青霉素G酰化酶的研究进展
絮凝剂在青霉素酰化酶提取中的应用
絮凝剂在青霉素酰化酶提取中的应用
青霉素酰化酶是一种广泛应用于制药工业中的酶，能够将青霉素
与其他化合物进行酰化反应，从而合成具有抗菌作用的青霉素类药物。
然而，在酰化酶的分离和纯化过程中，常常存在蛋白质的复杂性和危
害性污染物的存在，这导致了纯化酰化酶的难度和成本的提高。
为了解决这个问题，近年来越来越多的研究者开始尝试应用絮凝
剂技术来提高纯化酰化酶的效率和纯度。
絮凝剂是一种高分子合成物，能够吸附和聚集蛋白质，将其从混合物中分离出来。
由于其具有高效、快速、简便等优点，因此在青霉素酰化酶提取中具有重要的应用。
具体而言，絮凝剂的应用主要包括以下三个方面：
1. 絮凝剂在混合物中的添加能够快速将杂质从混合物中分离出来，其中包括大分子蛋白、脂质、核酸等多种污染物。
这样一来，酰化酶
的纯度就能够大大提高，从而提高后续的药物合成效率。
2. 絮凝剂作为一种辅助的分离手段，能够有效地提高酰化酶的层析分离效果。
在丰富的实践经验基础上，絮凝剂可能在一些传统的层析分离技术和离子交换柱分离技术中起到协同加强作用。
3. 絮凝剂的选择直接影响到整个酶提取纯化过程的效果。
不同的絮凝剂具有不同的特性，包括吸附能力、选择性、重要化学、适用pH 范围等等。
因此，选择适当的絮凝剂能够提高酶在前面纯化处理过程中的提取效率和产品质量。
总之，絮凝剂在青霉素酰化酶提取中的应用是十分重要的。
通过综合应用不同的絮凝剂和分离技术，能够高效、低成本快速地纯化出高纯度的酰化酶，从而提高产业化和商业应用的效率和成本效益。
因此，对于青霉素酰化酶生产和制药企业，结合絮凝剂技术开展研究是十分必要的。
固定化青霉素酰化酶
以琳固定化青霉素酰化酶由于β-内酰胺类抗生素（β-lactam antibiotics）广谱的抗菌作用，使得这类抗生素在临床上得到了广泛的应用。
随着各类青霉素衍生物：如苄青霉素（Benzylpenicillin）、阿莫西林（Amoxicillin）、福米西林（formidacillin）等在医疗上的广泛应用，半合成（semisynthetic)β-内酰胺母核的需求量已经超过了青霉素。
目前PGA 主要用于水解青霉素G生成6-氨基青霉烷酸（6-APA）及苯乙酸，然后催化母核和不同的侧链间的合成反应生成半合成的β－内酰胺类抗生素，生物催化合成半合成的β－内酰胺类抗生素在工艺要求、产率、经济效益及环保方面都优于化学法，因此人们在这一方面进行了深入和细致的研究。
早在50 年代初就有人发现，黄青霉Q176（PenicillinmChrysoyeumn）和米曲霉（Aspergillus.oryzae）中存在水解青霉素成为6-APA的酶，即青霉素酰化酶（Penicillin acylase）青霉素G 酰化酶主要有两种来源，革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，其中四种来源于革兰氏阴性菌的PGA（大肠杆菌青霉素酰化酶、类粪产碱杆菌青霉素酰化酶、雷氏普罗威登斯菌青霉素酰化酶、克莱博氏菌青霉素酰化酶）已经克隆到大肠杆菌中进行了重组表达,并测定了序列。
青霉素酰化酶根据其底物的专一性不同，可分为三种：（1）优先水解青霉素G 的叫青霉素G 酰化酶（PGA），（2）优先水解青霉素V的叫青霉素V 酰化酶（PVA），（3）专一水解氨苄西林的氨苄青霉素酰化酶。
青霉素是一种胞内酶，PGA由α，β亚基组成，PGA 的两亚基通过轻键作用结合在一起。
单独的α亚基和β亚基均不具有酶的活性，只有当两者以适当的形式结合后才具有活性。
PGA的α亚基与青霉素的侧链结合，决定酶的底物专一性；β亚基包含催化位点以及与催化有关的残基。
固定化青霉素G酰化酶本产品大肠基因工程菌发酵产生，通过分离、纯化，然后以共价键的形式结合到多孔性颗粒状高分子聚合物载体上，制成的固定化酶使用稳定性好，酶蛋白不易脱落。
青霉素G酰化酶的亚基重组
９０ ．３ ８８ 、３ ８６ ．３ ８３ １ ７ ．２ ３
尼 莫 地 平 为 水难 溶性 药 物 ， 由于 其 溶 解 度 极 小 和 较 强 的 首 过 作 用 ， 使 口服 生 物 利 用 度 较 低 ， 康 受 试 者 及 蛛 网膜 致 健 下 腔 出 血 患 者 的 生 物 利 用 度 分 别 为 ５ ～ ｌ 和 ３ ～ ３
维普资讯
