分子生物学实验课件讲稿

、菌株复壮与单菌落菌株的获取

一、实验目的

学习细菌培养的LB培养基及抗生素抗性筛选培养基的配制，掌握高压灭菌和获取细菌单菌落菌株两种基本实验操作技能。

二、实验材料、设备及试剂

1、实验材料

大肠杆菌（E. coli） DH5α菌株：R-，M-，Amp-

2、实验设备

恒温摇床，电热恒温培养箱，无菌工作台，高压灭菌锅3、试剂

酵母浸膏，蛋白胨，氯化钠，琼脂，卡那霉素

三、实验步骤

液体LB（Luria-Bertain）培养基配方：

蛋白胨(typtone) 1.0% （1 g/100 ml）

酵母提取物(Yeast extraction) 0.5% （0.5g/100 ml）

氯化钠 1.0% （1 g/100 ml）

PH 7.0　

固体LB培养基：每100 ml液体培养基中加入1.5g琼脂粉

请按试剂瓶上的编号使用相应编号的药勺取药，防止药品相互污染！

(1) 每组按上述液体LB培养基配方，以配制100ml的量称

取药品放入烧杯。

(2) 用量筒量取约80 ml 蒸馏水注入烧杯中，玻棒搅拌使

药品完全溶解后用100ml量筒定容至100ml。

(3) pH试纸检测pH值，并用1 N NaOH或1 N HCl调节pH

值至7.0。

(4) 将100ml溶液分装入两个三角瓶，每瓶为50ml。

(5) 按固体培养基配方称取适量琼脂粉分别放入两个三角

瓶中，以配制成两瓶50ml固体LB培养基。

(6) 两个三角瓶分别用锡纸包扎瓶口。并用记号笔在三角

瓶上标注各组标记。

(7) 把装有培养基三角瓶放入灭菌锅中，盖上锅盖，以对

称方式拧紧锅盖，打开排气阀通电加热，至有连续的

白色水蒸气从排气阀排出时，关闭排气阀。当高压锅

温度（气压）指示器指示锅内温度升高至

121℃（0.1Mpa）时，调节电压（或利用手动开关电

源的方式）使高压锅稳定在该温度（压力）下20

min，然后断开电源。待指示器指示压力降为0时，方

可打开排气阀，然后再打开锅盖小心取出锅内物品。

(8) 取出三角瓶后，在酒精灯火焰旁进行下述操作。

(9) 取其中的一瓶直接倒培养皿，每皿倒入的量以刚好能

在培养皿底铺展成薄薄的一层即可。每组倒1块培养

皿，在皿盖上用记号笔写上“LB”及各组的标记。(10) 另外一瓶培养基待温度降低至60℃左右时（刚能感觉

不烫手），向培养基中加入0.1ml 50mg/ml的氨苄青

霉素（Amp）溶液，使培养基中Amp的终浓度为

50mg/L。快速充分混匀后每组倒1块培养皿，在皿盖

上标注“LB+”及各组的标记。

(11) 接种环蘸取菌液，密密划线。

(12) 倒置于37℃恒温培养箱中进行培养。

(13) 一天后观察菌落。

四、思考题

(1) 在说明本实验所用的菌种时用到这样的符号：“R-，

M-，Amp-”，这告诉我们关于该菌种的什么信息？

(2) 在步骤7中，为何须待连续的白色水蒸气从排气阀排

出时才能关闭排气阀？当灭菌完毕，为何又须待高

压锅指示器指示压力降为0时才能打开高压锅，而且

操作次序必须是先打开排气阀然后才能打开高压锅

盖？

(3) 在步骤12中，为何需将涂有菌的培养皿倒置于37℃

恒温培养箱中进行菌的培养？为什么不是正放呢？

(4) 你预计该实验结果是什么，即两种培养基上菌的生

长情况如何？

实验二 碱裂解法小量提取质粒DNA

一 实验目的

了解少量质粒制备方法与原理，掌握碱法小量提取质粒DNA的操作步骤。

二 实验原理

本实验利用NaOH破坏菌体细胞使核酸物质从细胞中释放出来，因此称为碱裂解法抽提。十二烷基磺酸钠(SDS)能裂解细菌细胞膜，但更重要的作用在于其与钾离子反应后所引起的溶液中绝大部分蛋白质以及基因组DNA共沉淀。由于还有很多蛋白质不能被共沉淀掉，因此要进一步用酚、氯仿对溶液进行抽提。最后加入2倍体积的无水乙醇或0.7倍体积的异丙醇沉淀就能得到质量稳定的质粒DNA。从细菌中分离质粒DNA的方法主要包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。

