保护碱基列表格模板

合集下载

保护碱基列表

〉90 〉90
50 50
0 25 50
〉90 〉90 >90
0 〉90 >90 〉90
0 25
CCGCTCGAGCGG
10
75
Xma I
CCCCGGGG CCCCCGGGGG CCCCCCGGGGGG TCCCCCCGGGGGGA
0 25 50 〉90
0 75 〉90 〉90
注释: 1．如果要加在序列的 5‘端，就在酶切位点识别碱基序列（红色)的 5’端加上
0 0 75
0 〉90 〉90
0 50
0 75
0 0 0 0 〉90 〉90
0 25 50
0 10 10 90 〉90
>90 〉90
0 25 〉90
0 25 50 〉90
Pst I
Pvu I Sac I Sac II Sal I
Sca I Sma I
Spe I
Sph I Stu I Xba I
Xho I
CCTCGAGG CCCTCGAGGG
0 10 〉90 〉90 0
0 10 0
10
0 50
0 10 10
10 75
0 0 10 〉90
10 10 0 0
0 0 10
〉90 〉90 〉90
0 〉90
75 75
0 10
0 10 〉90 〉90 0
0 25 10
10
0 〉90
0 50 75
25 75
10 10 50 〉90
酶 Acc I Afl III Asc I Ava I BamH I Bgl II BssH II BstE II BstX I Cla I
EcoR I

PCR设计引物时酶切位点的保护碱基

PCR设计引物时酶切位点的保护
注释：
1．如果要加在序列的5‘端，就在酶切位点识别碱基序列（红色）的5’端加上相应的碱基（黑色），相同如果要在3‘端加保护碱基，就在酶切位点识别碱基序列（红色）的3’端加上相应的碱基（黑色）。

2．切割率：正确识别并酶切的效率
3.加保护碱基时最好选用切割率高时加的相应碱基。

一般情况下，普通的内切酶只加入两个保护碱基，其内切反应就可以正常进行；而有一类，仅仅只加入两个保护碱基，其内切反应就不能正常进行，这是因为内切酶不能正常结合DNA段上。

如NdeI就属这类，需要加入至少6个保护碱基，常用的HindIII也要三个。

添加什么保护碱基，如果严格点，是根据两条引物的Tm值和各引物的碱基分布及GC含量。

如果某条引物Tm值偏小，GC%较低，添加时多加G或C，反之亦反。

当在引物5’端添加酶切位点时要考虑：
a)该目的序列内部不得含有相同的酶切位点，这样的错误会给将来的克隆造成麻烦。

b)如果打算PCR 后直接酶切，不要忘了在酶切位点的外侧再加上保护碱基，不同的酶对于保护碱基的要求是不同的。

如果不设计保护碱基，则多半要用TA 克隆的方式连接到质粒上，这时要注意Taq 酶的选择，若想在目的序列上附加上并不存在的序列，如限制位点和启动子序列，可以加入到引物5'端而不影响特异性。

当计算引物Tm 值时并不包括这些序列，但是应该对其进行互补性和内部二级结构的检测。

引物设计保护碱基列表

引物设计保护碱基列表
编辑整理：
尊敬的读者朋友们：
这里是精品文档编辑中心，本文档内容是由我和我的同事精心编辑整理后发布的，发布之前我们对文中内容进行仔细校对，但是难免会有疏漏的地方，但是任然希望（引物设计保护碱基列表）的内容能够给您的工作和学习带来便利。

同时也真诚的希望收到您的建议和反馈，这将是我们进步的源泉，前进的动力。

本文可编辑可修改，如果觉得对您有帮助请收藏以便随时查阅，最后祝您生活愉快业绩进步，以下为引物设计保护碱基列表的全部内容。

在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点,用于后续的酶切和连接反应.由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被限制性核酸内切酶切开,因此在设计PCR引物时，人为的在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性.
添加保护碱基,需要考虑两个因素：一是碱基数目，一是碱基种类。