齐鲁 药 事 ・Ｑｉ ｈ ｉ ａｅｔａ Ａ ｆ ｉ ０ ８ ｌ ｌ ７ Ｎｏ ３ ｌ Ｐ ａｍ ｃ ｉ ｌ ｆ ａ ｓ ０ ／ ， ｕ ｕ ｃ ｒ２ ｏ２ 另 精 密 称 取经 １ ５ 干 燥 至 恒 重 的 尼 莫 地 平 对 照 品 约 ０℃ ５ ｍｇ 置 ｌ ０ 量瓶 中 ， 异 丙 醇 适 量 溶 解 稀 释 至 刻 度 ． ０ ， ０ ｍＩ 加 摇 匀 ； 别精 密 量 取 ２ 置 １ ０ 瓶 中 ， 分 别 加 上 述 酸 分 ｍＩ ， ０ ｍＩ 量 并 性 溶 液 和 缓 冲 液 成 每 ｌ 中约 含 ｌ １ ｍＩ ０ ｇ的对 照 品 溶 液 （ ） ， １ 和 对照品溶液（） ２ 。取 对 照 品 溶 液 （ ） 供 试 品 溶 液 （ ） 对 照 １与 １， 品溶 液 （ ） 供 试 品溶 液 （ ） （ ） 照 分 光 光 度 法 （ 中 国药 ２与 ２ 、３ ， 《 典 ￣ ０ ５ 版二 部 附 录 Ｉ ２０ 年 ＶＡ） 在 ２ ９ ｍ 的 波 长 处 测 定 吸 收 ． ３ｎ 度 ． 别 计算 每 片在 不 同时 间 的 释放 量 。 分
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４ 讨 论
５
盘尼西林合成方法综述
盘尼西林合成方法综述盘尼西林合成方法综述姜昊（912103860236）化工学院摘要：青霉素（Penicillin，或音译盘尼西林）又被称为青霉素G、peillin G、盘尼西林、配尼西林、青霉素钠、苄青霉素钠、青霉素钾、苄青霉素钾。
青霉素是抗菌素的一种，是指分子中含有青霉烷、能破坏细菌的细胞壁并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用的一类抗生素，是由青霉菌中提炼出的抗生素。
在医药史上它与阿司匹林、安定并称为三大经典药物。
鉴于它在医药史上的重要性，本文就此介绍一些比较成熟，有效的合成方法。
关键词：青霉素合成方法青霉素是抗菌素的一种,是从青霉菌培养液中提制的药物,是第一种能够治疗人类疾病的抗生素。
青霉素的出现开创了用抗生素治疗疾病的新纪元。
在二战时期拯救了数千万人的生命。
天然青霉素：青霉素这族抗生素包括着若干种结构密切相联系的物质，他们共同的结构经证明如右式：应优先地进行。
此种反应收率只有百分之十，但对于合成天然青霉素已经比较高了。
半合成青霉素：半合成青霉素由于天然青霉素存在有抗菌谱窄、不耐胃酸口服无效及不耐酶易被水解等缺点，因此，通过改变天然青霉素G的侧链可获得耐酸、耐酶、广谱、抗铜绿假单胞菌及主要作用于G-菌等等一系列不同品种的半合成青霉素。
以6APA为中间体与多种化学合成有机酸进行酰化反应，可制得各种类型的半合成青霉素。
6APA是利用微生物产生的青霉素酰化酶裂解青霉素G或V而得到。
酶反应一般在40～50℃、pH8～10的条件下进行；近年来，酶固相化技术已应用于6APA生产，简化了裂解工艺过程。
6APA也可从青霉素G用化学法来裂解制得，但成本较高。
侧链的引入系将相应的有机酸先用氯化剂制成酰氯，然后根据酰氯的稳定性在水或有机溶剂中，以无机或有机碱为缩合剂，与6APA进行酰化反应。
缩合反应也可以在裂解液中直接进行而不需分离出6APA。
经过研究人员与科研人员的不断研究，关于半合成青霉素的合成有了很大的进展。
唐广安等[2]以D-天门冬氨酸和阿莫西林三水酸为原料,经过6步反应形成产物。
青霉素的生物合成和应用研究
青霉素的生物合成和应用研究青霉素是一种重要的抗生素，在医学领域有着广泛的应用。
它由青霉菌属（Penicillium）产生，是这一属中最著名的成员之一。
青霉素的生物合成过程是一个复杂的过程，通常分为三个阶段：第一阶段是初级代谢，包括生长和营养代谢。
第二阶段是次级代谢，包括产生次级代谢产物的过程。
最后一个阶段是生物转化，这一阶段是由菌体内的细胞酶和其他组分构成的。
在生物合成之前，细胞必须先收集和合成所有必需的原料。
这些原料包括碳源、氮源、氧源和各种矿物质。
碳源主要来自葡萄糖，从而提供例如葡萄糖酸和半乳糖酸等中间产物。
氮源来自于氨基酸和蛋白质代谢废物。
同时，青霉菌还需要其他微量元素和维生素等物质。
生物合成的关键步骤之一是青霉素酸的合成。
在消耗能量的过程中，青霉素酸的核心框架由天然氨基酸和中间代谢产物半乳糖酸组成。
青霉素酸的合成需要多种酶、辅酶和催化剂协同作用，通过多个反应步骤完成。
完成青霉素酸的合成后，产生一个原初的抗生素戊二酸青霉素，这种抗生素本身并没有抗菌作用。