三 实验材料

转化质粒pUC19后经氨苄抗性筛选获得的E. coli DH5α系列菌株

四 实验设备

微量取液器(100μl,1000μl)， 台式高速离心机

五 试剂

溶液Ⅰ：50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris.Cl (pH8.0)，10mmol/L EDTA (pH8.0)。 溶液Ⅰ可成批配制,每瓶100ml,高压灭菌15分钟,储存于4℃冰箱。

溶液Ⅱ：0.2 mol/L NaOH 、1％ SDS (临用前用0.4mol/L NaOH和2％ SDS母液稀释)。

溶液Ⅲ：5 mol/L KAc 60ml，冰醋酸 11.5ml， H2O 28.5ml，定容至100ml, 并高压灭菌。溶液终浓度为: K+ 3mol/L, Acˉ 5mol/L 饱和酚、氯仿、TE缓冲液

六 实验步骤

1. 用移液枪取1.5ml培养液放入1.5ml eppendorf管中，5000 rpm 5 min收集菌体；

2. 弃上清,将管倒置于吸水纸上尽量使液体流尽；　

3.　菌体沉淀重悬浮于200μl溶液Ⅰ中；

4. 按试剂配方配制溶液Ⅱ，加入新配制的溶液Ⅱ200μl, 盖紧管口，快速温和上下颠倒eppendorf管数次以混匀溶液(千万不要振荡，动作轻柔)；

5. 立即加入200μl预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口并温和颠倒离心管数次，混匀溶液，置冰浴中10分钟；

6. 12000 rpm离心10分钟；

7. 加入等体积的酚/氯仿(1:1)，颠倒混匀， 12000 rpm 10分钟；

8. 小心吸取上清夜移入干净eppendorf管中，加入2倍体积的无水乙醇，振荡混匀后置于-20℃冰箱中20分钟；

9. 12000 rpm离心10分钟；

10. 弃上清, 将管倒置于吸水纸上使所有液体流出，加入200μl预冷的70％乙醇洗涤沉淀。

11. 同步骤10，重复洗涤沉淀一次；

12. 弃去乙醇溶液，将管倒置于吸水纸上使液体流尽，室温或37℃下干燥；

13、将沉淀溶于5μl TE缓冲液(pH8.0，含20μg /ml RNaseA)中，储于-20℃冰箱中。

[注意]

1. 提取过程应尽量保持低温。

2. 提取质粒DNA过程中除去蛋白很重要,采用酚/氯仿去除蛋白效果较单独用酚或氯仿好。最好在用酚/氯仿抽提一次后再用氯仿抽提一次，以去除残留的酚对质粒的后继实验，如酶切反应等的不良影响。

3. 沉淀DNA通常使用冰冷的无水乙醇,在低温条件下放置时间稍长可使DNA沉淀完全。沉淀DNA也可用异丙醇，但由于常把盐沉淀下来，所以多数还是用乙醇。

4. 质粒DNA分子小，所以没有变性，染色体变性后不能复性。

5．用碱法分离质粒DNA时，染色体DNA之所以可以被除去，是因为：C、D

A.染色体DNA断成了碎片

B.染色体DNA分子量大，而不能释放

C.染色体变性后来不及复性

D.染色体未同蛋白质分开而沉淀

七 思考题

1.溶液I中葡萄糖和EDTA各有什么作用？

答：葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解。

EDTA：（1）螯合Mg2＋、Ca2＋等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶

对DNA的降解作用（DNase作用时需要一定的金属离子作辅基）;

（2）EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求

有较低的离子强度的环境。

2. 溶液II为何必需即用即配？

答：NaOH溶液长时间配制存放会与空气中的CO2反应，降低PH值，影响对细胞的裂解作用。

3. 加入溶液II后作用时间不能长，需要快速加入溶液III中和碱性溶

液。如果溶液II的作用时间过长或者反应过于激烈会导致什么后

果？

答：作用时间过长会使细菌的基因组DNA被打断，从而不能被彻底沉淀除去，影响质粒DNA的纯度。

4. 在变性蛋白质的过程中，为何必须注意不要将酚残留在上清液中？答：残留的酚对核酸酶具有抑制作用，因而会影响后面质粒DNA的酶切反应。

5. 最后DNA沉淀可以溶解在双蒸水（ddH2O）中，但最好溶解于TE缓冲液中，为何？

答：由于缓冲液是TrisH+/Tris，不存在金属离子的干扰作用，故在提取或保存DNA时，大都采用Tris-HCl系统，而TE缓冲液中的EDTA更能稳定DNA的活性。