添加保护碱基时，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。

什么样的酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的，见附表。

添加什么保护碱基，如果严格点,是根据两条引物的Tm值和各引物的碱基分布及GC含量。

如果某条引物Tm值偏小，GC%较低，添加时多加G或C，反之亦反。

保护碱基列表。

部分限制酶酶切位点、保护性碱基及酶切效率表doc

New England Biolabs Technical Literature - Updated 03/13/2004 部分限制酶酶切位点、保护性碱基及酶切效率表Cleavage Close to the End of DNA Fragments (oligonucleotides)NOTE: To test the varying requirements restriction endonucleases have for the number of bases flanking their recognition sequences, a series of short, double-stranded oligonucleotides that contain the restriction endonuclease recognition sites (shown in red) were digested. This information may be helpful when choosing the order of addition of two restriction endonucleases for a double digest (a particular concern when cleaving sites close together in a polylinker), or when selecting enzymes most likely to cleave at the end of a DNA fragment. The experiment was performed as follows: 0.1 A260 unit of oligonucleotide was phosphorylated using T4 polynucleotide kinase and g-[32P] ATP. 1 μg of 5′ [32P]-labeled oligonucleotide was incubated at 20°C with 20units of restriction endonuclease in a buffer containing 70 mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl2, 5 mM DTT and NaCl or KCl depending on the salt requirement of each particular restriction endonuclease. Aliquots were taken at 2 hours and 20 hours and analyzed by 20% PAGE (7 M urea). Percent cleavage was determined by visual estimate of autoradiographs. As a control, self-ligated oligonucleotides were cleaved efficiently. Decreased cleavage efficiency for some of the longer palindromic oligonucleotides may be caused by the formation of hairpin loops.。

常用酶切位点表(含保护碱基)课件.doc

切割率%酶寡核苷酸序列2 hr 20 hrAcc I G GTCGAC C 0 0CG GTCGAC CG 0 0CCG GTCGAC CGG 0 0Afl III C ACATGT G 0 0CC ACATGT GG >90 >90CCC ACATGT GGG >90 >90Asc I GGCGCGCC >90 >90A GGCGCGCC T >90 >90TT GGCGCGCC AA >90 >90Ava I C CCCGGG G 50 >90CC CCCGGG GG >90 >90TCC CCCGGG GGA >90 >90BamH I C GGATCC G 10 25CG GGATCC CG >90 >90CGC GGATCC GCG >90 >90Bgl II C AGATCT G 0 0GA AGATCT TC 75 >90GGA AGATCT TCC 25 >90BssH II G GCGCGC C 0 0AG GCGCGC CT 0 0TTG GCGCGC CAA 50 >90BstE II G GGT(A/T)ACC C 0 10BstX I AACTGCAGAA CCAATGCATTGG 0 0 AAAACTGCAG CCAATGCATTGG AA 25 50CTGCAGAA CCAATGCATTGG ATGCAT 25 >90Cla I C ATCGAT G 0 0GATCGAT C 0 0CC ATCGAT GG >90 >90CCC ATCGAT GGG 50 50EcoR I G GAATTC C >90 >90>90 >90CG GAATTC CGCCG GAATTC CGG >90 >90Hae III GG GGCC CC >90 >90AGC GGCC GCT >90 >90TTGC GGCC GCAA >90 >90Hind III C AAGCTT G 0 0CC AAGCTT GG 0 0CCC AAGCTT GGG 10 75Kpn I G GGTACC C 0 0GG GGTACC CC >90 >90CGG GGTACC CCG >90 >90Mlu I G ACGCGT C 0 0CG ACGCGT CG 25 50Nco I C CCATGG G 0 0CATG CCATGG CATG 50 75Nde I C CATATG G 0 0CC CATATG GG 0 0CGC CATATG GCG 0 0GGGTTT CATATG AAACCC 0 0GGAATTC CATATG GAATTCC 75 >90GGGAATTC CATATG GAATTCCC 75 >90Nhe I G GCTAGC C 0 0CG GCTAGC CG 10 25CTA GCTAGC TAG 10 50切割率%酶寡核苷酸序列2 hr 20 hrNot I TT GCGGCCGC AA 0 0ATTT GCGGCCGC TTTA 10 10AAATAT GCGGCCGC TATAAA 10 10 ATAAGAAT GCGGCCGC TAAACTAT 25 90 AAGGAAAAAA GCGGCCGC AAAAGGAAAA 25 >90Nsi I TGC ATGCAT GCA 10 >90 CCA ATGCAT TGGTTCTGCAGTT >90 >90Pac I TTAATTAA 0 0G TTAATTAA C 0 25CC TTAATTAA GG 0 >90Pme I GTTTAAAC 0 0G GTTTAAAC C 0 25GG GTTTAAAC CC 0 50AGCTTT GTTTAAAC GGCGCGCCGG 75 >90Pst I G CTGCAG C 0 0TGCA CTGCAG TGCA 10 10 AA CTGCAG AACCAATGCATTGG >90 >90AAAA CTGCAG CCAATGCATTGGAA >90 >90CTGCAG AACCAATGCATTGGATGCAT 0 0Pvu I C CGATCG G 0 0AT CGATCG AT 10 25TCG CGATCG CGA 0 10 Sac I C GAGCTC G 10 10Sac II GCCGCGG C 0 0TCC CCGCGG GGA 50 >90Sal I GTCGAC GTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC 0 0 GC GTCGAC GTCTTGGCCATAGCGGCCGCG 10 50G 10 75ACGC GTCGAC GTCGGCCATAGCGGCCGCGGAASca I GAGTACT C 10 25AAA AGTACT TTT 75 75Sma I CCCGGG 0 10CCCCGGG G 0 10CC CCCGGG GG 10 50TCC CCCGGG GGA >90 >90Spe I GACTAGT C 10 >90GG ACTAGT CC 10 >90CGG ACTAGT CCG 0 50CTAG ACTAGT CTAG 0 50Sph I G GCATGC C 0 0CAT GCATGC ATG 0 25ACAT GCATGC ATGT 10 50Stu I AAGGCCT T >90 >90GA AGGCCT TC >90 >90AAA AGGCCT TTT >90 >90Xba I CTCTAGA G 0 0GC TCTAGA GC >90 >90TGC TCTAGA GCA 75 >90CTAG TCTAGA CTAG 75 >90Xho I C CTCGAG G 0 0CC CTCGAG GG 10 25CCG CTCGAG CGG 10 75Xma I CCCCGGG G 0 0CC CCCGGG GG 25 75CCC CCCGGG GGG 50 >90TCCC CCCGGG GGGA >90 >90。