经过两次化学修饰，包括羟化和戊二酰化，才得以形成有效的青霉素抗生素。
青霉素的应用研究主要集中在两个方面：一是探究青霉素的抗菌机理，二是开发新型青霉素抗生素。
在抗菌机理研究方面，通过分析青霉素和细胞壁合成的关系，揭示了青霉素抗菌作用的机制。
这一发现极大地推动了抗生素研究的进程。
同时，新型青霉素抗生素的研究也得到了蓬勃发展。
比如说，设计更广谱的抗菌药物，或者配合其他药物来增强其对抗菌的效果。
总体来说，青霉素的生物合成和应用研究是医学领域至关重要的研究方向。
青霉素的发现和应用一直以来都是人类医疗史上的里程碑之一，而对其生物合成和应用机理的深入研究，将有助于更好地理解这一类抗生素的作用，从而为医学研究提供更多方向和机会。
青霉素酰化酶纳米凝胶的制备与性质
第６２卷第６期 ２０１１年６月 化 工
ＣＩＥＳＣ 学报
Ｊｏｕｒｎａｌ Ｖｏ１．６２
Ｊｕｎｅ ＮＯ．６
２Ｏ１１
青霉素酰化酶纳米凝胶的制备与性质 孔 宪，李畅原，卢滇楠，李 强，刘 铮 （清华大学化学工程系，北京１０００８４）
摘要：提高青霉素酰化酶的耐热性和耐有机溶剂性对于其工业应用具有重要的意义。采用Ｅ．ｃｏｌｉ Ｔｏｐｌ０Ｆ ／ ｐＧＥＭＫＴ—ＴａｃＰＧＡ—Ｔａｇ为表达菌株发酵生产青霉素酰化酶，经金属螯合层析得到比酶活为２３２００ Ｕ・Ｌ 的青霉 素酰化酶样品，将青霉素酰化酶样品与丙烯酰琥珀酰亚胺反应在酶分子表面修饰上丙烯酰基，然后加入丙烯酰 胺单体，通过聚合反应得到凝胶直径在１２～１６ Ｄ．ｍ的青霉素酰化酶纳米凝胶，聚合反应的酶活收率为９Ｏ 。与 青霉素酰化酶样品相比，青霉素酰化酶纳米凝胶具有相同的荧光发射光谱，其在６Ｏ℃时的酶活半衰期是自由酶 的７５倍；在３Ｏ℃，４Ｏ （体积）的甲醇、乙醇中的酶活半衰期分别是自由酶的１５倍、２６倍。 关键词：青霉素酰化酶；纳米凝胶；酶修饰；稳定化 ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．０４３８—１１５７．２０１１．０６．０２５ 中图分类号：ＴＱ ４２６．９７ 文献标志码：Ａ 文章编号：０４３８—１１５７（２０１１）０６—１６４１—０８
Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ ａｃｙｌａｓｅ ｎａｎｏｇｅｌ
ＫＯＮＧ Ｘｉａｎ，ＬＩ Ｃｈａｎｇｙｕａｎ，ＬＵ Ｄｉａｎｎａｎ，ＬＩ Ｑｉａｎｇ，ＬＩＵ Ｚｈｅｎｇ （Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｔｓｉｎｇｈｕａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００８４，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ ａｃｙｌａｓｅ ａｔ ｈｉｇｈ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｎｄ ｉｎ ｏｒｇａｎｉｃ ｓｏｌｖｅｎｔｓ ｉｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｔｏ ｉｔｓ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｔｈｉｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｗｏｒｋ ｓｔａｒｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｔｏｐｌ０Ｆ ／ｐＧＥＭＫＴ—ＴａｃＰＧＡ—Ｔａｇ．Ｔｈｅ ｃｒｕｄｅ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ ａｃｙｌａｓｅ ｗａｓ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｕｓｉｎｇ ｍｅｔａｌ ｃｈｅｌａｔｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ｔｈｅ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ ａｃｙｌａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｗａｓ ｏｆ ｐｕｒｉｔｙ ２３２００ Ｕ・Ｌ一 ． Ｅｎｃａｐｓｕ１ａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ ａｃｙｌａｓｅ ｉｎｔｏ ｎａｎｏｇｅｌ ｗａｓ ａｃｃｏｍｐｌｉｓｈｅｄ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ａｑｕｅｏｕｓ ｔｗｏ—ｓｔｅｐ ｉｎ ｓｉｔｕ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ，ｉｎ ｗｈｉｃｈ ｔｈｅ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ ａｃｙｌａｓｅ ｆｉｒｓｔｌｙ ｒｅａｃｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｎ—ａｃｒｙｌｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ＳＯ ｔｏ ｇｅｎｅｒａｔｅ ｖｉｎｙｌ ｇｒｏｕｐｓ ｏｎ ｉｔｓ ｓｕｒｆａｃｅ，ａｎｄ ｔｈｅｎ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚｅｄ ｉｎ ａｑｕｅｏｕｓ ｍｅｄｉｕｍ ｕｓｉｎｇ ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ａｓ ｍｏｎｏｍｅｒ ａｎｄ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｐｅｒｓｕｌｆａｔｅ ａｓ ｉｎｉｔｉａｔｏｒ．Ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｗａｓ ９０ ，ａｎｄ ｔｈｅ ｄｉａｍｅｔｅｒ ｏｆ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ ａｃｙｌａｓｅ ｎａｎｏｇｅｌ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｗａｓ １２—１６ ｎｍ．Ｔｈｅ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ ａｃｙｌａｓｅ ｎａｎｏｇｅｌ ｈａｓ ｓｈｏｗｎ ａｎ ｉｄｅｎｔｉｃａｌ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ｉｔｓ ｎａｔｉｖｅ ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔ．Ｍｏｒｅｏｖｅｒ，ｔｈｅ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ｉｎｔｏ ｎａｎｏｇｅｌ ｌｅｄ ｔｏ ａ ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｔ ｈｉｇｈ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｎｄ ｉｎ ｐｏｌａｒ ｓｏｌｖｅｎｔｓ， ａｓ ｓｈｏｗｎ ｂｙ ｔｈｅ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｏｆ ｔ ／２ ｂｙ ７５一ｆｏｌｄ ａｔ ６０℃，ａｎｄ １５一ａｎｄ ２６－ｆｏｌｄ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ４０ （ｖｏ１） ｍｅｔｈａｎｏｌ ａｎｄ ｅｔｈａｎｏｌ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ｉｔｓ ｎａｔｉｖｅ ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔ．
苯氧甲基青霉素分离技术及其应用研究进展
苯氧甲基青霉素分离技术及其应用研究进展本文对青霉素V的分析方法、提取分离技术及应用进行了阐述。
重点介绍了其应用特别是在下游产品生产技术方面的优势。
同时，对今后青霉素V技术发展方向进行了展望。
标签：青霉素;青霉素V;分离技术一、青霉素概述1929年Flemming发现了青霉素（Penicillins），这是世界上最著名的抗生素，也是人类应用于临床的第一种抗生素。
