青霉素酰化酶的生产及应用
青霉素酰化酶 生化10136号
例子：王祯祥等采用理化因子反复诱变的方法,
对巨大芽孢杆菌Bacillus megate2rium 进行处理,得 到了孢外青霉素酰化酶的高产菌株,酶活力大大提高。 黄艳红等将来自于巨大芽孢杆菌的青霉素G 酰化酶 基因克隆到大肠杆菌———枯草芽孢杆菌穿梭质粒 pMA5 中,然后转化到枯草杆菌BCL1050 中,在Hpa 启动作用下进行表达。表达产物通过苯丙氨酸Sep harose 4B柱、Sep hacrylS 100 和DEAE Sep hadexA 50 柱纯化,得到了纯度达90 %以上的青霉素 酰化酶。研究者还采用了随机诱变、基因克隆等方 法处理青霉素酰化酶的产酶菌株,从而提高产酶能力, 并改善酶的特性。
青霉素酰化酶具有广泛的市场应用前景, 青霉素酰化酶已有效地应用于半合成β 内酰 胺抗生素的生产、肽的合成和外消旋混合 物的拆分中。随着酶技术的不断发展,青霉 素酰化酶在固定化技术、非水相介质酶催 化技术及定点突变技术等方面取得了一定 的发展,而且研究者不断采用基因工程方法 筛选产青霉素酰化酶的高产优质菌株。青 霉素酰化酶在基因工程和酶工程方面的不 断发展,将使其在医药、食品、中间体合成 等领域的应用逐步扩大。
青霉素酰化酶:
又称为青霉素酰胺酶或青霉素氨基水解酶。 主要从大肠埃希菌胞内酶和巨大芽孢杆菌胞外酶 获得，该酶已大规模应用于工业生产β- 内酰胺类 抗生素的关键中间体和半合成β- 内酰胺类抗生素。 根据底物特异性的不同,青霉素酰化酶可分为3 种 类型:第一类由细菌产生,适合于水解青霉素G,大多 为体内酶;第二类由放线菌、真菌产生,适合于水解 青霉素V ,几乎均为体外酶;第三类由假单孢菌产生, 适合于水解氨苄青霉素。
在半合成β 内酰胺抗生素合成中的应用
青霉素酰化酶催化水解反应得到中间体 6APA 和7 ACA 后,下一步可以生产半合成青霉 素和头孢菌素。具体的是利用青霉素酰化酶催化 酰基侧链和β 内酰胺核的缩合反应。酶法合成β 内酰胺类抗生素可以通过动力学或热力学控制完 成。动力学控制的合成反应的产量取决于酶催化 的3 种不同反应的速率: (1)β 内酰胺类化合物的合成反应; (2) 活化的酰基供体的水解反应;
青霉素酰化酶的固定化与应用新进展
青霉素酰化酶的固定化与应用新进展在如今医疗体系发展的过程中，青霉素酰化酶已经被广泛的使用到了抗生素制备体系中，以及一些多肽合成体系中。
高效的青霉素酰化酶使用，能够最大限度的提升酶本身在PH值、溶剂极性、温度等各个方面适用效果大幅度提高，这实际上已经成为了青霉素酰化酶在如今工业体系中应用的关键。
本篇文章着重针对青霉素酰化酶的固定化以及应用进展进行了全面详细的探讨。
标签：青霉素酰化酶；载体；固定化；反应介质；固定化酶的应用青霉素酰化酶本身在实际使用的过程中，呈现出了良好的溶剂记性使用想以及反复使用的多方面稳定效果，由于这一特性的存在，使得青霉素酰化酶已经成为了工业体系的关键梭子啊。
下文主要是从载体选择固化以及应用的进展上来进行了全面详细的探讨。
1、载体形式1. 1有机高分子载体有机载体本身在实际使用的过程中，实际上具备了极为优秀的机械性强度，同时也完全可以通过产业化形式进行生产，天然性质的高分子载体在实际运行的过程过程中，表现出了极为优秀的传质性能、无毒性，被广泛使用到了壳聚糖、甲壳素之中。
由于其本身呈现出的有机分子有着较高的强度，但是在传质性能较差的情况下，例如聚丙烯酰胺、聚乙烯醇等一列的物质。
而从相关的研究结果来看，在针对高密度环氧结构体系下的载体固定，使用青霉素酰化酶执行了相应的处理之后又，催化活力所表现出的相关游离酶在这一过程中大幅度的提高，并且呈现出的重复使用稳定性也极强。
1.2无机分子载体在如今材料学持续发展的过程中，已经涌现出了孔分子筛形式的载体，其本身能够有效的对于高稳定的固化酶进行制备处理。
