青霉素G酰化酶反应机理的说明
青霉素类抗生素耐药性的分子机制
青霉素类抗生素耐药性的分子机制近年来，随着抗生素使用的不断普及和延长，很多病原微生物对抗生素的抵抗力也在不断加强。
青霉素是一种广谱抗生素，因为其具有治疗多种疾病的特殊效果而备受欢迎。
然而，青霉素耐药现象越来越普遍，这对治疗妨碍极大。
为深入理解青霉素类抗生素的耐药性，本文将从分子机制方面进行解析。
一、青霉素类抗生素的来源与结构青霉素是由放线菌属（Streptomyces）特别是鹅肝菌（Penicillium）和乳酸杆菌属（Lactobacillus）产生的一类多环“内酰胺”抗生素。
青霉素类抗生素的结构特点是配合离子，可以通过酰化反应与核糖体处的靶标分子结合，发挥抗菌作用。
它是一种保守的β内酰胺环，由于该结构存在于大多数青霉素中，因此也被称为β内酰胺类抗生素。
二、青霉素类抗生素耐药性的来源目前，青霉素类抗生素的耐药性主要表现在菌体对抗菌素的吸收、水解或外排上。
其主要来源是自然选择和人为干预因素，也包括多种革兰氏阳性和阴性菌的基因传递和微生物群落共生的影响。
当它被使用时，会杀死敌对菌株，但是总会残留一些抗药菌株。
这些菌株在继续繁殖时，简单地改变自身的分子结构，提高了它们对青霉素类抗生素的抵抗力。
此外，人类的过量使用抗生素也是导致抗生素耐药性快速蔓延的关键。
抗生素药物在进入人体后，往往过度繁殖，不仅仅会杀死对抗药剂具有抵抗力的菌体，也会杀死那些无害的菌体。
这会导致身体内菌群失去平衡，从而使相对有减弱的菌株成为主流。
最终，当人们需要使用抗生素时，由于这些菌株已经进化到了与青霉素类抗生素抵抗的程度，所以青霉素类抗生素的使用要比预期效果差。
三、青霉素类抗生素耐药性的分子机制青霉素的抗菌机理是与细菌细胞壁的合成过程有关。
其目标分子主要有两个，一是“青霉素结合蛋白”（PBP），另一个是“转肽酶”（transpeptidase）。
当一个细菌处于青霉素的作用下时，它的细胞壁合成相应激活的青霉素结合蛋白会结合到青霉素，从而抑制细菌细胞壁的合成。
青霉素酰化酶 生化10136号
例子：王祯祥等采用理化因子反复诱变的方法,
对巨大芽孢杆菌Bacillus megate2rium 进行处理,得 到了孢外青霉素酰化酶的高产菌株,酶活力大大提高。 黄艳红等将来自于巨大芽孢杆菌的青霉素G 酰化酶 基因克隆到大肠杆菌———枯草芽孢杆菌穿梭质粒 pMA5 中,然后转化到枯草杆菌BCL1050 中,在Hpa 启动作用下进行表达。表达产物通过苯丙氨酸Sep harose 4B柱、Sep hacrylS 100 和DEAE Sep hadexA 50 柱纯化,得到了纯度达90 %以上的青霉素 酰化酶。研究者还采用了随机诱变、基因克隆等方 法处理青霉素酰化酶的产酶菌株,从而提高产酶能力, 并改善酶的特性。
青霉素酰化酶具有广泛的市场应用前景, 青霉素酰化酶已有效地应用于半合成β 内酰 胺抗生素的生产、肽的合成和外消旋混合 物的拆分中。随着酶技术的不断发展,青霉 素酰化酶在固定化技术、非水相介质酶催 化技术及定点突变技术等方面取得了一定 的发展,而且研究者不断采用基因工程方法 筛选产青霉素酰化酶的高产优质菌株。青 霉素酰化酶在基因工程和酶工程方面的不 断发展,将使其在医药、食品、中间体合成 等领域的应用逐步扩大。
青霉素酰化酶:
又称为青霉素酰胺酶或青霉素氨基水解酶。 主要从大肠埃希菌胞内酶和巨大芽孢杆菌胞外酶 获得，该酶已大规模应用于工业生产β- 内酰胺类 抗生素的关键中间体和半合成β- 内酰胺类抗生素。 根据底物特异性的不同,青霉素酰化酶可分为3 种 类型:第一类由细菌产生,适合于水解青霉素G,大多 为体内酶;第二类由放线菌、真菌产生,适合于水解 青霉素V ,几乎均为体外酶;第三类由假单孢菌产生, 适合于水解氨苄青霉素。
在半合成β 内酰胺抗生素合成中的应用
青霉素酰化酶催化水解反应得到中间体 6APA 和7 ACA 后,下一步可以生产半合成青霉 素和头孢菌素。具体的是利用青霉素酰化酶催化 酰基侧链和β 内酰胺核的缩合反应。酶法合成β 内酰胺类抗生素可以通过动力学或热力学控制完 成。动力学控制的合成反应的产量取决于酶催化 的3 种不同反应的速率: (1)β 内酰胺类化合物的合成反应; (2) 活化的酰基供体的水解反应;
渗透休克法提取重组青霉素G酰化酶及酶学性质研究