青霉素是临床抗感染的首选药物之一，长期以来，国内外临床一致证实青霉素具有抗菌作用强、疗效高、毒性低等优点，目仍广泛应用于临床，而且在治疗很多感染疾病中仍为首先药物。
青霉素是由青霉菌所产生的一类抗生素的总称，它们是由不同菌种或同一菌种在不同培养条件下培养所得的同一类化学物质。
青霉素是临床抗感染的首选药物之一，同时又是裂解生产6 APA（6氨基青霉烷酸）和7 ADCA（7氨基3去乙酰氧基头孢烷酸）等半合成抗生素中间体的重要原料，是当今β内酰胺抗生素市场的基石。
青霉素发酵液中含有5种以上天然青霉素（如青霉素F、G、X、K、F和V等），其共同的化学结构如图。
1.2青霉素V概述苯氧甲基青霉素又称青霉素V，最初是由Behrens等于1947年采用生产青霉素G菌种，在发酵过程中加入正（2羟乙基）苯氧乙酰胺特殊前体试制成功，并于1955年生产出口服制剂并应用于临床。
青霉素V对酸稳定性高，不易被胃酸破坏，口服吸收好，其口服剂尤其适合儿童使用。
而且作注射针剂使用时，可不做皮试，安全性高。
目前，美国、英国、德国等国家均有规模生产，并在美国、日本、西班牙、荷兰和西欧等一些国家的临床上广泛使用。
青霉素V分子结构主要由β-内酰胺环和四氢噻唑环组成，其中β-内酰胺环起到主要的抗菌作用，含有苯氧甲基的侧链结构对青霉素V 的理化性质也有较大的影响。
青霉素分子中含有3个不对称碳原子，故具有旋光性。
青霉素V 用青霉素酶失活后，在268nm 和274nm 有两个苯环吸收峰，其消光系数分别为1330 和1100，比值为1.2。
青霉素酰化酶的分离纯化
双功能膜纯化和固定PGA
Chih-I Chen等通过实验，将吸附于固定 化Cu2+亲和膜的青霉素酰化酶与膜表面 物质共价结合，制备成固定化酶
工艺流程
PGA
18℃ 12h
EDTA
pH 10.0, 18℃,76h
青霉素酰化酶； Cu2+；
配位键；
共价键
原初膜与固定化酶后的膜表面电镜结构
结果
离子交换膜色谱
离子交换膜色谱：离子交换膜色谱主要是利用 膜介质表面的离子交换基团与目标蛋白之间的 离子交换作用进行分离的根据离子交换基团的 性质，可分为强阳离子型、弱阳离子型、强阴 离子型、弱阴离子型。
离子交换膜色谱的特点
操作条件较温和
使用寿命长 选择性差
离子交换膜色谱分离青霉素酰化酶
青霉素酰化酶的分离纯化
青霉素
青霉素是常见抗生素之一。来源于点青霉、产 黄青霉等真菌。对革兰氏阳性菌的生长有抑制 作用
青霉素
青ห้องสมุดไป่ตู้素的分类
青霉素的代谢途径
α-氨基己二酸 半胱氨酸 缬氨酸
ACVS α-氨基己二酰半胱氨酰缬氨酸 IPNS
异青霉素N
AT 青霉素
AT是一系列不同的酶。不同的AT催化不同的酰 基转移反应生成不同的青霉素 添加苯乙酸相应的AT催化它与异青霉素N反应 生成青霉素G 添加苯氧乙酸时，相应的AT催化它与异青霉素 N反应生成青霉素V
固定化
分离纯化
传统的分离纯化方法
硫酸铵沉降
葡聚糖凝胶色谱 离子交换色谱 电泳
据我们组阅读的文献，传统方法分离青霉素酰 化酶的回收率大部分在30%至50% 有必要开发新型提纯工艺
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原理
特点 酶回收率比超声波处理方法高，而且酶的比活
较高。(Alves等,2003)
PGA的纯化
Zhou Z 等发酵所得的青霉素G酰化酶经硫酸铵分级沉淀和
welcome to use these PowerPoint templates, New DEAE-Sepharose CL-6B 两步纯化, 纯度提高86 倍, 活力回 Content design, 10 years experience 收率达到81 %,纯化后的PGA 活力为1. 469 u/ mg.(Zhou 等,2002)
上的固定化及后修饰，得到固定化酶表观酶活为177U/g, 固定化酶经巯基乙醇修饰后提高了操作稳定性及热稳定
性。(颜淑玮等，2006)
PGA的固定化
welcome to use these PowerPoint templates, 目前已有很多方法将含 PGA的大肠杆菌 E.coliNew 菌株及突 Content design, 10 years experience 变菌种的细胞进行固定化，如包裹在聚甲基丙烯酸酰胺 细胞内部，或者包裹在凝胶基质中。所得的固定化酶能 够有效地水解青霉素G,水解效果优于自由酶。