在使用了无机载体执行表面修饰以及酶固定的相关措施之后，其本身所表现出的相关性能实际上必然能够有较大幅度的提升。
某小组在进行课题研究的过程中，曾直接使用表面氨基形式的介孔二氧化硅材料，来针对青霉素酰化酶加以固定处理，其中呈现出的活力实际上直接达到了90%及以上，特别是在循环使用10次的催化处理之后，其中所表现出的活力实际上依然是维持在94%的水平上。
表面活性剂法破壁提取青霉素酰化酶
２ ． 表 面活 性 剂 法 优 于 其 他 提 取 方 法 ． 该法操作简单 ． 提取 收率高 ， 减 少 了水 、 电等 能 耗 ， 且 避 免 了高 压 均 质 机 等 高 压 设 备 的使 用 ， 是 一 种 利 于 推 广 的毕 赤 酵 母 的 破 壁 提 取 方 法 。 （ 作 者 单位 ： 华 北 制 药 股份 有 限公 司 ）
关 系
稀释 １ ． ５倍 。
２ ． 试剂 准备 ： １ Ｏ ％ 十六 烷 基 三 甲 基 溴 化 铵 （ Ｃ Ｔ Ａ Ｂ ） （ 表 面
活性剂 ） 。 ６ ０ ｏ Ｃ 热 水溶 解 ； １ ｍ ｏ ｌ ｌ ＬＮ ａ Ｏ Ｈ。
二、 方法 与计 算
酶 活 收率 ＝ 离 心 上 清 液 酶 活／ 混 液 酶 活
应 用 技 术
暑 ■ — ＿馕 富
表面活性剂法破壁提取青霉素酰化酶
李 涛
． 一 ｛ Leabharlann 霉 素 酰 化 酶 广 泛 应 用 于 半 合 成抗 生 素 及 中 间体 的制 备 、手 性 药 物 的拆 分 和 多 肽 合 成 等 方 面 。 由 巴斯 德 毕 赤 酵母 产 生 的 青 霉 素
加入 １ ０ ％表 面 活性 剂 溶 液 （ Ｃ Ｔ Ａ Ｂ ） ． 搅拌均匀后升温至 ４ １ ℃， 保 温 ２小 时 ， 期 间维持 ｐ Ｈ ６ ． ７ ￣ ０ ． １ ， 保 温 结 束 后 检 测 发 酵 液
混液酶活和上清液酶活， 计 算 酶 活 收率 。
为 低温 条件 下 酶 由细胞 内释 放 到细胞 外速 度 较慢 ． 而温 度 ４ ３℃ 时酶 活 损 失 明 显 ． 应该 是 温 度 过 高 对 活性 蛋 自的破 坏导 致 ． 由 此 确定青霉 素酰化酶 破壁温度保 持在 ４ １℃至 ４ ２℃可 使 酶
青霉素G酰化酶的研究进展
原理
特点 酶回收率比超声波处理方法高，而且酶的比活
较高。(Alves等,2003)
PGA的纯化
Zhou Z 等发酵所得的青霉素G酰化酶经硫酸铵分级沉淀和
welcome to use these PowerPoint templates, New DEAE-Sepharose CL-6B 两步纯化, 纯度提高86 倍, 活力回 Content design, 10 years experience 收率达到81 %,纯化后的PGA 活力为1. 469 u/ mg.(Zhou 等,2002)
上的固定化及后修饰，得到固定化酶表观酶活为177U/g, 固定化酶经巯基乙醇修饰后提高了操作稳定性及热稳定
性。(颜淑玮等，2006)
PGA的固定化
welcome to use these PowerPoint templates, 目前已有很多方法将含 PGA的大肠杆菌 E.coliNew 菌株及突 Content design, 10 years experience 变菌种的细胞进行固定化，如包裹在聚甲基丙烯酸酰胺 细胞内部，或者包裹在凝胶基质中。所得的固定化酶能 够有效地水解青霉素G,水解效果优于自由酶。
特点 酶比活力高,酶活力较超声波法低。(张贺迎等,2000)
PGA的分离提取
有机溶剂法
welcome use these PowerPoint templates, New 原理 to 本法是利用有机溶剂溶解细菌细胞内膜的脂肪 , Content design, 10 years experience 从而释放酶。不同浓度的有机溶剂对细胞内膜的作用 不同,释放出不同量的酶。
