免疫组化操作注意事项
免疫组化原理、步骤及要注意的事项
免疫组化原理、步骤及要注意的事项免疫组化一，免疫组织化学简介免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应炕原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。
它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。
二，免疫组化技术的基本原理免疫组化技术是一种综合定性、定位和定量；形态、机能和代谢密切结合为一体的研究和检测技术。
在原位检测出病原的同时，还能观察到组织病变与该病原的关系，确认受染细胞类型，从而有助于了解疾病的发病机理和病理过程。
免疫酶组化技术是通过共价键将酶连接在抗体上，制成酶标抗体，再借酶对底物的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，于普通显微镜或电镜下进行细胞表面及细胞内各种抗原成分的定位，根据酶标记的部位可将其分为直接法（一步法）、间接法（二步法）、桥联法（多步法）等，用于标记的抗体可以是用免疫动物制备的多克隆抗体或特异性单克隆抗体，最好是特异性强的高效价的单克隆抗体。
直接法是将酶直接标记在第一抗体上，间接法是将酶标记在第二抗体上，检测组织细胞内的特定抗原物质。
目前通常选用免疫酶组化间接染色法。
三，免疫组化步骤1，切片，烤片60℃，1h；2，脱蜡及复水二甲苯10min，100％乙醇5min，95％乙醇5min，90％乙醇5min，85％乙醇5min，80％乙醇5min，75％乙醇5min，60％乙醇5min，50％乙醇5min，30％乙醇5min，自来水1min，双氧水1min；3，1份30％H2O2加10份蒸馏水，室温10min，蒸馏水洗3次，每次3min；4，微波修复将切片浸入0.01M枸橼酸缓冲液，微波中最大火力（98℃-100℃）加热至沸腾，冷却（约5-10min），反复两次；5，将切片自然冷却至室温，PBS洗涤3次，每次5min；6，封闭，5％BSA，室温20min，甩去多余液体；7，滴加一抗，37℃，1h，或者4℃过夜；8，PBS洗涤3次，每次3min；9，滴加二抗，37℃，15-30min；10，PBS洗涤3次，每次3min；11，滴加SABC，37℃， 30min；12，PBS洗涤3次，每次5min；13，1ml蒸馏水中分别滴加显色剂，混匀；14，DAB显色剂配置好后，滴加于切片，室温，镜下检测反应时间（约5min）；15，自来水冲洗干净，过蒸馏水；16，苏木素复染2min，自来水冲洗；17，脱水30％乙醇3min，50％乙醇3min，70％乙醇3min，80％乙醇3min，90％乙醇3min，95％乙醇3min，100％乙醇3min，二甲苯20min；18，树胶封片，镜检。
免疫组化的染色操作的质控管理
1、 标本固定
固定液为 4%中性缓冲甲醛( 10 ml 甲醛 +90 ml PBS 缓冲液) 。要求离体后及时固定，固定液的量为标本体积的5 ～ 10 倍。固定不当，固定时间不够或过长，都可引起抗原丧失，尤其是一些较脆弱的膜抗原( 如 CD20 等) ，故固定应及时并充分。取材后小标本固定时间应 ＞ 6 h，肿瘤标本最好 ＞ 24 h。
复染是为了衬托免疫组化的阳性染色，所以苏木精颜色不宜太深，同时由于操作中使用了吸附玻片，所以建议复染的苏木精应勤于过滤，减少人为的背景染色。
8、 染色中的Biblioteka 些细节在整个染色过程中，切片始终保持湿润，不能干片。滴加一抗时应将切片上的水甩干，以免抗体被稀释。滴加抗体时要确保覆盖全部组织，以免边缘未覆盖到抗体，引起边缘效应。同时孵育盒要放平，以免抗体流至组织一端，造成假阴性或局部弱阳性结果。
6、 显色