实验三琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA

一、实验目的：

学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术，了解质粒DNA电泳条带的多态性

二、实验原理

DNA分子在琼脂糖凝胶中时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。在一定的电场强度下, DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应.具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样,可进行分离.凝胶电泳不仅可分离不同分子质量的DNA,也可以分离相对分子质量相同,但构型不同的DNA分子。

在细菌细胞内,共价闭环质粒以超螺旋形式存在。在提取质粒过程中，除了超螺旋DNA外，还会产生其它形式的质粒DNA。如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂,分子就能旋转而消除链的张力,形成松驰型的环状分子,称开环DNA(Open circular DNA, 简称 ocDNA)；如果质粒DNA的两条链在同一处断裂,则形成线状DNA(Linear DNA)。当提取的质粒DNA电泳时,同一质粒DNA其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快，开环与线状分子的泳动亦有差异，于是在电泳时会产生三个条带的现象。

三、试剂与仪器设备：

1. 质粒DNA

2. 琼脂糖

3. 6×载样buffer 0.25% 二甲苯青FF，0.25% 溴酚蓝，30% 甘油

4．50×TAE 电泳Buffer 12.2g Tris，2.85ml 冰醋酸，10ml 0.25 mol/L EDTA(pH8.0)，加水至50ml。

5．溴化乙锭(EB)溶液 10mg/ml(避光保存)，每100ml琼脂糖凝胶加5μl贮存液，即凝胶中EB 终浓度为0.5μg/ml，此试剂为强致癌物，要戴手套操作，避免污染环境。

6. DNA Marker：共6条带，2000bp、 1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。上样6ul时750bp的带约为100ng，其余带约为50ng

7．各种国产移液器(10，20，100μl)

8．消毒的tips枪头

9．水平电泳槽和电泳仪

四、实验步骤

1、胶液的制备：称取0.4g琼脂糖,置于锥形瓶中,加入50ml 1×TAE稀释缓冲液,放电炉上加热至琼脂糖全部熔化,取出摇匀,此为0.8％琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜,以减少水份蒸发。

2、胶板的制备：将有机玻璃胶槽两端分别用挡板隔出需要制胶的空间，将胶槽置于水平支持物上,插上样品梳子,注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙。用移液器吸取少

量融化的琼脂糖凝胶封挡板内侧,待琼脂糖溶液凝固后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内,使胶液形成均匀的胶层。倒胶时的温度不可太低,否则凝固不均匀,速度也不可太快,否则容易出现气泡。待胶完全凝固后拨出梳子,注意不要损伤梳底部的凝胶,然后向槽内加入1×TAE缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。因边缘效应样品槽附近会有一些隆起,阻碍缓冲液进入样品槽中,所以要注意保证样品槽中应注满缓冲液。

4、加样：取1μl DNA溶液与适量载样缓冲液混匀,用微量移液枪小心加入样品槽中。质粒DNA加样完毕，选取一个未加样点样孔加入6ul DNA Marker。注意每加完一个样品要更换tip枪头,以防止互相污染,注意上样时要小心操作,避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。

5、电泳：加完样后,合上电泳槽盖,立即接通电源。控制电压保持在5V/cm。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2～1cm时,停止电泳。

6、染色：未加EB的胶板在电泳完毕后移入0.5μg/ml的EB溶液中,室温下染色20-25分钟。

7、观察：在波长为254nm的长波长紫外灯下观察染色后的电泳胶板。DNA存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。紫光灯下观察时应戴上防护眼镜或有机玻璃面罩,以免损伤眼睛。

[注意] EB是强诱变剂并有中等毒性,配制和使用时都应戴手套,并且不要把EB洒到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必须经专门处理后才能清洗或丢弃。

五、实验结果分析

质粒DNA电泳条带的形态。根据DNA marker分析质粒DNA溶液大致的浓度。

六、思考题

1、电泳时所加电压值如何确定?