u/L。（杨志建等，2004）
PGA产生菌改造与发酵条件的优化
固定化青霉素酰化酶(PGA)生产7-ADCA技术
7－ADCA 英文名称为 7－Amino－3－desacetoxyceph-alosporanic Acid, 产品为白色或微带黄色结晶性粉末。在水、乙醇或丙酮中不溶，在强酸或强碱溶 液中溶解。分子式 C8H10N2O3S。
2 用途
7－ADCA 是一种重要的头孢类抗菌素半合成中间体，在医药合成中主要用 于合成以下几种失孢菌素类药物：
我国的头孢菌素生产起步较晚，由于受中间体合成技术的限制，我国长期 以来一直依靠进口 7－ADCA 或者进口原料药未满足国内市场需求，我国从“六五” 开始立项研制该产品，但因技术原因未能彬成工业化生产，仍然依赖进口。
在多年科研的基础上，1990 年代中期哈尔滨制药总厂投资建设了一条生产 线，成为当时中国唯—一家具有 6－APA、7－ ACA、7-ADCA 三大抗生素母核生产 能力的制药企业，现在该公司 7－AnA 生产能力已达到 22 t／a。浙江永宁制药 厂也建设了一条 50 t／a 生产线。“七五”以来，为改变我国半合成抗生素依赖 进口的局面，华药积极致力于半合成抗菌素的研究和产品升发。经过 10 年多的 不懈努力，到 1999 年初开发出了加工半合成抗菌素的中间体 6－APA、7－ADCA 等，而且还研制开发出了半合成青霉类、半合成头孢菌素类多种半合成抗菌素原 料药及制剂，华北制药信达有限公司于 1999 年 1 月 18 日全面投产，使华药的半 合成抗生素总生产能力达到 1200t/a，成为我国目前最大、也是亚洲最大的半合 成抗生素生产基地，其生产规模及技术水平都达到世界先进水平，现在华北制药 集团的 7－ADCA 生产能力达到 225t/a。“九五”期间鲁抗集团投入技改、基建 资金达 12.5 亿元，贯通了青霉素—→6-APA——→半合青——→制剂；青霉素 ——→7－ADCA－一→半合成头孢——→制剂及头孢菌素 C——→7－ACA——→ 头孢唑啉酸——→头孢唑啉钠（头孢哌酮）——→制剂等三条完整的生产链，1999 年底鲁抗医药 140 t／a 7－ ADCA 工程建成投产，成为国内 7－AnA 生产能力较 大的厂家之一。
青霉素酰化酶提取技术研究
青霉素酰化酶提取技术研究摘要：青霉素酰化酶的催化效率高，具有很强的底物专一性，但是作为胞内酶，需要破壁后释放后才能发挥作用。
本研究采用超声破壁技术处理青霉素酰化酶粗酶液，通过单因素实验考察酶液比、超声时间、超声功率对细胞破壁率的影响情况。
实验结果显示酶液比对破壁效果影响最大，超声时间次之，超声功率的影响最小；超声最佳的处理参数为：酶液比为1:200，超声时间为10 min，超声功率为500W，得到超声处理的最大破壁率为78.2%。
本研究为青霉素酰化酶的提取提供了新的技术参数和理论指导，具有工业化价值。
关键词：青霉素酰化酶；提取；破壁；超声波1950年，日本的科学家第一次在产黄青霉Q176中发现了青霉素酰化酶（PA）[1]。
随后研究者发现自然界中的放线菌、细菌、真菌都能合成青霉素酰化酶[2]。
青霉素酰化酶具有重要的应用价值，是一种工具酶，广泛地应用于催化D-氨基酸类似物和β-内酰胺母核酶法合成新型的半合成β-内酰胺类抗生素，而且能逆向催化青霉素水解，生产β-内酰胺类抗生素中间体7-氨基-3-脱乙酸酰氧基头孢烷酸(7-ADCA)和6一氨基头孢烷酸(6-ACA)，同时在手性药物的拆分和多肽合成等方面也有不错的表现[3]。
发酵液中不仅含有游离酶，还有大量的色素、无机盐、杂蛋白等杂质，这就需要对发酵液进行分离纯化，再使细胞内酶释放，从而得到比活好、纯度高的青霉素酞化酶[5]。
青霉素酰化酶的催化效率高，具有很强的底物专一性[4]。