如果发现配制好的 DAB 显色液中出现棕色沉淀那么此显色液可能失效，建议重新配制。在显色时，一般阳性局部广泛或阳性定位在胞质的组织，显色非常迅速，1 ～ 3 min 即可见明显的棕色，应及时终止显色。阳性局部稀少且定位在胞核的组织，那么需要显微镜下观察，时间不宜过长以免造成背景染色。
7、 复染
综上所述，质控工作总是发生在实验检测前才能生效。
如标本制作前的处理固定以及制作中的质控流程和切片质量对免疫组化的染色效果，都是相互影响、相互依存的。在免疫组化操作过程中，有许多至关重要的步骤，都是一环扣一环，每走一步都要进行有效监控，才能做出高质量的切片。因此要求操作人员有高度的责任心，严格遵循操作标准，为病理诊断提供表达准确、染色清晰的高质量的免疫组化染色。
免疫组化流程
免疫组化流程免疫组化是一种利用抗体与特定抗原结合的技术，用于检测细胞或组织中特定分子的存在和分布。
其流程包括标本制备、脱脂、抗原修复、抗体处理、染色和显微镜观察等步骤。
本文将以免疫组化的流程为主线，介绍各个步骤的具体操作方法和注意事项。
第一步是标本制备。
要制备免疫组化的标本，可以使用细胞悬液、细胞刮片、冰冻切片或石蜡切片等。
标本制备的关键是保持细胞和组织的完整性和形态。
对于固定的细胞和组织，需要将其处理成适合免疫组化的形式，例如通过冰冻切片或石蜡切片的方法。
第二步是脱脂。
脱脂是将细胞或组织中的脂肪和非脂肪物质去除的过程，以便更好地显示目标分子的分布。
通常可以使用乙醇、醚或甲醇等有机溶剂进行脱脂处理。
需要注意的是，脱脂时间不宜过长，否则可能导致抗原失活。
第三步是抗原修复。
抗原修复是为了使被固定的细胞或组织中的抗原恢复或暴露出来，以便与相应的抗体结合。
常用的抗原修复方法包括煮沸法、酶解法和酸碱解法等。
不同的抗原修复方法适用于不同的标本类型和抗原性质。
第四步是抗体处理。
在免疫组化中，需要使用一种与目标分子特异性结合的抗体。
通常可以使用一抗和二抗的结合用于检测。
一抗是与目标分子特异性结合的主抗体，而二抗则与一抗结合，用于产生荧光或酶标信号。
在抗体处理过程中，需要进行固定、洗涤和孵育等步骤。
第五步是染色。
染色是将经过抗体处理的样本显色或标记的过程，以便更好地观察目标分子的分布。
染色的方法可以根据需要选择，常用的有免疫荧光染色、酶标染色和银染等。
在染色过程中，需要根据实验要求和标本特点进行适当的控制，以获得准确的染色结果。
最后一步是显微镜观察。
经过以上的操作，样本已经准备好进行显微镜观察和分析。
观察时需要注意光线的调节和对焦的正确，以获得清晰和准确的图像。
同时，还需要根据实验要求和预定的结果指标进行分析和解读。
总结起来，免疫组化的流程包括标本制备、脱脂、抗原修复、抗体处理、染色和显微镜观察等步骤。
每个步骤都需要精确控制和注意细节，以确保实验结果的准确性和可靠性。
免疫组化的标准化和质量控制
免疫组化的标准化和质量控制免疫组化是一项综合性的操作技术，是病理诊断的主要辅助手段之一，其影响因素复杂，包括技术人员是否熟练掌握整个实验的操作程序，抗体的特异性，检测方法的敏感性,组织的固定，抗原的修复及修复液的PH值等众多因素。
步骤较多,且环环相扣,加强质量管理和可信性尤为重要。
现就我科近年来免疫组化染色和具体操作过程中进行精细而有效的全程质控，具体操作规程和质控事项综述如下：一、标本的固定：标本的及时固定是最重要的环节,也是不可逆的，我科要求手术室设立专人专管制度,普通标本离体后要求手术室及时固定，特殊标本离体后及时送我科当天由取材医师及时剖开固定，淋巴结切开固定，乳腺标本每隔一厘米切开固定，胃肠标本剖开固定，首选10%的中性缓冲福尔马林固定液固定，由于中性缓冲福尔马林液渗透力强，组织收缩小，能够使大多数抗原物质保存较好,提高免疫组织化学检测的阳性率。
固定液的量一般为组织块体积的5—10倍，小标本固定时间为4-6小时，大标本固定时间为18-24小时，固定后水洗10—20分,利用蜡块内抗原的长期保存.二、脱水：我科在脱水程序中设置一个后固定步骤,弥补病理标本取材时固定不良造成的组织形态缺陷和抗原定位不良现象。