第26卷 第5期2010年9月福建师范大学学报(自然科学版)Jo ur nal of F ujian N or mal U niver sity (Nat ur al Science Edition)V ol.26 N o.5Sept.2010文章编号:1000-5277(2010)05-0072-05渗透休克法提取重组青霉素G 酰化酶及酶学性质研究蒋咏梅1,2,章文贤1,魏东芝2(1.福建师范大学生命科学学院,福建福州 350108;2.鲁华生物技术研究所,华东理工大学,上海 200237) 摘要:为简化后期提取工艺,采用渗透休克法提取基因工程菌重组青霉素G 酰化酶,回收率92.4%的酶蛋白释放到胞外,纯度达80%,比酶活26.4U /mg .酶学性质研究表明,K cP GA 的最适作用pH 和温度分别为pH 7～9和50℃,在pH 5.0～8.0和低于40℃的范围较稳定.关键词:青霉素G 酰化酶;渗透休克;酶学性质中图分类号:Q 814.1 文献标识码:A 收稿日期:2009-09-30 基金项目:上海市重点学科建设项目(B505) 通讯作者:蒋咏梅(1971— ),副教授,博士,主要从事发酵工程研究.ymjiangbio @fjnu .edu .cn Properties of Recombinant Penicillin G Acylase Extractedfrom Escherichia coli by Osmotic ShockJIANG Yong -mei 1,2,ZHANG Wen -xian 1,WEI Dong -zhi2(1.College of L if e Sciences ,Fu j ian N or mal U niver sity ,Fuz hou 350108,China ;2.I nstitute of N ew w or ld Biotechnology ,E ast China U niver sityof Science and T echnology ,Shanghai 200237,China )Abstract :T o simplify the purification pro cess ,an ex tr act method of osm otic -shock w asused to seperate penicillin G acylase from E .coli .92.4%of PGA was released to the bufferso lution,the purity and specific enzyme activity r eached 80%and 26.4U /mg ,respectiv ely.The optimum reaction temper ature and pH of KcPGA were 50℃and pH 7～9,and it w asstable at 40℃and pH 5.0～8.0.Key words :penicillin G acy lase;o smo tic sho ck;char acter of enzym e青霉素G 酰化酶(penicillin G acylase,PGA , E.C.3.5.1.11),也叫青霉素G 酰胺水解酶(penicillin amido hy drolase )或青霉素G 酰胺酶(penicillin am idase ),自1950年在产黄青霉(P enicilnumchy sogenum )Q 176中发现以来[1],就以良好的催化酰化/去酰化特性受到了广泛关注.除了在抗生素工业的应用外,PGA 还因其具有良好的底物专一性和对映体的选择性,用于光学异构体的合成和拆分[2].鉴于青霉素G 酰化酶的广泛用途,有关该酶的提取与纯化也受到了人们的关注.目前应用较多的是大肠杆菌产生的胞内青霉素G 酰化酶,常规采用机械破碎结合多次层析的分离方法,不仅费时费力,得到的PGA 纯度也较低.金属离子亲和层析虽可提高酶的分离效率,回收率却不太理想[3].近年来,采用离子交换和双水相分离法得到了较好的纯化效果,但步骤相对繁琐[4-5].采用渗透休克法选择性地分离目标蛋白,对简化后期纯化工艺十分有利.自1965年首次报道[6]以来,人们尝试采用该方法释放各种胞内酶[7],但由于得到的酶蛋白纯度不高,因此,缺少系统的研究[8].由于大肠杆菌产生的青霉素G 酰化酶定位于仅含总蛋白5%～15%蛋白质的周质空间内,采用渗透休克法提取PGA,无需特殊设备和昂贵药品,有较大的优势.在实际应用中,对青霉素酰化酶的纯度要求往往不高.因此,本文尝试采用渗透休克的方法对大肠杆菌产生的重组青霉素G 酰化酶进行一步纯化,优化了其操作条件,并对PGA 的酶学性质进行了研究.1 材料与方法1.1 实验材料1.1.1 菌种大肠杆菌BL21(DE3)[pET 24(+)],携带p ga (K .citrop hila )基因.1.1.2 主要试剂对二甲基胺基苯甲醛(p -dintethylam ino benzaldehy de ),简称PDAB 溶液,500mL PDAB 溶于100mL 无水甲醇;青霉素G (penicillin G),华北制药厂出品;其余均为市售分析纯试剂.1.1.3 培养基保藏培养基:LB 培养基,含50m g/L 卡那霉素.发酵培养基:酵母粉30.0g /L ,甘油5.0g /L ,NaCl 5.0g /L ,卡那霉素50mg ,微量元素适量.