但是，由于青霉素酰化酶属于胞内表达酶，需要将酶从细胞内释放后细胞外发挥作用，这就需要破碎细胞或者改变细胞壁的通透性[6]。
细胞破壁技术包括机械破壁法和非机械破壁法。
其中机械破壁法的主要方式是高压均质器法和超声波破壁法[7]。
而非机械破壁法的典型方式则是冻融破壁法和溶酶菌法。
高压均质法容易操作，但是能源消耗过高，不利于工业化生产[8]。
冻融破壁法条件温和，但是耗时长。
溶酶菌法则是成本过高无法实现大生产[9]。
青霉素酰化酶的分离纯化
双功能膜纯化和固定PGA
Chih-I Chen等通过实验，将吸附于固定 化Cu2+亲和膜的青霉素酰化酶与膜表面 物质共价结合，制备成固定化酶
工艺流程
PGA
18℃ 12h
EDTA
pH 10.0, 18℃,76h
青霉素酰化酶； Cu2+；
配位键；
共价键
原初膜与固定化酶后的膜表面电镜结构
结果
离子交换膜色谱
离子交换膜色谱：离子交换膜色谱主要是利用 膜介质表面的离子交换基团与目标蛋白之间的 离子交换作用进行分离的根据离子交换基团的 性质，可分为强阳离子型、弱阳离子型、强阴 离子型、弱阴离子型。
离子交换膜色谱的特点
操作条件较温和
使用寿命长 选择性差
离子交换膜色谱分离青霉素酰化酶
青霉素酰化酶的分离纯化
青霉素
青霉素是常见抗生素之一。来源于点青霉、产 黄青霉等真菌。对革兰氏阳性菌的生长有抑制 作用
青霉素
青ห้องสมุดไป่ตู้素的分类
青霉素的代谢途径
α-氨基己二酸 半胱氨酸 缬氨酸
ACVS α-氨基己二酰半胱氨酰缬氨酸 IPNS
异青霉素N
AT 青霉素
AT是一系列不同的酶。不同的AT催化不同的酰 基转移反应生成不同的青霉素 添加苯乙酸相应的AT催化它与异青霉素N反应 生成青霉素G 添加苯氧乙酸时，相应的AT催化它与异青霉素 N反应生成青霉素V
固定化
分离纯化
传统的分离纯化方法
硫酸铵沉降
葡聚糖凝胶色谱 离子交换色谱 电泳
据我们组阅读的文献，传统方法分离青霉素酰 化酶的回收率大部分在30%至50% 有必要开发新型提纯工艺
青霉素酰化酶的固定化与应用新进展
作者：周成王安明王华杜志强祝社民杨明张俊沈树宝【摘要】青霉素酰化酶被广泛应用于半合成抗生素及中间体的制备、手性药物的拆分和多肽合成等方面。
高效固定青霉素酰化酶能提高酶对温度、ph值、溶剂极性等方面的适用性和反复使用的稳定性，将成为拓宽青霉素酰化酶在工业中应用的必然选择和关键。
本文主要介绍了青霉素酰化酶固定化技术的进展，讨论了不同固定化技术的特点和固定化酶在非水相体系中的催化作用，并展望了固定化青霉素酰化酶的发展前景。
【关键词】青霉素酰化酶；载体；固定化；反应介质；固定化酶的应用1 固定化的载体有效固定是固定化青霉素酰化酶的核心技术，载体的材料选择与制备是技术的关键。
性能优越的载体能提高固定化酶的催化性能，降低酶法生产成本。
1.1 有机高分子载体有机载体具有较好的机械强度且已产业化。
天然有机高分子载体无毒性、传质性能好，常用甲壳素和壳聚糖［2］。
合成的有机高分子强度大，但传质较差，如聚乙烯醇［3］和聚丙烯酰胺［4］等。
mateo等［5］选用ep sepabeads类高密度环氧结构的载体固定青霉素酰化酶，过程如图1所示。
pasini等［6］研究eupergit c载体固定化酶，催化活力较游离酶明显增加，重复使用稳定性好。
1.2 无机分子载体随着材料学的迅速发展，出现了具有多维孔道结构介孔分子筛的载体，可制备高活性高稳定性的固定化酶。
何静等［7］报道的介孔分子筛mcm 41具有高比表面积、较小扩散阻力的特点，可吸附固定，也可利用载体表面醛基与酶蛋白的氨基相互反应共价连接。
roger等［8］实验表明mcm 41载体的孔径(3～3.5nm)明显小于青霉素酰化酶尺寸(7nm×5nm×5nm)，载体可大部分与酶以吸附形式固定。
roger等研究了硅载体通过交联剂与酶共价固定的过程，如图2所示。