同时建立以处理组织标本块数2000块为标准的组织脱水试剂规范化更换制度，保证脱水质量是保证组织切片质量的前题，这一点对免疫组化染色尤为重要.三、切片、烤片、脱蜡:切片厚度3-4个微米之间，淋巴结更薄些,切片完整，厚薄均匀，无皱褶和刀痕，烤片温度60摄氏度温箱烤片1—2小时，暂不染色的切片放置4摄氏度的冰箱，短时间保存，脱蜡必须干净。
四、选择优质的抗体及检测系统是优秀染片质量的保证，我科每月的组化切片为500左右，一直是手工操作，严格的操作规程非常重要,每一步细化到人，我科一直沿用中杉金桥的工作液试剂盒,效果稳定，参加多次省质控及全国质控都获得合格证书.五、抗原修复：我科一直采用高压修复，用大功率加热至沸腾后，将功率调至中档，再放入切片，加盖，加减压阀继续加热至冒气并维持2分钟后，撤火缓慢冷却。
免疫组化检查要注意点什么
免疫组化检查要注意点什么免疫组化检查是一种常见的临床化验技术，主要用于检测体内免疫系统的功能和免疫相关疾病的发生及发展情况。
免疫组化检查的主要原理是利用抗原与抗体的特异性结合来检测样本中的分子，以达到诊断和评估疾病的目的。
在进行免疫组化检查时，有一些注意事项需要关注。
首先，样本采集和保存非常重要。
样本采集的质量直接影响到后续检测结果的准确性。
对于不同的免疫组化检测项目，样本的要求也不尽相同。
比如，某些检测要求新鲜样本，不能冷冻，而另一些则需要冷冻保存。
因此，在采集样本前，需要了解具体检测项目的要求，并按照要求进行适当的处理和保存。
其次，在进行免疫组化检查时，需要正确选择和识别抗原与抗体。
不同的免疫组化检测方法所用到的抗原和抗体可能存在差异，因此，在进行检测前需要准确选择所需的试剂和抗体。
同时，为了保证检测结果的准确性和可靠性，必须进行负对照和阳性对照的设定。
负对照用于排除假阳性结果的干扰，阳性对照用于确认试剂和仪器的灵敏度和准确性。
第三，免疫组化检查中的标本制备和处理也非常重要。
对于不同类型的标本，如血液、组织、细胞等，其制备和处理方法也各有不同。
在制备标本时，要注意避免样本的污染和破坏，同时要保证标本中目标分子的完整性。
常见的标本处理方法包括切片、固定、脱水、染色等，这些步骤的操作必须严格按照标准操作程序进行，以保证结果的可靠性。
此外，免疫组化检查中的实验条件控制也非常重要。
例如，温度、湿度、阴离子或阳离子含量、光照等因素都可能对结果产生影响。
因此，在进行检测时，需要严格控制这些条件，并在合适的环境中进行实验操作。
最后，对于检测结果的解读也需要谨慎。
免疫组化检查并不是绝对的诊断依据，而仅仅是一种辅助诊断方法。
结果的解读需要结合病史、临床表现和其他辅助检查结果来进行，必须进行全面综合分析。
总之，免疫组化检查作为一种重要的实验室技术，对于诊断和评估免疫相关疾病具有重要的意义。
在进行检测时，需要关注样本的采集和保存、正确选择和识别抗原与抗体、标本的制备和处理、实验条件的控制以及检测结果的解读等方面的注意事项。
免疫组化需要注意事项
免疫组化需注意的问题一、为达到免疫组织化学技术的要求，组织固定越新鲜越好。
为达到免疫组织化学染色的要求，对于离体的组织尽量快的进行固定，有条件的应将其剖开，早取材，早固定。
二、组织脱水必须彻底干净组织块取材不能太大过厚，才能较好地完成脱水的过程。
如果取材太厚，在较短的时间内脱水不完全，将可引起一系列的问题，比如浸蜡不彻底，切片不好完成，切不完整。
由于先天不足，导致后来切片染色的脱落，造成染色的失败，或者由此反复操作，造成人力物力的浪费，造成病理报告的延期发出等。
因此，对取材的要求是除了要求要有艺术性外，即平整、外观好看，还要求适中。
三、切片必须完整、均匀、平展、无邹折应用于免疫组织化学染色的切片，对切片的质量要求较高，切片必须完整，平展、无汽泡，无邹折，这样有利在染色时的冲洗，有利于切片的牢固附贴。
如果切片不平展，免疫组化染色后，可出现染色不均匀的现象，颜色深浅不一，不平。
如果切片有汽泡切片在烘烤时，由于汽泡的破裂影响了汽泡周围的组织，在其周围可观察到深浅不一的染色。