NEB公司提供的保护碱基序列表

Eco130I (StyI)
0
Eco147I (StuI)
0
Eco24I (BanII)
50-100
Eco31I (BsaI)
20-50
Eco32I (EcoRV)
20-50
Eco47I (AvaII)
50-100
Eco47III (AfeI) 0
Eco52I (EagI)
0-20
Eco57I (AcuI)
8 10 12
8 10 12 14
8
% Cleavage
2 hr 20 hr
10
>90
10
>90
0
50
0
50
0
0
0
25
10
50
>90 >90 >90
>90 >90 >90
0
0
>90
>90
75
>90
75
>90
0
0
CCCTCGAGGG CCGCTCGAGCGG
10
10
25
12
10
75
XmaI
CCCCGGGG CCCCCGGGGG CCCCCCGGGGGG TCCCCCCGGGGGGA
20-50
Esp3I (BsmBI)
50-100
FaqI (BsmFI)
0-20
20-50 0-20 50-100
50-100 50-100
0-20 50-100 50-100 50-100 50-100
50-100 0-20 50-100
50-100
50-100

酶切位点保护碱基

0
0
0
25
0
50
75
>90
Pst I
GCTGCAGC
0
0
TGCACTGCAGTGCA
10
10
AACTGCAGAACCAATGCATTGG
>90
>90
AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA
>90
>90
CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT
0
0
Pvu I
CCGATCGG ATCGATCGAT TCGCGATCGCGA
切割率%
2 hr
0 0 0
0 >90 >90
>90 >90 >90
50 >90 >90
10 >90 >90
0 75 25
0 0 50
0
0 25 25
0 0 >90 50
>90 >90 >90
20 hr
0 0 0
0 >90 >90
>90 >90 >90
>90 >90 >90
25 >90 >90
0 >90 >90
0
0
10
25
0
10
Sac I
CGAGCTCG
10
10
Sac II
GCCGCGGC TCCCCGCGGGGA
0
0
50
>90
Sal I
GTCGACGTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC
0
0
GCGTCGACGTCTTGGCCATAGCGGCCGCGG