答：可根据DNA大小来确定，越大的电压可低点，避免拖尾现象；越小的电压可适当大一点缩短电泳时间，避免时间过长DNA扩散导致条带模糊。

2、就你的理解，DNA marker的用途是什么?

答：分析DNA大小和浓度的依据。

3、电泳中用到两种buffer，各自的作用。

答：

上样缓冲液主要作用：

（1）螯合Mg 2＋，防止电泳过程中DNA被降解，一般上样缓冲液中含10mmol/l的EDTA。

（2）增加样品密度以保证DNA沉入加样孔内，一般上样缓冲液中加入一定浓度的甘油或蔗糖，这样可以增加样品的比重。而在大片段电泳中采用Ficoll（聚蔗糖），可减少DNA条带的弯曲和托尾现象。

（3）指示剂监测电泳的行进过程，一般加入泳动速率较快的溴酚蓝指示电泳的前沿，它的速率约与300bp的线状双链DNA相同。

电泳缓冲液的作用：

一是维持合适的pH；二是使溶液具有一定的导电性，以利于DNA 分子的迁移。此外，电泳缓冲液还有一个组分是EDTA，加入浓度为1-2mmol/L，目的是螯合Mg2+ 等离子，防止电泳时激活DNA酶，此外还可防止Mg2+离子与核酸生成沉淀。

4、如果质粒DNA电泳条带只有一条，说明提取的质粒质量高还是低，为什么？

答：质量高。这说明产生只有超螺旋的正常质粒闭合环双链DNA。

实验四、大肠杆菌感受态细胞的制备

1、 实验目的

掌握大肠杆菌感受态细胞的制备方法

2、 实验原理

1、 感受态细胞的概念

重组DNA分子体外构建完成后，必须导入特定的宿主（受体）细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。

在原核生物中，转化是一个较普遍的现象，在细胞间转化是否发生，一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系，另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态有着很大的关系。

所谓的感受态，即指受体（或者宿主）最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。cAMP可以使感受态水平提高一万倍，而Ca2+也可大大促进转化的作用。细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。

制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油或-70℃保存（有效期6个月）。

2、 转化的概念及原理

在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。

受体细胞经过一些特殊方法，如电击法、CaCl2等化学试剂法处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA 分子通过的感受态细胞。进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。

然后在选择性培养基中培养转化处理过的细菌，转化成功的细菌可以在加入抗生素的培养基上形成菌落。

三、 实验材料、设备及试剂

1、实验材料

前次实验中所复壮的大肠杆菌单菌落液体培养物

2、实验设备及器具

低速冷冻离心机、超净工作台、50 ml 离心管、10 ml刻度移液管、玻璃棒（三种器具均已经过灭菌处理）。

3、试剂及配置

0.1 M氯化钙溶液（配制：称取1.1g无水氯化钙，溶于90ml 双蒸水中，定容至100 ml, 转移至试剂瓶中，121 ℃灭菌20 min，保存。

四、 实验步骤

教师完成：

1.挑取实验一中平皿培养基上生长良好、外观呈圆形的单菌

落，接种于实验一配好的LB液体培养基（试管装）中，37℃ 200rpm振荡培养14 h 。

2.按1：50-1：100的比例进行接种，例取1.5 ml 上述培养物

转接在25 ml LB液体培养基中，37 ℃ 200rpm振荡培养2-3

约为0.4－0.5）。

h （菌液的OD

600

学生操作：

3.每小组（按实验一确定的4人组）领取一支离心管（已灭

菌，不要随便打开），贴上自己的标签（铅笔写学号），按老师安排两个小组同步在超净工作台上工作，每个小组用10 ml的移液管（已灭菌）吸取10 ml菌液放入自己的离心管

中，两个小组将离心管与盖子一起置天平上进行平衡，平衡后盖上盖子置于盛有冰块的盆中冰浴10分钟（时间可超过十分钟）。待满8管后送至离心机所在的实验室中，4000 rpm ，4 ℃,离心10 min 。

4.两小组同步在超净工作台上倾去上清液，用5 ml的移液管

（已灭菌）量取5 ml预冷的氯化钙溶液加入离心管中，用手

轻弹管壁将沉淀混匀,两小组间用氯化钙平衡，冰浴25

min（可延长） ,待有8管后4000rpm，4 ℃,离心10 min。5.在超净工作台上倾去上清液，用取液枪吸取1ml冰浴预冷的

氯化钙溶液加入离心管中，轻弹管壁使细菌悬浮，制成感受态的细胞悬浮液，用取液枪转移至预冷的1.5ml eppendolf 管中，按顺序摆放在离心管盒中，置－70 ℃ 保存。

