免疫组化的注意事项操作要点和技巧
免疫组化原理步骤及要注意的事项
免疫组化原理步骤及要注意的事项免疫组化是一种常用的细胞和组织学检测方法，通过利用免疫学原理，使用特异性抗体对目标分子进行检测，主要应用于分析蛋白质分子的表达，可以帮助研究者了解不同细胞和组织中蛋白质的分布和功能，对于疾病的诊断和治疗也具有重要意义。
下面将介绍免疫组化的原理、步骤及要注意的事项。
原理：免疫组化是利用特异性抗体与抗原发生特异性反应的原理来进行的。
主要包括两种反应：免疫定位反应和信号测定反应。
-免疫定位反应：通过组织抗原表面与抗体的结合，将目标分子定位于细胞或组织的特定位置。
-信号测定反应：将已定位的抗原-抗体复合物进行颜色或荧光标记，发出可见信号，用于检测和记录。
步骤：免疫组化的主要步骤包括标本制备、抗原修复、非特异性反应阻断、一抗染色、二抗染色和显微镜观察。
1.标本制备：选择合适的组织样本，常用的样本有组织切片、细胞涂片和细胞悬液。
样本制备主要包括取材、固定、包埋等步骤，其中固定是关键步骤，常用的固定剂有福尔马林、乙酸乙酯和交联剂等。
2.抗原修复：组织样本在固定过程中往往会导致抗原的空间结构改变和蛋白质交联，使其成为免疫组化的目标结构。
为了恢复抗原的免疫反应性，常常需要进行抗原修复，包括酶解法、消化法、热解法等。
3.非特异性反应阻断：为了减少非特异性结合，需要采取一些措施来阻断非特异性背景信号。
常用的方法包括用蛋白质阻断剂进行封闭、用牛血清白蛋白或BSA预处理等。
4.一抗染色：在经过上述步骤之后，用特异性抗体与目标抗原结合，构成抗原-抗体复合物。
为了增强抗原-抗体的结合力，常采用多种放大手段，如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或二级抗体等。
5.二抗染色：一抗与抗原结合后，用特异性二级抗体进行检测，二级抗体上带有标记物（如荧光素、酶等），对抗原-抗体复合物进行定位。
6.显微镜观察：通过显微镜观察，检测特定信号的强度和位置，同时进行结果的记录和分析。
注意事项：-选择合适的抗体：免疫组化的关键在于合适的抗体选择，需要选择高度特异性和高亲和力的抗体。
免疫组化检查要注意点什么
免疫组化检查要注意点什么免疫组化检查是一种常见的临床化验技术，主要用于检测体内免疫系统的功能和免疫相关疾病的发生及发展情况。
免疫组化检查的主要原理是利用抗原与抗体的特异性结合来检测样本中的分子，以达到诊断和评估疾病的目的。
在进行免疫组化检查时，有一些注意事项需要关注。
首先，样本采集和保存非常重要。
样本采集的质量直接影响到后续检测结果的准确性。
对于不同的免疫组化检测项目，样本的要求也不尽相同。
比如，某些检测要求新鲜样本，不能冷冻，而另一些则需要冷冻保存。
因此，在采集样本前，需要了解具体检测项目的要求，并按照要求进行适当的处理和保存。
其次，在进行免疫组化检查时，需要正确选择和识别抗原与抗体。
不同的免疫组化检测方法所用到的抗原和抗体可能存在差异，因此，在进行检测前需要准确选择所需的试剂和抗体。
同时，为了保证检测结果的准确性和可靠性，必须进行负对照和阳性对照的设定。
负对照用于排除假阳性结果的干扰，阳性对照用于确认试剂和仪器的灵敏度和准确性。
第三，免疫组化检查中的标本制备和处理也非常重要。
对于不同类型的标本，如血液、组织、细胞等，其制备和处理方法也各有不同。
在制备标本时，要注意避免样本的污染和破坏，同时要保证标本中目标分子的完整性。
常见的标本处理方法包括切片、固定、脱水、染色等，这些步骤的操作必须严格按照标准操作程序进行，以保证结果的可靠性。
此外，免疫组化检查中的实验条件控制也非常重要。
例如，温度、湿度、阴离子或阳离子含量、光照等因素都可能对结果产生影响。
因此，在进行检测时，需要严格控制这些条件，并在合适的环境中进行实验操作。
最后，对于检测结果的解读也需要谨慎。
免疫组化检查并不是绝对的诊断依据，而仅仅是一种辅助诊断方法。
结果的解读需要结合病史、临床表现和其他辅助检查结果来进行，必须进行全面综合分析。
总之，免疫组化检查作为一种重要的实验室技术，对于诊断和评估免疫相关疾病具有重要的意义。
在进行检测时，需要关注样本的采集和保存、正确选择和识别抗原与抗体、标本的制备和处理、实验条件的控制以及检测结果的解读等方面的注意事项。