如果切片有邹折，免疫组化染色后，在邹折的地方有深浅不一的颜色，这是一种假阳性，容易引走混淆。
四、切片的附贴必须牢固，必须使用合适的粘贴剂。
免疫组织化学染色前的前期准备工作，就是必须对新的载玻片进行处理，新的载玻片表面看起来很干净，有人认为不需要进行任何的处理，都能够适合使用，这是一种错误的想法。
新出厂的载玻片，表面复盖着开一层油脂样的物质，如果不加以处理，对切片的附贴是极为不利的。
我们的做法是：新的载玻片，放于玻璃清洗液中浸泡4小时甚至过夜，然后取出，经自来水彻底冲洗后，浸入酒精中达2小时以上，取出擦干备用或烘干也可。
然后再将载玻片浸入了－氨基－三乙氧基－硅烷（3－Aminopropyl triethoxy-silane）的稀释液（1：50用丙酮或无水乙醇稀释都可以）中硅化10分钟，后经无水乙醇洗2次，烘干即可使用。
五、切片必须烘烤附贴牢固，既要经得起抗原修复时高温的作用而不使轻易脱片，又不至于破坏抗原。
免疫组化操作规程及操作流程
免疫组化操作规程及操作流程免疫组化技术是一种常用的细胞和组织学研究方法，广泛应用于病理学、生物学、药理学等领域。
下面将详细介绍免疫组化操作规程及操作流程。
一、实验前准备1.准备实验所需的试剂和试验设备，包括抗体、缓冲液、加标物、显色剂等。
2.检查免疫组化试剂的有效期，确保试剂的质量。
二、标本处理1.收集组织标本，如活检样本或动物组织。
2.快速处理标本，迅速取出，并选择适当的处理方法，如固定、包埋等。
3.处理过程中要避免标本的冻融、干燥等。
三、抗原回复1.对于经过固定的组织标本，使用抗原回复方法来恢复组织标本中的抗原活性。
2.选择适当的抗原回复方法，如热处理、酶解等。
四、非特异性结合阻断1.使用非特异性抗血清或蛋白质来阻断非特异性结合位点。
2.使非特异结合抗体活性降低，减少假阳性结果。
五、抗体处理2.优化抗体浓度，确保抗体与标本中的抗原结合。
3.对于特定抗体，可以进行荧光标记或酶标记等。
六、免疫组织染色1.用适当的缓冲液稀释抗体，并将其应用于组织标本上。
2.根据实验需求选择适当的孵育时间和温度。
3.利用显色剂或荧光显像剂对标本进行染色。
七、显微镜观察与分析1.将染色后的标本放置在显微镜下观察，并选择适当的增强荧光信号方法。
2.结合相关的正对照和负对照进行结果分析，确定一些蛋白质在组织中的表达情况。
3.分析结果并记录数据。
八、结果分析与报告1.根据观察结果，分析样本中目标抗原的表达情况。
2.比较不同样本之间的差异，得出结论并撰写实验报告。
九、实验后处理1.清洗使用过的实验工具和材料，避免交叉污染。
2.妥善处理废弃物和化学品，根据实验室内相应的安全操作规范进行处理。
免疫组化实验安全操作及保养规程
免疫组化实验安全操作及保养规程免疫组化实验是一种常见的生物实验方法，适用于研究细胞、组织和生物分子中的蛋白质、抗原、受体等成分。
由于实验过程中使用的试剂和仪器具有一定危险性，因此必须遵守严格的操作规程，保证实验过程的安全性。
实验前的准备工作在进行免疫组化实验之前，需要对操作环境和实验材料进行准备工作，以保证实验结果的可靠性和安全性。
1. 操作环境准备实验操作室应该保持干净、整洁，照明充足，通风良好，避免有光、霉、水等因素影响实验。
实验室的桌面、器皿、设备和工具等应当进行彻底清洁和消毒，以避免杂质和污染对实验结果的影响。
2. 实验材料准备实验中需要使用的试剂、仪器和材料等应当选择高质量、纯度高、新鲜的。
对于已经开启的试剂或精制纯化的试剂，需要进行贴标签、标注到访日期及有效期等细节行政工作，并存储在恰当的环境中。
对于易燃、危险、腐蚀性等试剂，应当按照标签上的提示来使用和储存。
实验操作规程1. 实验前的准备工作在进行实验的过程中，需要进行一些准备工作，以确保实验操作的安全性和效果。
1.1 确认工作计划。
在进行实验之前，需要准确确认各项工作任务及操作步骤，制定完备的计划；1.2 了解操作材料。
事先应该对实验所用材料进行充分的了解，确认试剂品牌、浓度、储存条件等；1.3 安全措施准备。
