革兰阴性杆菌耐药性检测进展

2、三维试验
• 什么叫三维？ • 纸片上的药物向培养基中扩散为一维。 • 琼脂平板上的细菌产生的抗药性酶向培 养基中扩散是二维。 • 在纸片旁边的琼脂刻一裂缝，在其中加 入受试菌液，该菌产生的抗药性酶向四 周的琼脂中扩散是第三维。
2、三维试验有2种方法
• 直接法（用同一菌株）
• 间接法（用不同菌株）
（四）ESBLs种类
• ESBLs现有TEM、SHV、CTX酶，CTX 酶为一种新型酶。 • 1、TEM酶有90多种其中ESBLs63种， IRT23种，有些TEM酶有替代名称，如 TEM-5为CAZ-1，TEM-8为CAZ-2， TEM-16为CAZ-7，TEM-25为CTX-2， TEM-35为IRT-4等。
ESBLs菌株的检测方法
• 目前检测ESBLs菌株有几种方法（除外 分子学方法）都共同应用一个原理，即 头孢类抗生素与ß-内酰胺酶抑制剂克拉 维酸联合应用，克拉维酸抑制ESBL，细 菌对头孢类抗生素减少耐药性。具体检 测方法有：
1、双纸片协同法
• 按照标准纸片扩散法操作，在测试菌涂布在M-H 琼脂平版上后将含克拉维酸（棒酸）的阿莫西林 纸片贴在平板中央，然后在其周围分别贴上头孢 他定（CAZ）、头孢噻肟（CTX），氨曲南 （AZT）纸片，与含棒酸纸片距离为15mm-20mm （纸片边缘到边缘），放置35℃18h，出现协同现 象为ESBLs菌株。在检测大肠埃希菌和肺炎克雷伯 菌时用CTX和AZT较CAZ易于观察结果，试验中 发现阴沟肠杆菌中产ESBLs菌株用CAZ优于CTX。 因此检测产ESBLs菌株时最好同时使用CAZ和CTX 以利于提高检出率。
• 3.外膜存在着药物泵出系统（Tet膜蛋白 介导）使进入菌体内的药物主动泵出导 致菌体内药物浓度降低，如对四环素类 和喹诺酮类耐药等。
• 4.靶位的改变： ß-内酰胺酶类抗生素通 过与青霉素结合蛋白（PBPs）结合而抑 制细菌生长，当靶位改变后抗菌药物不 能与其结合而失去作用。对磺胺耐药是 由于细菌改变体内二氢叶酸和合成酶， 与磺胺药的亲和力降低引起的。
• 2、SHV酶有30种，其中ESBLs24种，4 种还未报道。 • 3、CTX酶为一种新型酶，CTX-M-1到 CTX-M-9，这些酶与TEM和SHV酶没有 密切关系， CTX-M-2为最常见流行的 ESBL。
• OXA（苯唑西林）酶中发现有几个型是 ESBLs， OXA酶属于Bush分类D组2d型。 OXA-11，-14，-16和-17是OXA-10的衍 生物， OXA-2是OXA-2的衍生物。这组 ESBLs菌株对头孢菌素弱耐药。
2be A
超广谱ß-内酰 胺酶
2br A 2c A
耐ß-内酰胺酶 抑制剂
青霉素和窄谱 头孢菌素类
–
–
水解羧苄西林， 青霉素，包括 ß-内酰胺酶 羧苄青霉素
+ –
功能 表
分子 分类
ß-内酰胺酶 种类 水解苯唑青霉 素，ß-内酰胺 酶 被棒酸抑制的 头孢菌素酶 非金属碳青酶 稀酶 金属ß-内酰胺 酶 金属ß-内酰胺 酶 金属ß-内酰胺 酶 不被棒酸抑制
一、G-b的耐药机理
• 1.细菌产生ß-内酰胺酶可水解ß-内酰胺酶 类抗生素，这是最重要和最常见的耐药 机制。细菌产生氨基糖苷类钝化酶对氨 基糖苷类如庆大酶素耐药，喹诺酮类耐 药是由于DNA旋转酶改变或药物渗透性 改变。