调至pH 7.0.1.2 实验方法1.2.1 培养条件250mL 三角瓶装发酵培养基30mL ,接种量3%,30℃,200r /min ,旋转摇床培养,16h 后加0.5mm ol/L IPTG 诱导,继续培养6h 后收集菌体.1.2.2 超声波破碎细胞离心收集菌体,10mmo l /L T ris -HCl (pH =7.5)缓冲液洗涤离心,菌体重悬,超声破碎10m in (工作2s 间歇3s),保持菌液始终处于低温(0～4℃).破碎后在8000r /min 下冷冻离心10m in,所得上清液即为粗酶液.1.2.3 渗透休克发酵液离心去上清液,菌体洗涤后重悬于同体积高渗液中,室温放置一定时间,4℃离心10min ,取离心后的菌体迅速悬浮于预冷的同体积的50mm ol/L PBS (pH 7.5)中,冰浴15m in.溶液经10000r/m in,10min 离心后,分别取上清液和菌体(超声后使用)进行SDS-PAGE 检测和PGA 酶活测定.1.2.4 酶的最适作用pH 及pH 稳定性分别配制pH 值为4～11的50mmo l /L 缓冲液,包括醋酸盐(pH 4,5),磷酸盐(pH 6,7,8),硼酸盐(pH 9,10,11)缓冲液.青霉素G 钾盐用不同pH 的缓冲液配制成质量分数4%的溶液,在37℃进行酶促反应.用上述缓冲液稀释酶液,在37℃保温24h 后于标准条件检测酶活.1.2.5 酶的最适作用温度及稳定性在相同的pH 缓冲液条件下(pH 7.5),分别在20,30,40,50,60,70℃与质量分数4%的青霉素G 钾盐溶液进行酶促反应.酶液分别在20,30,40,50,60,70℃保温2h 后,在37℃与质量分数为4%的青霉素G 钾盐溶液进行酶促反应,检测酶活.1.3 测定方法1.3.1 蛋白含量测定Low ry 法.牛血清蛋白作为标准分子质量蛋白.1.3.2 SDS-PAGE 检测参照《蛋白质技术手册》[9],采用体积分数15%的电泳凝胶,上样量10 L .考马斯亮蓝R -250染色,凝胶成相分析软件扫描并分析蛋白含量.1.3.3 青霉素G 酰化酶活力的测定(PDAB 法)测定原理是青霉素G 酰化酶在37℃裂解青霉素G 产生6-APA,后者在酸性条件下与PDAB 形成西夫碱,在415nm 下有最大吸收[10].酶活定义为:在pH 7.5,37℃条件下每m in 催化青霉素G 产生1 mol /L 的6-APA 所需的酶量为1个单位(U ).根据以下公式计算酶活:73 第5期 蒋咏梅等:渗透休克法提取重组青霉素G 酰化酶及酶学性质研究酶活=(OD 415-0.02031)×V 反应0.11345×t 反应×V (酶).2 结果与讨论2.1 渗透休克法提取青霉素G 酰化酶条件的优化由于大肠杆菌产生的青霉素G 酰化酶主要定位于周质空间,采用渗透休克法不仅简便易行,还能选择性释放目标蛋白,因此优化了渗透休克法提取PGA 的条件.2.1.1 高渗处理时间实验将发酵结束的菌体悬浮于高渗溶液(质量分数为20%的蔗糖)中,分别静置不同时间,检测低渗液中的PGA 纯度和回收率.结果表明(图1),高渗处理30m in 可得到较好的纯度和收率,后续的条件优化以此为基础.2.1.2 蔗糖质量分数实验渗透休克的操作中,高渗液的质量分数很关键.分别采用不同质量分数的蔗糖进行实验.同时添加10mm ol/L 的EDTA 增加细胞膜的通透作用.由图2可见,随着蔗糖质量分数的增加,胞外的PGA 活力也显著增加,相应地,胞内酶活也随之减少.可见蔗糖质量分数增加导致细胞膜的渗透性增强.蔗糖的质量分数为30%时,85.0%的PGA 渗透出胞外.质量分数增加至40%,PGA 的回收率可达92.7%.图1 高渗时间对PGA 纯化的影响图2 蔗糖质量分数对渗透休克的影响渗透休克得到的主要是周质空间蛋白,由于PGA 定位于此,正如图3所示,杂蛋白较少,且胞外PGA 的2个亚基条带的强度随蔗糖质量分数的增加而增强,这与酶活测定结果相符.对该SDS-PAGE 中的蛋白条带进行纯度扫描(图4),发现蔗糖质量分数为10%时,PGA 在渗出液中所占比例最高,为79.4%.高渗液中蔗糖质量分数增加则导致回收的PGA 纯度下降.当蔗糖质量分数为40%,回收率达92.0%时,PGA 的含量已降至43.2%.增加蔗糖质量分数虽然可以提高回收率,但却以纯度的下降为代价.从实验的角度,选择蔗糖质量分数为30%继续后面的研究,此时的回收率和纯度分别为85.0%和61.5%.泳道1-5:表示渗透液的蛋白条带;泳道1’-5’:表示胞内的蛋白条带;泳道1、(1'),2、(2'),3、(3’),4、(4’),5、(5’):分别表示蔗糖质量分数为0,10%,20%,30%,40%时的蛋白条带图3 采用不同蔗糖质量分数对PGA渗透休克的SDS -PAGE 分析图4 蔗糖质量分数对PGA 纯度的影响 74福建师范大学学报(自然科学版) 2010年 图5 EDTA 浓度对渗透休克的影响2.1.3 EDTA 浓度实验渗透休克中,通常添加EDT A 螯和细胞壁上的M g 2+,从而使其释放脂多糖(LPS ),导致细胞外膜渗透性增强.本实验在高渗溶液中分别添加不同浓度的EDT A,配合质量分数为30%的蔗糖,考察ED-TA 浓度对PGA 释放的影响.