酶切位点表——精选推荐

PCR 设计引物时酶切位点的保护碱基表 2
酶
寡核苷酸序列
BamH I
CGGATCCG CGGGATCCCG CGCGGATCCGCG
Bgl II
CAGATCTG GAAGATCTTC GGAAGATCTTCC
BssH II
GGCGCGCC AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA
BstE II
25
0
10
10
10
0
0
50
>90
0
0
10
50
10
75
10
25
75
75
0
10
0
10
10
50
>90
>90
Spe I
GACTAGTC GGACTAGTCC CGGACTAGTCCG CTAGACTAGTCTAG
酶切位点保护碱基表 7
10
>90
10
>90
0
50
0
50
切割率%
酶
寡核苷酸序列
2 hr 20 hr
GAGTACTC AAAAGTACTTTT
CCCGGG CCCCGGGG CCCCCGGGGG TCCCCCGGGGGA
0
0
10
10
10
10
25
90
25
>90
10
>90
>90
>90
0
0
0
25
0
>90
0
0
0
25
0
50
75
>90
0
0

保护碱基列表

010>90>900
010>90>900
Pvu I
GCGATCGCATCGATCGATCGACGATCGTCG
0100
02510
Sac I
GGAGCTCC
10
10
Sac II
CCCGCGGGGGACCGCGGTCC
050
0>90
Sal I
GTCAAAAGGCCATAGCGGCCGCGTCGACGTCTTGGCCATAGCGGCCGCGGGTCGACGCGTCGGCCATAGCGGCCGCGACGCGTCGACGAA
.
PCR设计引物时酶切位点的保护
酶
寡核苷酸序列
%切割率
2 hr
20 hr
Acc I
CGGTCGACCGCGGTCGACCGGCCGGTCGAC
000
000
Afl III
GCACATGTGGACATGTCCGGGACATGTCCC
0>90>90
0>90>90
Asc I
GGCGCGCCTGGCGCGCCAAAGGCGCGCCTT
0>907575
0>90>90>90
Xho I
GCCTCGAGGGCCCTCGAG
010
025
3 / 4
.
7510CTCGAGCGGCCG
Xma I
GCCCCGGGGGCCCCCGGGGGGCCCCCCGGGGGGATCCCCCCGGG
02550>90
075>90>90
注释：'端加55‘端，就在酶切位点识别碱基序列（红色）的1．如果要加在序列的‘端加保护碱基，就在酶切位点识上相应的碱基（黑色），相同如果要在3 '端加上相应的碱基（黑色）。别碱基序列（红色）的3 2．切割率：正确识别并酶切的效率3。加保护碱基时最好选用切割率高时加的相应碱基。4 / 4

引物设计保护碱基列表

在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。

由于直接暴專在末端的酶切位点不容易直接被限制性核酸内切酶切开，因此在设计PCR引物时，人为的在酶切位点序列的5 “端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。

添加保护碱基，需要考虑两个因素：一是碱基数目，一是碱基种类。

添加保护碱基时，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。

什么样的酶切位点，添加几个保护緘基，是有数据可以参考的，见附表。

添加什么保护碱基，如果严格点，是根据两条引物的Tm值和各引物的緘基分布及GC含量。

如果某条引物Tm值偏小，GC%较低，添加时多加G或C,反之亦反。

1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。

PCR设计引物时酶切位点的保护
酶寡核苷酸序列
切割率%
2hr 20hr
AccI GGTCGACC CGGTCGACCG CCGGTCGACCGG 0 0 0 0 0 0
AflIII CACATGTG CCACATGTGG CCCACATGTGGG 0 >90 >90 0 >90 >90
AscI GGCGCGCC AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA >90 >90 >90 >90 >90
>9

AvaI CCCCGGGG CCCCCGGGGG TCCCCCGGGGGA 50 >90 >90 >90 >90
>9

BamHI CGGATCCG CGGGATCCCG CGCGGATCCGCG 10 >90 >90 25 >90 >90

BglII CAGATCTG GAAGATCTTC GGAAGATCTTCC 0 75 25 0 >90 >90
BssHII GGCGCGCC AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA 0 0 50 0 0 >90
BstEII
GGGT(A/T)ACCC 0 10
BstXI AACTGCAGAACCAATGCATTGG AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT 0 25 25 0 50 >90