• 2.抗生素的渗透障碍：由于细胞壁障碍或 细胞膜通透性改变抗生素无法进入菌体 内发挥抗菌作用，当细菌外膜微孔蛋白 缺失后抗生素也不能进入菌体。
• 这种耐药性也播散到大肠埃希菌的某些菌 株，还有少数其它革兰阴性杆菌。对这种 耐药性产生机制的调查结果显示，由旧质 粒介导的TEM和SHVß-内酰胺中还存在新 型式的酶。旧酶的结构基因编码发生突变， 产生比亲代酶具有更广谱底物的衍生物。 这些具有超广谱作用底物的新的酶包括第 二、三代头孢类抗生素和胺曲南。因此它 们被命名为超广谱ß-内酰胺酶（ESBLs）。
• 以后用数字来表示如TEM-30为IRT-2， TEM-31为IRT-1，TEM-2为IRT-3等，共 有IRT-23种；还有SHV-1的变种和相关的 酶。耐抑制剂ß-内酰胺酶菌株有大肠埃 希菌，肺炎克雷伯菌，产酸克雷伯菌， 奇异变形杆菌和弗劳地枸橼酸杆菌。这 些细菌对阿莫西林/克拉维酸，替卡西林/ 克拉维酸和氨苄西林/舒巴坦耐药。
• 随着80年代初期发现产ESBL菌株。在80 年代后期由于ß-内酰胺类抗生素与ß-内酰胺 酶抑制剂联合应用不断增加，出现了耐 抑制剂ß-内酰胺酶（Inhibitor-resistantßLactamases），研究发现耐克拉维酸的ß内酰胺酶核酸序列是TEM-1或TEM-2的 变种，称为IRT（Inhibitor resistant TEM ß-Lactamases）。
• 5.非水解屏障机制：主要是染色体介导的 1型ß-内酰胺酶细菌如绿脓杆菌，肠杆菌 等对头孢类抗生素耐药并非抗生素的ß内酰胺环水解，而是由于非水解屏障的 形成，由于ß-内酰胺酶类药物与质周空 间诱导产生的ß-内酰胺酶结合成无生物 活性的复合物而不能进入靶位发挥抗菌 作用。
• 细菌同时具有以上两种以上耐药机制就 产生了对多种抗生素的耐药性。
作用最佳底物
被抑制
棒酸 EDTA
代表酶
2d D 2e 2f 3a A A B
青霉素类包括氯 唑西林 头孢菌素类
± – + – + – + – – – + +
OXA-1到OXA-30
脆弱类杆菌CepA，变形杆 菌FPM-1，嗜麦芽窄食单 胞菌L2 IMI-1，NMC-ASme-1
青霉素头孢菌素 类和碳青酶稀类 青霉素类，头孢 菌素类，碳青酶 稀类 碳青酶稀类 头孢菌素类 碳青酶稀类 青霉素类
（五）产ESBL菌株
• 1、肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌是最常见ESBLs 菌株，从产酸克雷伯菌，阴沟肠杆菌，产气肠 杆菌，沙雷菌和奇异变形杆菌等肠杆菌科细菌 分离出产ESBLs菌株。 • 2、出产ESBLs菌株在全球传播。不同国家和地 区都有不同报道，如产ESBLs肺炎克雷伯菌在 美国的发生率为3%左右，但有的地区高达25%。 荷兰16%，比利时31%，葡萄牙49%，土耳其 9%，韩国23%，国内报道6%-57%，在大肠埃 希菌中产ESBLs菌株检出率为17-30.2%左右。
• 二、新型ß-内酰胺酶的产生、传播，增 加了G-杆菌的耐药性。
• 1.60年代初期从大肠杆菌中首次发现质粒 介导的tem-1 ß-内酰胺酶，随后在全球转 播并在许多不同菌株中发现如肠杆菌科， 铜绿假单胞菌等。