如图5所示,在本实验条件下,即使完全不加EDT A,渗透率已达到72.0%,而不加蔗糖时渗透率几乎为0(图3),这说明渗透休克中起关键作用的是蔗糖产生的高渗环境,EDT A 只起辅助作用.但ED-泳道1-5:表示渗透液的蛋白条带;泳道1'-5’:表示胞内的蛋白条带;泳道1、(1’),2、(2’),3、(3’),4、(4’),5、(5’):分别表示EDTA 浓度为0,1,10,50,100mmol/L 时的蛋白条带图6 采用不同EDTA 浓度对PGA 渗透休克的SDS -PAGE 分析TA 对渗透效果仍有一定影响.1m mol/L 的EDT A 可以使渗透率提高10%以上,随EDT A浓度增加,渗透率也逐步增大.当EDT A 浓度增至100mmo l /L 时,有92.4%的PGA 渗出细胞.对比前后2个实验,发现蔗糖的少量不足可通过增加EDT A 的浓度来弥补.图6为不同EDTA 浓度对PGA 渗透效果的SDS-PAGE 分析,胞外PGA 含量随EDT A浓度增加而增大,这与酶活测定结果相一致.对蛋白条带的PGA 纯度扫描结果(图7)显示,随着EDT A 浓度增加,胞内PGA 纯度随之下降,说明更多的PGA 从胞内释放出来.但ED-TA 在增加细胞透性的同时,导致部分细胞裂1-5:分别表示EDTA 浓度为0,1,10,50,100m mol /L 图7 EDTA 浓度对PGA 纯度的影响解,因此PGA 的纯度下降.经上述条件优化,采用渗透休克法提取重组大肠杆菌周质空间的青霉素G 酰化酶,酶的纯度为80%,回收率92.4%,纯化倍数3.22(表1).可见,与传统超声结合柱层析的方法相比,该法可更方便、快捷地得到周质空间的产品.2.2 青霉素G 酰化酶的酶学性质研究2.2.1 最适作用pH 及其pH 稳定性以上述实验得到的低渗上清液进行酶学性质研究.在一系列pH 值的缓冲液中分别测定酶活,以所得最高酶活为100%作图(图8),发现该酶在pH 5.0～9.0之间酶活较高,超出该范围,活力明显下降.酶液在不同pH 缓冲液中37℃保温24h ,接着在标准条件下检测其残余活力,发现该酶在pH 5.0～8.0的范围内比较稳定,酶活可达80%以上.与最适作用pH 的研究结果相似,都在偏碱性条件下有个急剧的酶活下降过程.表1 渗透休克提取青霉素G 酰化酶的效果总酶活/Um (总蛋白)/mg 比酶活/(U ・mg -1)回收率/%纯化倍数全菌超声破碎液3120638008.2100-渗透休克法28834109126.492.4 3.222.2.2 最适作用温度及其热稳定性在相同的pH 缓冲液条件下(pH 7.5),分别在不同温度测定粗酶液的活性.如图9所示,PGA 的酶活受温度影响很大,最适作用温度为50℃,过高过低都不利于酶促反应的进行.KcPGA 的热稳定性不高,40℃保温2h 后酶活损失4%,50℃保温后酶活仅残余20%.75 第5期 蒋咏梅等:渗透休克法提取重组青霉素G 酰化酶及酶学性质研究图8 pH 对PGA 活性和稳定性的影响图9 温度对PGA 活性和稳定性的影响3 结论由于大肠杆菌的遗传背景清晰,常利用它来表达重组蛋白.根据目的产物分布的位置不同,采用合适的分离方法,可收到事半功倍的效果.本文对重组大肠杆菌BL21(DE3)[PET 24(+)]产生的来源于克鲁沃尔氏菌属(K luy ver a citrop hila )的青霉素G 酰化酶进行了一步纯化的研究.利用渗透休克法提取定位于周质空间的KcPGA ,通过高渗液处理时间及蔗糖和EDT A 浓度的调整,回收率92.4%的PGA 释放到胞外,且纯度达80%,可得到26.4U /m g 的比酶活,纯化倍数为3.22.此外,对PGA 的酶学性质进行了初步研究,发现KcPGA 的最适作用pH 和温度分别为pH 7～9和50℃,在pH 5.0～8.0和低于40℃的范围内比较稳定.参考文献:[1]Sakaguchi K ,M ur ao S .A preliminar y repor t o n a new enzyme “penicillin amidase ”[J ].Jo ur nal of A g riculturaland Chemical Societ y,1950,23:411-418.[2]Br ugg ink A ,Roo s E C ,de V ro om E .Penicillin acylase in the industr ial pr oduction o f -lactam antibio tics [J ].Or ganic P ro cess Resear ch and Dev elo pment ,1998,2:128-133.[3]Sanchez J,V er do ni N ,Fitton V ,et al.Efficient tw o -step chr omato gr aphic pur ification o f penicillin acylase fro mclar ified Escher ichia coli ult raso nic ho mog enat e [J ].Jour nal o f Chr omato gr aphic B Biomedical Science A pplicatio n ,2001,753(1):45-50.[4]F uent es M ,Bata lla P,G razu V ,et al.M 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青霉素发酵原理