免疫组化的原理及操作规程
免疫组化的原理及操作规程免疫组化，即免疫组织化学染色技术，是一种利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（如荧光素、酶、金属离子、同位素等）显色，从而确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质）的定位、定性及相对定量的研究方法。
该技术广泛应用于临床病理诊断、生物医学研究以及药物开发等领域。
本文将详细介绍免疫组化的原理及操作规程。
一、免疫组化的原理免疫组化的基本原理是抗原与抗体的特异性结合。
抗原是指能够刺激机体产生免疫应答，并能与免疫应答产物（抗体或致敏淋巴细胞）发生特异性结合的物质。
抗体是机体的免疫细胞在抗原刺激下产生的具有特异性识别能力的免疫球蛋白。
在免疫组化中，通常将目标抗原（如某种蛋白质或多肽）作为待检测物，通过特定的抗体与之结合，再利用标记技术使抗体可视化，从而实现对目标抗原的定位、定性和定量研究。
免疫组化的标记技术主要有直接法和间接法两种。
直接法是将标记物（如荧光素、酶等）直接标记在抗体上，使其与目标抗原结合后直接显色。
间接法则是利用未标记的抗体（一抗）先与目标抗原结合，然后再通过标记的二抗（与一抗特异性结合的抗体）与一抗结合，最终实现显色。
间接法具有更高的灵敏度和灵活性，因此在实际应用中更为常见。
二、免疫组化的操作规程免疫组化的操作规程主要包括以下几个步骤：1. 标本处理：根据实验需求选择合适的组织标本，并进行固定、脱水、包埋等处理，制备成组织切片或细胞涂片。
固定是为了保持组织或细胞的形态结构，防止抗原丢失；脱水则是为了去除组织中的水分，便于后续操作；包埋则是将组织块包裹在支持物（如石蜡）中，便于切片。
2. 抗原修复：由于固定和脱水等处理过程可能导致抗原表位的遮蔽或改变，因此在进行免疫组化染色前，需要对抗原进行修复。
常用的修复方法包括热修复、酶修复和酸修复等。
具体方法应根据实验需求和抗原性质进行选择。
3. 阻断内源性酶活性：为了避免组织内源性酶对后续显色反应的干扰，需要使用相应的阻断剂（如过氧化氢）对内源性酶活性进行阻断。
简述免疫组化实验流程及注意事项
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免疫组化注意事项
(四) 注意事项1. 正式试验时，应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件，待检样品应作一式二份，以保证实验结果的准确性。
有时本底较高，说明有非特异性反应，可采用羊血清、兔血清或B SA等封闭。
2. 在ELISA中，进行各项实验条件的选择是很重要的，其中包括:(1) 固相载体的选择：许多物质可作为固相载体，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。
其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。
目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。
不管何种载体，在使用前均可进行筛选：用等量抗原包被，在同一实验条件下进行反应，观察其显色反应是否均一性，据此判明其吸附性能是否良好。
（2) 包被抗体(或抗原)的选择：将抗体(或抗原)吸附在固相载体表面时，要求纯度要好,吸附时一般要求PH在9.0～9.6之间。
吸附温度，时间及其蛋白量也有一定影响,一般多采用4℃18～24小时。
蛋白质包被的最适浓度需进行滴定：即用不同的蛋白质浓度(0.1、1.0和10μg／ml等)进行包被后，在其它试验条件相同时，观察阳性标本的OD值。
选择OD值最大而蛋白量最少的浓度。
对于多数蛋白质来说通常为1～10μg／ml。
(3) 酶标记抗体工作浓度的选择：首先用直接ELISA法进行初步效价的滴定(见酶标记抗体部份)。
然后再固定其它条件或采取“方阵法”(包被物、待检样品的参考品及酶标记抗体分别为不同的稀释度)在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。