特点 酶比活力高,酶活力较超声波法低。(张贺迎等,2000)
PGA的分离提取
有机溶剂法
welcome use these PowerPoint templates, New 原理 to 本法是利用有机溶剂溶解细菌细胞内膜的脂肪 , Content design, 10 years experience 从而释放酶。不同浓度的有机溶剂对细胞内膜的作用 不同,释放出不同量的酶。
u/L。（杨志建等，2004）
PGA产生菌改造与发酵条件的优化
发酵条件的优化
welcome to use these PowerPoint templates, New Pinotti 等对B.megaterium ATCC14945的培养条件 Content design, 10 years experience 进行研究, 结果表明氮源与酶产量之间有较密切的 联系,并且葡萄糖对产酶有抑制作用,用水解后的酪 蛋白和奶酪乳清作氮源，酶浓度达最大值138IU/L。
能够水解青霉素G(Penicillin G，PG)脱苯乙酰生成6-APA。
（杨志建等,2004;范超等,2011）
PGA的简介
PGA的来源 细菌PGA家族成员分为革兰氏阴性菌和革兰氏阳性 菌。前者有大肠杆菌(Escherichia coli，Ec)、 嗜柠檬酸克吕沃尔 氏菌 (Kluyvera citrophila，Kc)、雷氏普罗威登斯菌 (Providencia rettgeri，Pr)、粪产碱杆菌 (Alcaligenes faecalis，Af)、无色杆菌 木糖氧化属 （Achromobacter xylosoxidans，Ax） 与假单胞菌属 (Pseudomonas sp. ，Ps)等。后者为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium,Bm)与粘节杆菌(Arthrobacter viscosus,Av).(杨志建等,2004)
PGA的简介
PGA的结构 青霉素G酰化酶由α，β亚基通过氢键作用结合在一
起，单独的α和β亚基均不具有酶活性，只有两者以适当的形式 结合后才具有活性。PGA的α亚基与青霉素G的侧链结合，决定
酶的底物专一性；β亚基包含催化位点以及与催化有关的残基。
(李宁等,2002)
AfPGA的简介
粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis) 是产碱杆菌属 (Alcaligenes)
PGA的分离提取超声破来自法原理 本法是利用钛探头的振动在细胞悬液中产生出 welcome to use these PowerPoint templates, New 共振腔, 共振腔的坍塌引起压力变化,产生剪切力破碎 Content design, 10 years experience 细胞。利用大肠杆菌作为基因工程菌, 多采用超声波
PGA目前的研究内容
生产菌种的 选育和改造
Ⅰ Ⅵ 酶法生产 6- APA的 下游工程 Ⅱ 发酵生 产工艺 Ⅳ 大规模 提纯 Ⅲ
其他性质的 应用研究
主要内容
Ⅴ
酶固定化
PGA产生菌改造与发酵条件的优化
PGA产生菌改造
由于野生型微生物产生的青霉素酰化酶量较少,且酶活
welcome to use these PowerPoint templates, New , 较低,故当前许多研究者从基因水平上优化宿主细胞 Content design, 10 years experience 旨在提高野生型菌种的产酶能力和酶活力 ,减少β -内 酰胺酶的产生以及弱化或消除不利于青霉素酰化酶工 业化应用的因素。
特点 酶比活较高,酶容易失活。(Alves等,2003)
PGA的分离提取
反胶束溶液提取法 反胶束技术被用来提取分子量从6KD到100KD welcome to use these PowerPoint templates, New 的许多蛋白质和酶,对它们活力的损害很小。二‐(2‐ Content design, 10 years experience 乙基已基)硫代琥珀酸钠(AOT)稳定的水‐已烷粗乳状 液和细乳状液可选择性地改变大肠杆菌细胞通透性， 用于提取青霉素酰化酶。
杨志建等用DEAE-Sepharose CL-6B 离子交换层析和ButylSepharose CL-4B 疏水层析纯化菌体破碎后的上清液，可得