青霉素发酵原理青霉素是一种重要的抗生素，其发酵生产工艺是通过青霉菌在合适的培养基条件下进行生长和代谢产生的。
青霉素的发酵生产是一个复杂的生物化学过程，需要合理的培养基、发酵条件和发酵设备等多方面的配合，下面将从青霉素的生产原理、发酵过程和关键因素等方面进行详细介绍。
首先，青霉素的生产原理是青霉菌在合适的培养基中进行代谢活动，产生青霉素。
青霉菌在发酵过程中，需要充足的营养物质，如碳源、氮源、磷源等，同时还需要适宜的温度、pH值和氧气供应等条件。
这些条件的合理控制对青霉素的产量和质量都有着重要的影响。
其次，青霉素的发酵过程包括青霉菌的生长、代谢和产生青霉素等多个阶段。
在发酵初期，青霉菌需要大量的营养物质进行生长，此时需要提供充足的氧气和适宜的温度来促进细胞的快速繁殖。
随着发酵的进行，青霉素的产生逐渐增加，此时需要控制好培养基的成分和发酵条件，以保证青霉素的产量和质量。
另外，青霉素的发酵过程受到多种因素的影响，包括培养基成分、发酵条件、发酵菌株和发酵设备等。
培养基成分的优化可以提高青霉素的产量和质量，而发酵条件的控制则直接影响着青霉素的生产效率。
此外，不同的青霉菌株对培养基和发酵条件的要求也有所不同，因此需要根据具体菌株的特性进行调整。
发酵设备的选择和操作也对青霉素的发酵生产起着重要的作用，合适的发酵设备可以提供良好的生产环境，保证青霉素的产量和质量。
总的来说，青霉素的发酵原理涉及到多个方面的知识，需要综合考虑培养基成分、发酵条件、发酵菌株和发酵设备等因素。
只有合理控制这些因素，才能够实现青霉素的高效生产。
希望通过本文的介绍，能够对青霉素的发酵原理有一个更加深入的了解，为青霉素的生产提供一定的参考和指导。
青霉素生物合成途径研究进展
青霉素生物合成途径研究进展青霉素是一种广泛应用于临床的抗生素，被誉为“抗生素之王”。
它的发现和应用极大地推动了现代医学的发展。
青霉素的生物合成途径一直以来都备受关注，对于深入了解其合成机制、提高产量以及开发新型抗生素具有重要意义。
本文将探讨青霉素生物合成途径的研究进展。
青霉素的生物合成途径是一个复杂的过程，涉及多个酶、中间产物和调控机制。
早期的研究表明，青霉素的合成与青霉菌属于青霉素酸链的合成有关。
青霉素酸链是一种特殊的多环多酮结构，其合成涉及到青霉素酸合成酶群的催化作用。
通过对这些酶的研究，科学家们逐渐揭示了青霉素生物合成途径的一些关键步骤。
青霉素生物合成途径的第一个关键步骤是青霉素酸的合成。
青霉素酸的合成是通过青霉素酸合成酶群来完成的。
这些酶在青霉素生物合成途径中起到了至关重要的作用。
青霉素酸合成酶群包括青霉素酸合成酶I、青霉素酸合成酶II和青霉素酸合成酶III等。
这些酶通过催化一系列反应，将脱氧谷氨酸转化为青霉素酸。
研究人员通过对这些酶的结构和功能进行深入研究，揭示了其催化机制以及调控机制。
青霉素生物合成途径的第二个关键步骤是青霉素酸的后续修饰。
青霉素酸在合成后需要经过一系列的修饰反应，才能最终形成青霉素。
这些修饰反应涉及到多个酶的催化作用，包括酰基转移酶、氧化酶、去氧酶等。
这些酶通过催化特定的反应，将青霉素酸转化为青霉素。
研究人员通过对这些酶的功能和机制的研究，揭示了青霉素酸的后续修饰过程。
青霉素生物合成途径的研究不仅有助于深入了解青霉素的合成机制，还有助于提高青霉素的产量。
在传统的青霉素生产过程中，产量往往受到限制。
通过对青霉素生物合成途径的研究，科学家们可以寻找到提高产量的方法。
例如，通过基因工程技术改造青霉菌的代谢途径，可以增加青霉素的合成。
另外，通过对青霉素生物合成途径的调控机制的研究，也可以提高青霉素的产量。
除了对青霉素生物合成途径的研究，科学家们还在努力寻找新型的抗生素。
青霉素的广泛应用导致了耐药性的产生，因此开发新型抗生素对于应对细菌耐药性具有重要意义。
青霉素G酰化酶的亚基重组
青霉素G酰化酶的亚基重组
张燕;杨晟
【期刊名称】《药学研究》
【年(卷),期】2008(027)003
【摘要】青霉素G酰化酶在半合成β-内酰胺类抗生素工业中催化关键反应.将来源于Esherichia coli的α亚基分别与Kluyvera citrophila,Providencia rettgeri,Alcaligenes faecalis的β亚基重组得到三种杂合酶,杂合酶表达量随野生型PGA同源性的减小而降低,E.coli和A.Iaecalis氨基酸序列的相同性低至41%,其杂合酶仍然具有水解3-苯乙酰胺-6-硝基苯甲酸的活力.