注意：实验从第三步开始，整个实验过程都必须无菌操作！

五、思考题

1、用试剂瓶盛装的氯化钙在灭菌时应怎样操作？

答：可以高温高压灭菌，也可以过滤灭菌。高温高压灭菌注意盖子不要盖得太紧。

2、步骤3和4中，对离心机应当做什么样的预处理？

答：由于整个实验都应在低温下进行，因此需要对离心机进行4 ℃的预冷。

3、实验为什么必须全程在无菌条件下操作？

答：防止杂菌和杂DNA的污染。否则会影响转化效率或杂DNA的转入。

实验五质粒DNA的转化与转化体筛选

一、实验目的：

了解转化的概念及其在分子生物学研究中的意义，学习将外源质粒DNA 转入受体菌细胞并筛选转化体的方法。

二、实验原理

用CaCl2处理大肠杆菌细胞使其处于感受态后，通过热激处理可将质粒转化进入细菌中。进入细菌细胞的质粒能够自主复制并在宿主中实现其携带基因的转录、表达。本实验使用的pUC19质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Amp )，理论上只有转入了pUC19质粒的大肠杆菌才能在含Amp 的培养基上生长。但抗性筛选只是初步的筛选，可能仍有部分未转进质粒的细菌能在抗性培养基上生存（假阳性），因此尚需提取质粒酶切、电泳作进一步的鉴定。

三、试剂与仪器设备：

1．LB培养基

液体培养基：

蛋白胨(typtone) 1.0% （1 g/100 ml）

酵母提取物(Yeast extraction) 0.5% （0.5g/100 ml）

氯化钠 1.0% （1 g/100 ml）

PH 7.0　

固体培养基：100 ml液体培养基中加入1.5g琼脂粉

含氨苄青霉素（Amp）50mg/l的固体LB培养基 LB液体培养基中加1.5%琼脂粉，高压灭菌消毒，待泠却至不烫手时加入Amp铺培养皿。

2．0.1mol/L CaCl2 高压灭菌消毒或过滤除菌。

3．pUC19质粒 配制成约50ng/μl。

4．感受态DH5α大肠杆菌

5．恒温水浴箱

6．超净工作台

7．恒温摇床

8．生化培养箱

9．无菌离心管

10．无菌tips

11．玻璃涂布器

12．75%乙醇

13．标记笔

四、实验步骤

教师操作：

1、从-70℃冰箱中取出感受态细胞悬液，室温下使其解冻，解冻后立即置冰上

学生操作（四人一组）：

2、每组从冰上取2管感受态细胞悬液（每管200μl），其中一管加入50ng/μl的pUC19质粒DNA溶液1ul，贴上各自组的标签，另一个加入1 ul无菌水后，也贴上标签，两个离心管同时在冰上放置30分钟。

3、将两个离心管同时转入42℃水浴中热激90秒后，迅速置于冰上1-2分钟。在超净工作台上分别向两管中加入800 ul LB液体培养基(不含

Amp)，37℃恒温摇床缓慢振荡培养45分钟。

4、以5000rpm离心浓缩菌液，在超净工作台上分别取上述两个离心管中的菌液100μl ，各自涂布于一个含Amp的筛选平板上，用标记笔分别标记为转化组、对照组，待菌液干后，倒置于37℃恒温培养箱中培养16-24小时（第二天下午3：00后观察实验结果）。

转化实验本应设置两个对照：

对照组1 用来判断不加入质粒的大肠杆菌在抗性培养基上生长的状况，排除假阳性

对照组2 用来判断制备成感受态后的大肠杆菌在普通培养基上的生长状况　

五、计算转化率

转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数（CFU）可计算出转化子总数和转化频率，公式如下：转化子总数＝菌落数×涂板前离心管中菌液体积／涂板时所用菌液体积

转化频率＝转化子总数／质粒DNA加入量(mg)