此硅载体孔径较大，固定化酶的干酶活力达110bpug-1，活力回收80%，热稳定性明显优于eupergit c固定化酶。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
四、青霉素酰化酶的应用
• • • • 1、在半合成抗生素中间体制备中的应用 2、在半合成β 内酰胺抗生素合成中的应用 3、在外消旋混合物的拆分中的应用 4、在肽合成中的应用
1、在半合成抗生素中间体制备中的 应用
• 半合成抗生素是通过酶法或化学法修饰原 抗生素的结构,改进天然抗生素的性能,包括 克服耐药性、增强抗菌活性、降低药物的 毒副作用、扩展抗菌谱、提高稳定性等。 青霉素酰化酶可以催化水解反应制备半合 成抗生素中间体6 APA 和7 ACA。青霉素 酰化酶催化的水解法不但克服了早期的化 学转化法的缺点, 而且能够得到高产量的 6APA 和7 ACA。
3、在外消旋混合物的拆分中的应 用
• 手性化合物的外消旋混合物,包括氨基酸、β 氨基酸酯、胺及仲醇等。青霉素酰化酶对 苯乙酰胺基团有立体选择性。可用于胺和 醇的拆分。青霉素酰化酶催化拆分得到的 单一对映体可用作合成生物活性化合物的青霉素酰化酶作为一种生物催化剂可以催化多种 反应,如作为高效的生物催化剂催化直接的酶合成 反应和酰基转移反应,对氨基酸的氨基进行保护和 去保护。这一方法已经应用于肽及其衍生物的合 成过程中。来自于E. coli 的青霉素G 酰化酶可用 于催化合成天冬氨酰苯丙氨酸的甲基酯,该产品可 用作食品的甜味剂。这种酶也可用于制备D苯基 二肽, D 苯基二肽的酯可以通过闭环反应制备相应 的环缩二氨酸。环缩二氨酸的用途非常广泛,可用 作食品添加剂、壳多糖酶抑制剂等。
• 随着青霉素酰化酶的应用日益广泛,该酶的 固定化技术也取得了突破性进展。青霉素 酰化酶催化水解反应制备6 APA 可以采用 固定化细胞固定化酶2 种形式。固定化方法 包括吸附、包埋、微胶囊化、离子交换、 交联、共价连接等。例如,青霉素酰化酶可 与DEAE 葡聚糖凝胶结合形成固定化酶、 吸附在硅藻土铝盐载体上制成固定化酶。
青霉素酰化酶的生产与应 用
一、青霉素酰化酶简介
• 青霉素酰化酶(青霉素酰基转移酶) 是一类催 化断裂青霉素酰基侧链产生6 氨基青霉烷酸 ( 6APA) 和相应的有机酸的酶。根据底物特 异性的不同,青霉素酰化酶可分为3 种类型: 第一类由细菌产生,适合于水解青霉素G,大 多为体内酶;第二类由放线菌、真菌产生,适 合于水解青霉素V ,几乎均为体外酶;第三类 由假单孢菌产生,适合于水解氨苄青霉素。
二、青霉素酰化酶的生产
• 青霉素酰化酶既是胞内酶又是胞外酶,可以 通过产酶微生物的营养控制代谢及基因型 改变,进行大规模的生产。大规模生产青霉 素酰化酶的菌种有细菌、巨大芽孢杆菌、 大肠杆菌、游动放线菌属、酵母菌及淡紫 灰链霉菌等。报道最多的是关于埃希氏菌 属大肠杆菌发酵生产青霉素G 酰化酶。
三、青霉素酰化酶的固定化
五、前景展望
• 青霉素酰化酶具有广泛的市场应用前景,青霉素酰 化酶已有效地应用于半合成β 内酰胺抗生素的生 产、肽的合成和外消旋混合物的拆分中。随着酶 技术的不断发展,青霉素酰化酶在固定化技术、非 水相介质酶催化技术及定点突变技术等方面取得 了一定的发展,而且研究者不断采用基因工程方法 筛选产青霉素酰化酶的高产优质菌株。青霉素酰 化酶在基因工程和酶工程方面的不断发展,将使其 在医药、食品、中间体合成等领域的应用逐步扩 大。
2、在半合成β 内酰胺抗生素合成中 的应用
• 青霉素酰化酶催化水解反应得到中间体 6APA 和7 ACA 后,下一步可以生产半合成 青霉素和头孢菌素。具体的是利用青霉素 酰化酶催化酰基侧链和β 内酰胺核的缩合反 应，反应过程中青霉素酰化酶同样具有水 解活性,通过固定生物催化剂,选择适宜的溶 剂,调节反应条件,提供高浓度的活化侧链供 体及β 内酰胺核等一系列条件可以减少水解 反应。