【总页数】4页(P171-174)
【作者】张燕;杨晟
【作者单位】青岛市药品检验所,山东,青岛,266071;青岛市药品检验所,山东,青岛,266071
【正文语种】中文
【中图分类】TQ460.6
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青霉素引起各型超敏反应机制
青霉素引起各型超敏反应机制
青霉素具有抗原表位,本身无免疫原性，但其降解产物青霉噻唑醛酸或青霉烯酸，与体内组织蛋白共价结合后，可刺激机体产生特异性IgE抗体，使肥大细胞和嗜碱性粒细胞致敏。
当机体再次接触青霉噻唑醛酸或青霉烯酸蛋白可通过交联结合靶细胞表面特异性IgE分子而触发过敏导致Ⅰ型变态反应。
青霉素抗原表位能与血细胞膜蛋白结合获得免疫原性，从而刺激机体产生药物抗原表位特异性的抗体，这种抗体与药物结合形成抗原抗体复合物后,激活补体，可引起药物性溶血性贫血、粒细胞减少症等导致Ⅱ型变态反应。
青霉素治疗时由于大量的病原体被破坏，释放大量的抗原，在血流内与相应的抗体结合成免疫复合物,激活补体，产生大量过敏毒素导致Ⅲ型变态反应。
因为青霉素是小分子半抗原物质与皮肤的蛋白质结合成完全抗原，经郎格汉斯细胞摄取提呈给T细胞，使T细胞活化、致敏。
当机体再次接触相应抗原时，引发Ⅳ型变态反应。
2021年青霉素过敏机理及急救方法
No matter where there is a genius, I use the work of others to drink coffee.勤学乐观天天向上（WORD文档/A4打印/可编辑/页眉可删）青霉素过敏机理及急救方法青霉素过敏反应机理临床使用的青霉素可分为两大类：一类是从青霉菌培养液中提取的天然青霉素Ｇ（钾盐和钠盐）；一类是半合成青霉素。
其抗菌作用强、毒性低，但对少数过敏体质的人能引起各类型的变-态反应，可达3～6％。
青霉素为半抗原，进入机体后与组织蛋白或多肽分子结合成全抗原，刺激机体产生IgE，粘附于皮肤、支气管粘膜等处微血管壁周围的'肥大细胞上或血液中的嗜碱性粒细胞表面，使机体对抗原处于致敏状态，当机体再次接触同一抗原时，IgE与之结合，导致这些细胞破裂，释放组织胺等作用于效应器官，使平滑肌收缩、毛细血管扩张，通透性增强，产生过敏反应的临床表现。
以Ⅰ型为主，任何剂量、任何剂型、任何途径均可发生，亦有初次用药者发生过敏反应的报道（因其接触过空气中的青霉菌）。
青霉素过敏反应急救(1)立即停药，平卧、保暖、给氧气吸入。
(2)即刻皮下注射0.1%盐酸肾上腺素0.5~1毫升，小儿酌减。
如症状不缓解，可每20~30分钟皮下或静脉再注射0.5毫升。
同时给予地塞米松5毫克静脉注射，或用氢化可地松200~300毫克加入5%~10%葡萄糖溶液中静脉滴注。
(3)抗组织胺类药物:如盐酸异丙嗪25~50毫克或苯海拉明40毫克肌肉注射。
(4)针刺疗法:如取人中、内关等部位。
(5)经上述处理病情不见好转，血压不回升，需扩充血容量，可用右旋糖酐。
必要时可用升压药，如多巴胺、阿拉明，去甲肾上腺素等。
(6)呼吸受抑制可用呼吸兴奋剂，如尼可刹明、山梗莱碱等。
必要时行人工呼吸或行气管切开术。
(7)心搏骤停时，心内注射强心剂，并行胸外心脏按压。
(8)肌肉张力减低或瘫痪时，皮下注射新斯的明0.5~1毫克。
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青霉素G酰化酶反应机理的说明对变异的大肠杆菌ATCC 11105中提取的青霉素G酰化酶的反应及其逆反应动力学的研究和其反应常数的确定，结果表明，酶会被过量的青霉素G和两种产物所抑制。
在正反应方向的脱酰作用中观察到6-氨基青霉烷酸（6-APA）的非竞争性抑制和苯乙醛酸的竞争性抑制。
逆酰化反应的最适pH是5.7。
此逆反应的机制被研究，底物抑制的影响也被研究，如6-APA，苯乙酸和产物。
结果表明，青霉素G是逆反应的混合型抑制剂。
版权为2001 Elsevier科学股份有限公司所有。
标签：青霉素G酰化酶；单一可逆反应；可逆单一反应；抑制；动力学；反应机理1 简介青霉素G酰化酶（PG酰化酶，EC3.5.1.11）催化青霉素分子中线性氨键水解成β-内酰胺分子，6-氨基青霉烷酸（6-APA）和相应的羧酸。
PG酰化酶用于工业半合成青霉素和头孢菌素的6-APA和7-氨基-3-脱酰头孢菌酸（7-ADCA）的生产过程中。