ClaI CATCGATG GATCGATC CCATCGATGG CCCATCGATGGG 0 0 >90 50 0 0 >90 50
EcoRI GGAATTCC CGGAATTCCG CCGGAATTCCGG >90 >90 >90 >90 >90
>9

0
HaeIII GGGGCCCC AGCGGCCGCT TTGCGGCCGCAA >90 >90 >90 >90 >90
>9

HindIII CAAGCTTG CCAAGCTTGG CCCAAGCTTGGG 0 0 10 0 0 75

KpnI GGGTACCC GGGGTACCCC CGGGGTACCCCG 0 >90 >90 0 >90 >90
MluI GACGCGTC CGACGCGTCG 0 25 0 50
NcoI CCCATGGG CATGCCATGGCATG 0 50 0 75
NdeI CCATATGG CCCATATGGG CGCCATATGGCG GGGTTTCATATGAAACCC GGAATTCCATATGGAATTCC GGGAATTCCATATGGAATTCCC 0 0 0 0 75 75 0 0 0 0
>90

>90

NheI GGCTAGCC CGGCTAGCCG CTAGCTAGCTAG 0 10 10 0 25
50

NotI TTGCGGCCGCAA ATTTGCGGCCGCTTTA AAATATGCGGCCGCTATAAA ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTAT AAGGAAAAAAGCGGCCGCAAAAGGAAAA 0 10 10 25 25 0 10 10 90
>90

NsiI TGCATGCATGCA CCAATGCATTGGTTCTGCAGTT 10 >90 >90 >90
PacI TTAATTAA GTTAATTAAC CCTTAATTAAGG 0 0 0 0 25 >90
PmeI GTTTAAAC GGTTTAAACC GGGTTTAAACCC AGCTTTGTTTAAACGGCGCGCCGG 0 0 0 75 0 25 50
>9

PstI GCTGCAGC TGCACTGCAGTGCA AACTGCAGAACCAATGCATTGG AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT 0 10 >90 >90 0 0 10 >90
>

90 0

PvuI CCGATCGG ATCGATCGAT TCGCGATCGCGA 0 10 0 0 25 10
SacI
CGAGCTCG 10 10
SacII GCCGCGGC TCCCCGCGGGGA 0 50 0 >90
SalI GTCGACGTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC GCGTCGACGTCTTGGCCATAGCGGCCGCGG ACGCGTCGACGTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA 0 10 10 0 50 75

ScaI GAGTACTC AAAAGTACTTTT 10 75 25 75
SmaI CCCGGG CCCCGGGG CCCCCGGGGG TCCCCCGGGGGA 0 0 10 >90 10 10 50
>

SpeI GACTAGTC GGACTAGTCC CGGACTAGTCCG CTAGACTAGTCTAG 10 10 0 0 >90 >90
50

50
SphI GGCATGCC CATGCATGCATG ACATGCATGCATGT 0 0 10 0 25 50

StuI AAGGCCTT GAAGGCCTTC AAAAGGCCTTTT >90 >90 >90 >90 >90
>9

XbaI CTCTAGAG GCTCTAGAGC TGCTCTAGAGCA CTAGTCTAGACTAG 0 >90 75 75 0 >90 >90
>90

XhoI CCTCGAGG CCCTCGAGGG CCGCTCGAGCGG 0 10 10 0 25 75

XmaI CCCCGGGG CCCCCGGGGG CCCCCCGGGGGG TCCCCCCGGGGGGA 0 25 50 >90 0 75 >90
>

注释：
1．如果要加在序列的5‘端，就在酶切位点识别碱基序列（红色）的5’端加上相
应的碱基（黑色），相同如果要在3‘端加保护碱基，就在酶切位点识别碱基序
列（红色）的3’端加上相应的碱基（黑色）。
2．切割率：正确识别并酶切的效率
3。加保护碱基时最好选用切割率高时加的相应碱基。