７）：１０４２—１０４５．　［２］　彭听，林言娜，何军邀，等．培养条件对三叶青愈伤组织　生长及总黄酮含量的影响［Ｊ］．药物生物技术，２０１２，１９　（２）：１３８—１４１．　［３］　彭听，张剑，何军邀，等．三叶青松散型和致密型愈伤组　织悬浮培养及黄酮积累的比较研究［Ｊ］．中草药，２０１２，　４３（３）：５７７—５８０．　［４］　彭听，汪荣斌，何军邀，等．三叶青颗粒状愈伤组织悬浮　培养系的建立及培养条件的优化［Ｊ］．中草药，２０１２，３４　（５）：９６１—９６５．　［５］　吴浩，彭听，林言娜，等．三叶青愈伤组织诱导及分化培　养基筛选［Ｊ］．现代农业科技，２０１１（２１）：１２１—　１２２，１２５．　［６］　楼肖成，郭重．三叶青总黄酮提取工艺研究［Ｊ］．海峡药　学，２０１１，２３（１１）：９—１２．　［７］　沈海龙．植物组织培养［Ｄ］．北京：中国林业出版　社，２００５．　［８］　卢文芸，张宇斌，罗迎春，等．不同培养条件对环草石斛　愈伤组织中次生代谢产物的影响［Ｊ］．安徽农业科学，　２００９，３７（３３）：１６３６５．　［９］　Ｆｕｇｌｅｖａｎｄ　Ｇ，Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｊ．ｕＶ－Ｂ，ｕＶ—Ａ，ａｎｄ　ｂｌｕｅ　ｌｉｇｈｔ　ｓｉｇｎａｌ　ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ　ｐａｔｈｗａｙｓ　ｉｎｔｅｒａｃｔ　ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃａｌｌｙ　ｔｏ　ｒｅｇｕｌａｔｅ　ｃｈａｌｅｏｎｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ，１９９６，８：２３４７．　田固　澎江右Ｊ－：矸学　２０１３年第９期　文献著录格式：方献平，郑军辉，王菊英，等．杭州市水生蔬菜栽培现状及发展对策［Ｊ］．浙江农业科学，２０１３（９）：１１００—１１０３　杭州市水生蔬菜栽培现状及发展对策　方献平　，郑军辉　，王菊英　，忻雅　，肖文斐　，裘劫人　，阮松林　，马华升　（１．浙江省杭州市农业科学研究院，浙江杭州３１００２４；２．杭州市农业局，浙江杭州３１０００２）　

摘要：通过对杭州市水生蔬菜产业特点、优势及产业现状的剖析，从面积、产量、区域分布和栽培技术　等各个方面分析杭州市水生蔬菜产业存在的问题，提出发展对策。　关键词：水生蔬菜；现状；对策；杭州　中图分类号：Ｓ　６４５　文献标志码：Ａ　文章编号：０５２８－９０１７（２０１３）０９—１１００—０４　

水生蔬菜是我国农业一项特殊种植业，最少已　有２　５００多年的栽培历史，欧美等西方发达国家因　基本没有种植，称这些蔬菜为中国特菜。目前世界　公认的莲藕、芋头、菱白、慈姑、水芹、芡实、　菱、药菜、蒲菜等１２类水生蔬菜，只有我国及周　边几个国家少量种植，种植模式均较粗放。只有我　国和Ｅｔ本对这些水生蔬菜进行了研究。据保守推　算，我国的水生蔬菜种植面积已超过６６．７万ｈｍ　，　产值超过３０亿元，居世界第一。我国的部分水生　蔬菜已开始采用试管育苗，有的已进入到分子研究　阶段，种植技术也居世界领先地位。　与其他蔬菜及大农业的其他种植相比水生蔬菜具　有明显的优势：大部分为我国原产和特有，我国农民　有较成熟的栽培经验；相对于其他蔬菜及农作物而　言，污染较低或没有污染，对人体健康，尤其是对预　防心脑血管疾病十分有利；国内蔬菜价格只有国际市　场的１／５—１／１０，水生蔬菜在１／１０左右，国际销售市　场前景看好。杭州市水生蔬菜栽培历史非常悠久，里　叶白莲早在南宋就被钦定为皇家贡品，西湖莼菜、处　州白莲等在国内外享有较高的知名度。随着杭州市种　植业结构的调整优化，各区县充分利用当地自然资源　优势，大力发展水生蔬菜。目前杭州市水生蔬菜主要　有茭白、莲藕、芋、荸荠、莼菜、芡实、水芹等。水　收稿日期：　基金项目：　作者简介：　通信作者：　生蔬菜产业的快速发展，在发展杭州高效生态农业，　促进农业增效、农民增收、丰富“菜篮子”产品、保　障蔬菜有效供给等方面发挥了重要作用。　ｌ现状和问题　１．１面积和产量　进入２１世纪，杭州市水生蔬菜种植面积尽管　不同年份有所变化，但基本保持平稳，最近６年面　积有略微增加的趋势。全市水生蔬菜总产量也基本　保持稳定。２００７年，全市水生蔬菜种植面积为３　８７０　ｈｍ　，总产７．６万ｔ。２０１２年，全市水生蔬菜种　植面积４　１３０　ｈｍ　，总产约７．９万ｔ（表１—２）。茭　白种植面积是所有水生蔬菜中最大的，２００６年来　的种植面积基本稳中有升，２００７年全市茭白种植　面积１　４７０　ｈｍ　左右；茭白总产量呈波动增加的趋　势，特别是近３年产量稳定增加，从２０１０年的　３．９万ｔ增加到２０１２年的４．６万ｔ。从统计资料看，　近几年莲藕种植面积呈不断增加的趋势，由２００７　年的５３０　ｈｍ　增至２０１２年的９３０　ｈｍ　；产量从２００７　年的１．２万ｔ增至２０１２年的１．８万ｔ。荸荠种植面　积则有所下降，由２００７年的近３５０　ｈｍ　下降到　２０１１年的２９０　ｈｍ　；总产量也是稳中有降，从２００７　年的近０．６万ｔ下降到２０１２年的０．４万ｔ。