半合成青霉素是在酸性或中性环境中（pH4.0-7.0）产生，而6-APA 和7-ADCA则是在碱性中（pH7.5-8.5）产生。
PG酰化酶可以利用酵母，细菌或霉菌生产。
多数的PG酰化酶是用大肠杆菌生产的。
重组大肠杆菌（如ATCC 31052，11105，21285和14945）消除了一些PG酰化酶生产中遇到的问题如糖和其他碳源的代谢抑制。
在多数的工业生产过程中，部分纯化酶用在细胞或酶在不同支持物上的固定化。
由于产品成本低，细胞的固定催化会更有利益。
在间歇和连续培养的搅拌反应器中用固定化青霉素酰化酶和它的不能溶解衍生物，描述为大肠杆菌中PG酰化酶的分离和动力学青霉素酰化酶转化为6-APA。
最近的研究包括从大肠杆菌ATCC 11105的变种中提取出的并固定在过氧聚丁二烯-丙烯酸凝胶上青霉素G酰化酶的反应动力学机理，青霉素G酰化酶生物催化剂的特点和应用以及工业上以硅土为载体的青霉素G酰化酶的准备的固定化研究。
在水相中，青霉素G酰化酶断开青霉素G分子的肽链，产生一种羧酸和6-APA。
目前，青霉素G酰化酶无论是自由的还是固定化的都只有其正反应动力学被研究过，至今还没有关于其逆反应动力学的报道，例如6-APA和羧酸在青霉素G酰化酶的作用下产生青霉素G和水的生物催化反应。
正逆反应的研究和因此整个反应动力学的参数与完成比率的相等的结论需要用来预测应用在这种酶反应的反应器的性能。
在目前的文章中，研究了正逆反应的稳态动力学。
底物和产物对反应机理和抑制的影响以及整个反应的动力学参数都已经确定了。
2 材料和方法2.1 材料和微生物6-APA从Nakalai Tesque（东京，日本）购买，青霉素G钠盐由Jaber Ibn-e-Hayan Pharmaceutical公司（德黑兰，伊朗）提供。
所有试剂都是微生物纯或分析纯的。
分析纯的和酶分离与纯化的化学纯的试剂是从Merck AG（达姆施塔特，德国）和Sigma（圣路易斯，澳门）。
大肠杆菌ATCC 11105的变种是由沙里夫技术大学（德黑兰，伊朗）的生化和生物环境工程研究中心提供的。
间歇培养在0.500 L的摇瓶中装入0.100 L。
震动设为250 rpm温度25℃培养48h。
培养基组成如下（重量/体积）%：苯乙酸0.20%，酵母膏0.50%，NH4Cl 0.10%，K2HPO4 0.10%，KH2PO4 0.01% 和MgSO4·7H2O0.02%。
2.2 酶分离和纯化大部分细胞都是菌悬液在转速6000rpm温度为0-4℃条件下通过40分钟管状离心从培养基中分离出来的。
细胞破壁是菌悬液在pH7.8的0.10M的磷酸缓冲液中利用90周波的超声仪作用90秒。
菌悬液经过在转速8000rpm温度为0-4℃条件下通过管状离心去除细胞碎片。
利用（NH4）2SO4溶液沉淀法使酶液部分纯化。
酶液在（NH4）2SO4的饱和度为40-60%时沉淀分离在0.10M、pH7.8的磷酸缓冲液中。
溶液渗析后，收集沉淀，利用EDTA-纤维素作进一步纯化。
2.3 蛋白含量和酶活的测定利用Lowry法测蛋白含量。
用Balasingham法测定PG酰化酶的比活力，如下。
PG酰化酶活力一单位即1U，指在pH7.8、温度37℃100mM的磷酸缓冲液中1分钟分解1μmol的青霉素G转化为6-APA所需的酶量。
3 结果与讨论3.1 整个反应动力学与平衡常数从不同种类的大肠杆菌获得的PG酰化酶的催化下的青霉素的水解会被底物的高浓度抑制，此反应的产物6-APA和苯乙酸（PAA）分别产生非竞争性抑制和竞争性抑制。
在PG酰化酶（E）催化下的青霉素的脱酰化正反应的稳态动力学包括一种底物和两种产物即6-APA和PAA（Q）。
3.2 正反应的动力学3.3 正反应中底物（青霉素G）抑制的影响高浓度的青霉素G（30.00，40.00，50.00，60.00 和70.00 mM）对底物抑制的影响很明显，据研究它也受底物抑制常数Kia的影响。
青霉素G浓度在这样的范围（30.00-70.00mM），6-APA的产率会随着青霉素G的浓度的增加而降低。
这表明了青霉素G在上述浓度范围内的抑制影响。
3.4 正反应产物（PAA和6-APA）的抑制影响实验结果表明青霉素G酰化酶会产生底物抑制。
为了研究产物的抑制影響，分别测定PAA或6-APA的不同量时的反应速率。
缺乏6-APA时，不同浓度的PAA （0.50，0.75，1.00，1.25mM）和青霉素G （1.00，2.00，3.00，4.00和5.00 mM）的截距值，表明了PAA的竞争性抑制。