纯度提高20 倍、比活为 6816 u/mg 的青霉素G酰化酶, 两步
纯化的总收率达91 %.(杨志建等，2004)
PGA的固定化
青霉素酰化酶的固定化采用固定化细胞或固定化酶2种
高表达量为 653u/L A.faecalis表达量高109倍。 Content design, 10，比野生型 years experience
(Zhou等,2002)
杨志建等将粪产碱杆菌青霉素G酰化酶基因构建重组表达
质粒pKKFPGA ,pKKFPGA 再转化到宿主菌DH5α ,所得重组 菌不需诱导便能高效表达青霉素G酰化酶,表达量2590u/L 比野生型粪产碱杆菌表达量高432倍,其菌体比活力达300
的合成能力。(史敏龙等，2003)
PGA产生菌改造与发酵条件的优化
发酵条件的优化
范超等采用 Box-Behnken 实验设计和响应面分析方法 welcome to use these PowerPoint templates, New ,
对重组巨大芽孢杆菌产青霉素 G酰化酶的发酵条件进 Content design, 10 years experience 行优化,得出其最佳发酵条件为: 葡萄糖32 g/L、胰 蛋白胨17 g/L、时间42.5 h、温度34℃,在此条件下 青霉素G酰化酶的活力达到10 614±8 U/L,较优化前 提高了16.83%。(范超等,2011)
细菌的模式菌种,该菌在自然界分布很广,是土壤中最常见的
异养微生物之一。目前有些菌株已是应用于发酵生产青霉素 G酰化酶的重要基因工程菌。 (李美等,2009)
AfPGA 是粪产碱杆菌来源的青霉素G 酰化酶，AfPGA基因
直到1994年(美国专利5695978)才被克隆，同源性比较结果 表明它处于进化过程的一个独立分支。
小结
青霉素酰化酶在半合成抗生素生产中起着很重要的 作用，其中PGA是在工业生产中应用最多的，随着酶技 术的不断发展，PGA在固定化技术、非水相介质酶催化 技术及定点突变技术等方面取得了一定的发展，而且研 究者不断采用基因工程方法筛选高产PGA的优质菌株。 PGA在基因工程和酶工程方面的不断发展，将使其在医 药、食品、中间体合成等领域的应用逐步扩大。
青霉素G酰化酶（PGA） 的研究进展
背景介绍
青霉素是应用最广的β-内酰胺类抗生素,由于青霉素滥用 导致了抗性病原体产生, 利用新型半合成抗生素是克服这
种抗性病原体产生的有效方法。
大多数新型半合成抗生素由6-APA转化得到，而6-APA主要 由天然氨苄青霉素经酶法或化学方法去酰基得到。酶法合 成具有绝对专一性、避免造成环境污染、产物容易提纯等 优点，是目前生产6-APA的主要方法。 青霉素G酰化酶(Penicillin G acylase,PGA,EC3.5.1.11)
(Hsiau等,1997;Norouzian等,2002)
存在的问题
welcome to use these PowerPoint templates, New 野生型菌种产酶量和酶活力均比较低。 Content design, 10 years experience
大多数微生物来源的PGA为胞内酶，提取困难。
对青霉素酰化酶产生菌进行菌种改造的手段有物理或
化学诱变、定点突变和利用基因工程改良菌种。
PGA产生菌改造与发酵条件的优化
PGA产生菌改造
Zhou Z等构建的工程菌B. subtilis (pMAPGA)和B. subtilis
welcome to实现了 use these PowerPoint templates, New (pBAPGA) AfPGA 的胞外分泌表达。分泌表达的最
在外消旋混合物的拆分中的应用 青霉素酰化酶对苯乙酰
胺基团有立体选择性, 可用于胺和醇的拆分。拆分得到的
单一对映体可用作合成生物活性化合物的中间体。
在肽合成中的应用 利用青霉素酰化酶可以催化直接的酶
合成反应和酰基转移反应来合成肽及其衍生物。
(崔鹏等,2005;杨志 建等,2004;李震等,2008)
催化水解反应制备半合成抗生素中间体6 -APA和7- ACA。 welcome to use these PowerPoint templates, New 在半合成β内酰胺抗生素合成中的应用 具体是利用青霉 Content design, 10 years experience 素酰化酶催化酰基侧链和β内酰胺核发生缩合反应生产半 合成青霉素和头孢菌素。