(4) 酶的底物及供氢体的选择：对供氢体的选择要求是价廉、安全、有明显地显色反应，而本身无色。
有些供氢体(如OPD等)有潜在的致癌作用，应注意防护。
有条件者应使用不致癌、灵敏度高的供氢体，如TMB和ABTS是目前较为满意的供氢体。
底物作用一段时间后，应加入强酸或强碱以终止反应。
通常底物作用时间，以10-30分钟为宜。
底物使用液必须新鲜配制，尤其是H2O2在临用前加入。
常见问题处理：免疫组化常见问题的处理当免疫组化染色没有出现预期结果时，应系统地查找原因，而每一次只能排除一种可能的原因。
免疫组化拍片注意事项
1、
同一组织同一指标下不用分组要一次性拍完。
步骤
1、参数调整：
开机，放片子，细准焦螺旋。
选择合适的倍数（需要告诉我）
手动白平衡，找到合适的曝光时间（同一组织同一指标需要固定）方法：自动--手动
2、拍照
一张片子里面就是一个组，一个片子里面有多个组织，一般一个组织对应一只大鼠。
每个组织能多拍几张就多拍几张（细胞可以尽量多一点），拍照的位置不要有选择性，从头到尾拍完就可以。
可以拍一个低倍镜下的拍片，作为参考根据轮廓拍全所有组织，命名需要命名为相应倍数，如20*
要拍齐每一个组织
3、保存
保存前，拍一下下拉菜单，发给我，或命名为下拉菜单放在u盘里面。
保存的时候，一个组织的第一张拍片保存命名为1-1，同一个组织后面的拍片后面的可以不要命名
下一个组织第一个拍片保存为2-1类推。
免疫组化实验安全操作及保养规程
免疫组化实验安全操作及保养规程免疫组化实验是一种常见的生物实验方法，适用于研究细胞、组织和生物分子中的蛋白质、抗原、受体等成分。
由于实验过程中使用的试剂和仪器具有一定危险性，因此必须遵守严格的操作规程，保证实验过程的安全性。
实验前的准备工作在进行免疫组化实验之前，需要对操作环境和实验材料进行准备工作，以保证实验结果的可靠性和安全性。
1. 操作环境准备实验操作室应该保持干净、整洁，照明充足，通风良好，避免有光、霉、水等因素影响实验。
实验室的桌面、器皿、设备和工具等应当进行彻底清洁和消毒，以避免杂质和污染对实验结果的影响。
2. 实验材料准备实验中需要使用的试剂、仪器和材料等应当选择高质量、纯度高、新鲜的。
对于已经开启的试剂或精制纯化的试剂，需要进行贴标签、标注到访日期及有效期等细节行政工作，并存储在恰当的环境中。
对于易燃、危险、腐蚀性等试剂，应当按照标签上的提示来使用和储存。
实验操作规程1. 实验前的准备工作在进行实验的过程中，需要进行一些准备工作，以确保实验操作的安全性和效果。
1.1 确认工作计划。
在进行实验之前，需要准确确认各项工作任务及操作步骤，制定完备的计划；1.2 了解操作材料。
事先应该对实验所用材料进行充分的了解，确认试剂品牌、浓度、储存条件等；1.3 安全措施准备。
事先做好实验操作中可能出现的事故应急预案，并准备好包括防护手套、防护面罩、实验室长袍、安全鞋等安全防护设备；1.4 操作台面准备。
在操作过程中，准备好所需的实验器皿（包括台盘、离心管等）、显微镜镜片、吸管等等。
2. 操作注意事项在进行免疫组化实验过程中，需要注意如下事项：2.1 严格保持操作技能的标准. 实验人员应当具备一定的实验操作技能，并开展专业工作前进行技能测评；2.2 实验室的基本卫生防护：实验人员每日早晚必须进行体温检测，佩戴口罩，严格按照个人防护要求操作。
实验器材的消毒和洗涤。
对于特殊实验室要求的实验操作，需要进行进一步的防护措施；2.3 操作前的试剂准备. 在进行实验之前，需要先将需要使用的试剂进行准备、调配、稀释等操作，并严格遵守生物实验室规定的标准操作；2.4 仪器的维护。
免疫组化操作规程及操作流程
免疫组化操作规程及操作流程免疫组化操作规程一、实验原理与意义免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。
它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。
二、实验器材微波炉、吹风机、组化笔、湿盒、烤箱、振荡器、染缸、光学显微镜、纯木浆卫生纸、计时器和通风橱等。