缺乏PAA时，研究不同浓度的6-APA （0.20，0.30，0.40，0.50 和0.60mM）和青霉素G （1.00，2.00，3.00，4.00和5.00 mM）的抑制影响，在抑制物的缺乏与存在时，6-APA的非竞争性抑制受到影响。
结果显示青霉素G的加入可产生两种产物抑制：首先非竞争性抑制（6-APA）然后是竞争性抑制（PAA）。
因此，PG酰化酶催化的青霉素G反应是一种有序的单一双向反应。
3.5 逆反应的pH最优化正反应是在碱性条件（pH=7.8）下的，在青霉素G酰化酶催化下的6-APA 与PAA（酰化）反应在酸性条件下。
这个反应在一定pH之下才能进行，pH是由酶反应与6-APA，PAA，青霉素G和酶原之间折中决定的。
青霉素G（正反应）酶水解的最适pH为7.8，产物的形成和青霉素G和6-APA的退化都可以忽略。
在最适pH下，水解时的缓冲要求会降低，低的产物抑制影响会很明显。
众所周知这种酰化反应只能在pH5.0到6.0中进行。
磷酸盐，柠檬酸盐和磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液用于pH为4.5，5.0，5.3，5.7和6.0，为了优化酰化反应的pH值和选择合适的缓冲液类型。
产物浓度，青霉素G浓度在反应120s中测定1.00mM6-APA 和PAA。
产生最大量的青霉素G的条件为pH=5.7，100mM柠檬酸盐缓冲液浓度可得到0.05mM的青霉素G。
青霉素G的最高浓度为0.03和0.02mM，条件为pH=5.7由100mM磷酸盐和磷酸-柠檬酸盐缓冲液提供。
因此，逆反应的最优条件为用100mM柠檬酸缓冲液构建pH=5.7，产物（青霉素G）和反应物（6-APA 和PAA）对于后续的反应处理要足够，而且酶反应的速率（青霉素G產量最大）也最大。
3.6 逆反应的动力学研究逆反应的动力学要在两种不同条件下：在不断改变的PAA浓度时测定6-APA的浓度。
当6-APA浓度改变，逆反应的速率方程如等式（4）所示有Segel 给出。
不同浓度的PAA（1.00，2.00，3.00，4.00和5.00mM）的逆反应动力学结果即当副底物6-APA在不同的固定浓度（2.00，3.00，4.00 和5.00 mM）时1/v和1/Q成比例。
在6-APA或PAA作为变化的底物的两种不同情况下，其逆反应的动力学常数的结果都很一致。
因此，此可逆反应的假设机理也很好的符合了这个以PG酰化酶催化产生6-APA和PAA的可逆双向单一反应的实验动力学资料。
3.7 在可逆反应中产物（青霉素G）的抑制影响低浓度的青霉素G（0.02，0.04，0.06和0.08 mM）用于研究此可逆反应中青霉素G的抑制反应。
较高浓度的青霉素G可能会导致正反应过强。
在两种独特的条件下研究这种抑制反映：固定PAA的浓度（2.00mM）改变6-APA的浓度（1.00，2.00，3.00，4.00和5.00 mM）和固定6-APA的浓度（2.00mM）改变PAA 的浓度（1.00，2.00，3.00，4.00和5.00 mM）。
测定产生的6-APA（青霉素G的产物）的浓度，利用柠檬酸缓冲液将pH调制5.7。
此变化6-APA浓度的双向单一可逆反应的产物抑制速率平衡方程如等式（6）所示由Segel给出。
反应中产物抑制的动力学常数是由A的不同浓度下和一定的P不饱和浓度下，1/v与1/Q的比值得出的。
由P和Q的不饱和浓度得出的Kia和Kma的值。
表示青霉素G作为一种混合型抑制剂在PAA不饱和时与6-APA有关。
饱和的PAA会掩盖这种抑制。
另一方面，青霉素G是一种在任意6-APA浓度下都与PAA 有关的竞争性抑制剂。
饱和6-APA使当前的Vmax变为真实的Vmax，但当前的Kmq依然取决于A。
速率比率的常数是：k1/k-1=0.05；k2/k-2=-1.28；k3/k-3=1.69。
从1/A的斜率或1/v轴的截距与抑制物浓度的比值计算得出的表观值kis值，此值可以由反应的动力学常数的定义或酶抑制物混合物的不相关常数来确认。
正反应和逆反应的机理和它们的比率等式以及动力学常数可用来分析反应的动力学和预测青霉素G向6-APA转化的酶生化反应的表现。
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