事先做好实验操作中可能出现的事故应急预案，并准备好包括防护手套、防护面罩、实验室长袍、安全鞋等安全防护设备；1.4 操作台面准备。
在操作过程中，准备好所需的实验器皿（包括台盘、离心管等）、显微镜镜片、吸管等等。
2. 操作注意事项在进行免疫组化实验过程中，需要注意如下事项：2.1 严格保持操作技能的标准. 实验人员应当具备一定的实验操作技能，并开展专业工作前进行技能测评；2.2 实验室的基本卫生防护：实验人员每日早晚必须进行体温检测，佩戴口罩，严格按照个人防护要求操作。
实验器材的消毒和洗涤。
对于特殊实验室要求的实验操作，需要进行进一步的防护措施；2.3 操作前的试剂准备. 在进行实验之前，需要先将需要使用的试剂进行准备、调配、稀释等操作，并严格遵守生物实验室规定的标准操作；2.4 仪器的维护。
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有论文报道，修复时间过长，加重组织切片出现脱片现象。
3、过氧化氢的阻断时间
①3%过氧化氢灭活时间短点，10分钟左右。
②0.3%过氧化氢则可以适当延长封闭时间，一般30分钟。 经过脱色素的切片，在加过氧化氢阻断时，需要观察切片，防止脱片。
4、PBS缓冲液的时间问题
免疫组化操作注意事项
一、组化的基本步骤
1、石蜡切片脱蜡至水（自来水）。 2、蒸馏水洗（浸泡）。 3、根据即用型一抗的具体要求进行分类修复： 一、修复液的种类 ①EDTA(PH8.0/9.0) ②柠檬酸 ③消化酶（胃酶、胰酶...）
④不修复
二、修复方式 ①高温高压修复 ②微波修复
③水浴修复
4、EDTA（PH8.0）高温高压修复，2分钟。 5、3%过氧化氢， 室温孵育 10 分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。 6、PBS 浸泡 2分钟 x3次。（浸泡6分钟） 7、滴加 一抗 即用型工作液，室温孵育3小时或 4 ℃ 过夜。 8、PBS 冲洗，2分钟 x3 次。 9、滴加扩增剂工作液（即用型二抗套装，试剂2，黄色瓶）， 37 ℃ 孵 育 20 分钟。
①新配置的PBS在完全溶解后1小时后再使用，PH值稳定。 ②未使用完的PBS需密时间后，PBS的水分蒸发后，盐分增高。冬季暖 气开放，湿度降低，将增加水分蒸发。注意切片上的PBS不可过少，易干 片，出现薄雾状盐渍。
2、增强剂孵育后的 PBS冲洗时间适当延长为佳，增强剂贴服切片的 能力长，易形成水膜，影响二抗的滴加。 5、一抗的孵育时间 ①温度37℃，孵育1-2小时。 ②温度4℃，恒温过夜。 ③室温（30℃），孵育3小时。（上午11时至下午2时）。 6、二抗的孵育时间 ①试剂2（黄色瓶，增强剂）室温20分钟。 ②试剂3（红色瓶，二抗）室温30分钟。
三、注意事项时间
1、脱蜡时间
基本步骤等同HE染色的脱蜡，时间可适当延长。防止切片带入丁点蜡， 修复液高温会熔化蜡，让蜡浮于修复液液面，提出切片后在切片面形成 肉眼不可见的蜡膜，隔断抗体进入组织。 10、8、3、3、2、1、1
2、修复时间 现行操作步骤：EDTA修复2分钟。
实验项目:Ki-67、P53、ER、PR。
7、DAB的显色时间
DAB指导孵育时间为10分钟。 注意： ①滴加DAB显色液后需要观察切片的显色进程，显色成浓棕色后及时 自来水阻断，防止显色过重，着色点不清。 8、苏木素复染 苏木素复染以淡染为基本原则，切不可过重，放苏木素颜色过重，覆 盖核阳指标抗体（Ki-67）的阳性部位。 新苏木素复染10秒，旧苏木素复染30秒为佳。
10、PBS 冲洗，4分钟 x3 次。 11、滴加 二抗 即用型工作液， 37 ℃ 孵育 30 分钟。 12、PBS 冲洗，2分钟 x3 次。 13、DAB显色剂显色 10分钟（DAB 或 NBT/BCIP）。
14、自来水阻断，苏木素复染，脱水，透明，封片。
二、影响组化结果的条件
一、抗体浓度
二、温度 三、时间