• 2.70年代开始，一些新的ß-内酰胺类抗生素应用 于临床，试图来治疗一些革兰阴性杆菌引起的感 染，因为这些细菌已对同类旧的一代抗生素产生 了耐药性。这些新的药物包括第二、三代的头孢 抗生素，如头孢呋新（cefuroxime）、头孢孟多 （cefamandole）、头孢噻肟（cefofaxime）、和 头孢他啶（ceftazidime），以及单酰胺菌素胺曲 南。在新的ß-内酰胺类抗生素广泛使用后，出现 了耐授这些新药的肺炎克雷伯菌。由这些异常耐 药菌株所造成的感染也随之出现。
革兰阴性杆菌耐药性检测进展
华鑫科技有限公司技术部 吕苏成 2005、09
前言
• 革兰阴杆菌是院内感染的重要病原菌， 在感染中常居首位，由于其具有多重耐 药，而且耐药率高，特别是对第三代头 孢菌素和单环酰胺类等新的广谱菌药耐 药，给临床治疗带来很大困难，为止引 起了国内外学者的高度关注，他们在研 究简便、快速检出方法及其耐药机理和 选择治疗用药等方面取得了很大进展， 并已不少报道。
二、ESBLs产生机制
• ESBLs的产生是由于第三代头孢菌素的广泛应 用，药物选择性压力导致广谱ß-内酰胺酶TEM1，-2或SHV-1基因突变。1982年英国报道一株 产TEM-1产酸克雷伯菌最初庆大耐药，对孢头 他啶敏感，使用孢头他啶后对其耐药，基因分 析发现TEM-1结构中第164位上精氨酸变为丝 氨酸，命名为TEM-12。1983年德国首例报道 的产ESBLs臭鼻伯菌在SHV-1第238位上的甘氨 酸变成了丝氨酸，SHV-2。总之ESBLs是在 TEM-1，-2或SHV-1结构中的少数位点1-4个氨 基酸发生基因突变，使其产生ESBLs表型。
腊样芽孢杆菌11，CcrA、 IMP-1、L1、VIM-1、 VIM-2 Cph、AsbM1、ASA-1、 ImiS ß-内酰胺酶来自高曼军团 菌 ß-内酰胺酶来自洋葱伯克
3b B 3c 4 B ND
– –
ß-内酰胺酶的命名
• 根据作用的底物如CARB、IMP、OXA、 CAI、CTX等； • 根据生化特性如SHV； • 根据基因如Amp、CepA； • 根据细菌如AER、PSE； • 根据患者名如TEM、ROB； • 根据医院如MIR、RHH、州名（OHIO） 等命名
1、ESBLs菌株治疗选药原则
• 碳青酶稀类如亚胺配能 • 含ß-内酰胺酶抑制剂复合抗生素，如舒 普深，特治星等。 • 氨基糖苷类抗生素，阿米卡星 • 头酶稀类抗生素，头孢西丁
2、预防措施
• 控制超广谱抗生素第三代头孢菌素等的 使用。 • 预防自身感染和交叉感染。 • 发现产ESBLs菌株爆发流行，应该立即 采取感染控制的处理方法，如关闭病房 彻底消毒等。 • 发现散发的ESBLs感染株应选择有效药 物清除它，对环境要彻底消毒。
• 90年代初期因头霉素如头孢西丁应用增 多出现了质粒介导的AmpC酶，对头霉素 耐药。 • 90年代后期因碳青霉稀酶，对碳青酶稀 类 抗生素耐药。新酶的产生导致了G-杆 菌耐药谱的变化，并对多种超广谱抗生 素耐药。
一、超广谱ß-内酰胺酶 （ESBLs）
• ESBLs（Extended Spectrumß-lactamases） 特性： • ESBLs是丝氨酸蛋白酶的衍生物能于ß-内酰 胺环的羧基共价结合使酰胺键水解，可水 解青霉素类，头菌孢素和单环酰类抗生素， 特别是能水解第三代，如头孢他啶、头孢 噻肟等和水解单环酰胺类，如氨曲南等并 对四代头菌孢素如马斯平也能部分水解。 ESBLs是质粒介导的能被克拉维酸抑制， 不被EDTA抑制。