转化效率＝转化子总数／感受态细胞总数　

六、思考题

1、“E. coli DH5α菌株：Rˉ，Mˉ，Ampˉ”提供了哪些关于该菌株的信息？

2、步骤3中，为何在大肠杆菌转化完成后需要在不含Amp的LB培养基中缓慢振荡培养45 min后方能涂布于抗性筛选培养基上进行抗性筛选？

3、设对照1、2分别有什么目的？在上述实验中，我们实际做了哪个对照？

为确定感受态细胞的转化效率，可将一定量的完整质粒转化到感受态细胞中，取一部分转化的细菌，涂布到选择培养基上，可用菌落生长单位/μg DNA，按下面的方法计算感受态细胞的转化效率.计算公式：转化效率＝产生菌落的总数/铺板DNA的总量。

例如，取1μl（0.1 ng/μl）完整的质粒转化100μl的感受态细胞.向转化反应液中加入900μl培养液，让细菌恢复一小段时间，取100μl 铺板.培养过夜，产生1000个菌落。转化0.1 ng DNA，用SOC稀释到1000μl后，取1/10涂平板，则涂平板共用0.01 ng DNA 质粒，所以转化率＝1000克隆/0.01 ng DNA =105 cfu/ng=108 cfu/μg。

转化效率1×10 6 cfu/μg DNA可满足普通的亚克隆实验；1×10 7 cfu/μg DNA用于作更复杂的亚克隆，有限量的DNA的转化，T-克隆实验；构建文库和突变要求用的转化的效率为>1×10 8 cfu/μg DNA。

实验六 质粒DNA的限制性酶切、PCR扩增与检测

　

一、实验目的

掌握PCR、限制性内切酶酶切的技术原理和操作要点，增进对理论知识的理解。

二、实验原理

1、限制性内切酶酶切限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。它可分为三类:Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP的存在。Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子,然后从底物上解离。Ⅱ类由两种酶组成: 一种为限制性内切核酸酶(限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列; 另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列。Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列，有少数酶识别更长的序列或简并序列。Ⅱ类酶切割位点在识别序列中,有的在对称轴处切割产生平末端的DNA片段，有的切割位点在对称轴一侧产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性未端。DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。大部分限制性内切酶不受RNA或单链DNA的影响。当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时,会影响其进一步使用,因此在吸取限制性内切酶时,每次都要用新的吸管头。如果采用两种限制性内切酶,必须要注意分别提供各自的最适盐浓度。若两者可用同一缓冲液,则可同时水解。若需要不同的盐浓度,则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用,随后调节盐浓度,再用高盐浓度的限制性内切酶水解。限制性内切酶的酶解反应最适条件各不相同,各种酶有其相应的酶切缓冲液和最适反应温度(大多数为37℃)。对质粒DNA酶切反应而言,限制性内切酶用量可按标准体系1μg DNA加1单位酶,消化1-2小时。

2、PCR PCR即聚合链式反应，它是近年发展起来的一种体外扩增特异性DNA 的技术。PCR技术实际上是在模板DNA、引物和４种脱氧核糖核苷酸(dNTP)存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA 结合的特异性。反应分3步：①变性：通过加热使DNA 双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA；②退

火：当温度突然降低时，由于模板分子结构较引物要复杂得多，而且反应体系中引物DNA量大大多于模板DNA，使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而模板DNA双链之间互补的机会较少。③延伸：在DNA聚合酶和4 种dNTP底物及Mg2+存在的条件下，5'→3'的聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应，以上3步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，数小时之后，介于两个引物之间的特异性DNA片段得到了大量复制，数量可达2×106～7拷贝。

3、琼脂糖凝胶电泳参见实验三。

三、实验材料、设备及试剂

1. 上下游引物: 浓度为各10 pmol/μl。

5' AATCTAGACATATGAGCAGCTCAGAGGAGGT 3',

5' AAGGATCCAAGCTTCAGCGAATCGTCTTGACTGG 3'，2．DNA模板：大豆基因组，浓度为100ng/μl。

4．10×buffer（购买Taq酶配套buffer）：500mmol/L KCl，100mmol/L Tris-Cl，pH9.0，1% Triton-X 100