三、试剂配制1. 0.01 M PBS(pH 7.34 )：9.0 g NaCl + 50 ml 0.2 M PB 加双蒸水至1000 ml；1000 ml0.2M PB (pH 7.4)＝5.93 g NaH 2 PO 4 ·2H 2 O＋58.02 g Na 2 HPO 4 ·12H 2 O in 1000 ml 双蒸水或＝190 ml A + 810 ml B（A. 0.2 M NaH 2 PO 4 ·2H 2 O：15.6 g in 500 ml ddH 2 O；B. 0.2M Na 2 HPO 4 ·12H 2 O：71.632 g in 1000 ml dH 2 O）。
2. Citrate Buffered Saline（0.01 M 柠檬酸缓冲液，PH6.0）：28 ml A + 72 ml B + 200 ml ddH 2 O（A.Citrate acid（柠檬酸）：10.5 g 加双蒸水至1000 ml；B.Citrate sodium（柠檬酸钠）：29.41g 加双蒸水至1000 ml）。
3. 细胞通透液：由终浓度分别为0.3%双氧水和0.3%Triton X-100混合而成。
配制方法是先用微波加热的36 ml PBS，再接着加120 ul TritonX-100，并加热一会儿，冷却至临用前加0.4 ml 30％H 2 O 2 。
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免疫组化的注意事项、操作要点和技巧
一些教训：
1、对于多甲灌注固定的标本，如要长期保存，要先脱水后冻存，此法对于采用漂片法IHC 较适合。
正确操作：多甲灌注固定——多甲或甲醛后固定——蔗糖梯度脱水——负70度保存——冰冻切片
错误操作：多甲灌注固定——多甲或甲醛后固定——负70度保存——蔗糖梯度脱水——冰冻切片，结果是会有大量冰晶形成。
2、如果能确认使用石蜡切片并使用贴片法进行下一步IHC，多甲或甲醛后固定后应尽快脱水并石蜡包埋。
要点和操作技巧：
1.固定：最好用4%的多聚甲醛固定液。
对于冰冻切片，甲醛固定有时比冰冻丙酮好；但对于不同的组织和抗原，可选用不同的固定液。
有时候商品化的抗体会有比较适合而推荐的固定液，请于购置前注意说明书。
Bouin S固定液：饱和苦味酸750ml，甲醛250ml，冰醋酸50ml，其对组织的穿透力较强，固定较好，结构完整，但因偏酸，对抗原有一定损害，且组织收缩明显，不适于组织标本的长期保存。
PLP液：即高碘酸钠-赖氨酸-多聚甲醛，适于固定石蜡切片。
适于富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。
2．组织脱水，透明：时间不能太长，否则在切片时容易碎片，切不完整。
3．切片时展片：有些组织在切片后难以在水中展开，这时可适当地在水中加入几滴乙醇。
4．烤片：60℃ 30分钟或37℃过夜，温度太高或时间太长，抗原容易丢失。
5．蜡块及切片的保存：最好在4℃保存
6．脱片问题：Poly-L-Lysine(多聚赖氨酸)为目前免疫组化染色工作中最常用的一种防脱片剂，6ml的多聚赖氨酸溶液可按1:10稀释成60ml的工作液，适合于需要酶消化、微波、高温高压的防脱片处理。
如不行，可用双重处理（APES和Poly-L-Lysine）的切片。
在以上两种条件都行不通的情况下，可用如下方法：切片在脱蜡前，放在APES 1：50 丙酮溶液中浸泡3分钟，晾干，即可进行下一步。
7．灭活内源性酶：HRP系统：3%双氧水灭活；AP系统：3%HAc灭活。
8．暴露抗原：对于石蜡切片的免疫组化实验时，必须采用高温加热抗原修复，这将有助于暴露抗原决定簇，从而增加免疫组化染色的强度(不同抗体的最佳修复液请参阅抗体说明书)。
对于不同的组织，不同的抗原，不同的抗体，所采用的方法应不一样，可进行热修复、胰酶消化、既不修复也不消化。
胶原还可以用胃蛋白酶消化等。
9．封闭：在山羊血清封闭，非特异性染色仍然较强时，可延长封闭时间或用浓缩血清封闭10．抗体稀释：应遵循“现用现配”的原则，对于PBS稀释的抗体一定要当天使用。
11．背景高：在抗体浓度、反应时间、反应温度等合适的条件下，如果背景依旧高，可采用含1‰ Tween20的PBS洗，特别是在显色之前要多洗。
12．返蓝：在苏木素复染后，可用碱性缓冲液（如PBS）或Na2HPO4的饱和溶液返蓝。
13．显色：一定要在显微镜下观察，注意控制背景。