5．MgCl2：25mmol/L。

6．dNTP 2.5mmol/L：分别取等体积的10mol/L的dATP，dGTP，dTTP，dCTP四种混合即成

7．Taq DNA聚合酶：浓度为2.5 U/μl。

8．灭菌双蒸水

9. 10X buffer（购买限制性内切酶配套buffer）

10. SalI限制性内切酶：10U/ul

11. 质粒DNA：200ng/5ul

12. 6×载样buffer：0.25% 二甲苯青FF，0.25% 溴酚蓝，30% 甘油

13．50×TAE 电泳Buffer：12.2g Tris，2.85ml 冰醋酸，10ml 0.25 mol/L EDTA(pH8.0)，加水至50ml。

14．溴化乙锭(EB)溶液：10mg/ml(避光保存)，每100ml琼脂糖凝胶加5μl贮存液，即凝胶中EB终浓度为0.5μg/ml，此试剂为强致癌物，要戴手套操作，避免污染环境。

15. DNA Marker

16．各种国产移液器(10，20，100μl)

17．消毒的0.2ml、１.５ml PCR管，10μl，100μl tips

18．恒温水浴锅

19．PCR仪

20．水平电泳槽和电泳仪

四、实验步骤

（一）PCR：

各种试剂置冰盒中，取已灭菌的0.2ml PCR管，于冰上按下表操作（注：根据质粒浓度来决定质粒模板的加入量）：反应体系配制（10μl 体系）

试剂加入量终浓度(或含量)

10×buffer2μl1×buffer

dNTP1μl 2.5mmol

MgCl20.5μl约2.5mM/L

上下游引物1μl（各10 pmol/μl）各10pmol

Taq DNA聚合酶0.5μl (2.5 U/μl) 1.25U

无菌ddH2O补足20μl

总体积10μl

用枪混匀反应液，稍离心，盖紧盖子，编号。于PCR仪上进行PCR 反应。

反应程序设置为：94℃预变性 5min

以下35次循环

94℃变性 55S

55℃退火 45s

72℃延伸 55s

最后 72℃ 7min

（二）限制性内切酶酶切：

试剂加入量终浓度(或含量)

质粒DNA xμl500ng~1ug

10×buffer1μl1×buffer

Sal I0.1μl(10 U/μl)1U

无菌ddH2O补足10μl

总体积10μl

注：加入质粒DNA溶液的体积根据实验五电泳结果决定，取的体积保证加入的质粒为500 ng~1ug即可。

加盖，混匀后稍离心，37℃水浴反应3h。反应完毕，于80℃水浴20min使酶失活。

（三）琼脂糖凝胶电泳

步骤略，请自行设计实验步骤。

五.实验结果分析

由琼脂糖凝胶电泳结果分析PCR结果如何？限制性内切酶酶切结果如何？预期应是怎样的电泳结果？如果电泳结果与预期不符，请分析原因。

实验七 细菌染色体DNA的提取

一、实验目的

了解细菌染色体DNA的制备方法与原理，掌握其操作步骤。

二、实验原理

从细菌中分离染色体DNA包括几个基本步骤：收集细胞；由溶菌酶水解肽聚糖的糖苷键从而破坏细菌细胞壁；蛋白酶K降解蛋白质成为小分子肽段；酚、氯仿变性、抽提溶液中的蛋白质；无水乙醇或异丙醇沉淀DNA就能得到质量稳定的染色体DNA。

三、实验材料

普通细菌

四、实验设备

微量取液器(100μl,1000μl)，台式高速离心机，制冰机

五、试剂

溶液Ⅰ：50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris.Cl (pH8.0)， 10mmol/L EDTA (pH8.0)。溶液Ⅰ可成批配制,每瓶100ml,高压灭菌15分钟,储存于4℃冰箱。

3 mol/L NaAc（pH5.2）、Tris饱和酚/氯仿（11）、TE缓冲液、RNase

六、实验步骤

1. 取菌液1mL，12000rpm离心1min，弃上清。

2. 加入100 μL溶液I，在漩涡混合器上振荡混匀至沉淀彻底分

散。

3. 再加入650 μL 溶液I，振荡混匀。

4. 向悬液中加入7.5 μL的100mg/mL溶菌酶至终浓度为1mg/mL，

混匀，37℃温浴30分钟。

5. 向悬液中加入7.5 μL蛋白酶K（10mg/mL），混匀，55℃继续

温浴1-1.5 h，中间轻缓颠倒离心管数次。

6. 温浴结束后向溶液中加入用等体积的酚/氯仿/异戊醇溶液

(750 μL)抽提，12000rpm离心5min；取上清再用等体积的氯

仿/异戊醇溶液抽提一次，12000rpm离心5min。

7. 取上清（约500 μL ）至新的离心管中，向上清中加入1/10体