免疫组化方法
免疫组化各步原理
一、免疫组化技术免疫组织化学（Immunohistochemistry"HC）技术是用标记的特异性抗体（或抗原）对组织内抗原（或抗体）的分布进行组织和细胞原位检测技术。
目前，这种技术在临床病理诊断和形态学研究中已得到广泛应用。
Slide 3:（一）、免疫组化常用染色方法和步骤（石蜡切片）SP法（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法）:SP法（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法）原理采用生物素标记的第二抗体与链霉菌抗生物素蛋白连接的过氧化物酶及底物色素混合液来测定细胞和组织中的抗原。
主要步骤:主要步骤1、石蜡切片脱蜡（与常规HE切片脱蜡相同）：石蜡切片置60 ℃ 烤箱烤片15小时以上一从烤箱中拿出立即放入二甲苯I中5~10 min一二甲苯II 5~10min 一无水乙醇5min 一95%乙醇5min 一80%乙醇5min 一70%乙醇5min 一自来水洗Slide 6:2、3%H2O2阻断20min （以消除内源性过氧化物酶的活性，降低背景）；PBS 洗3次，每次5min。
3、抗原修复；PBS洗3次，每次5min。
4、滴加5~10% 正常山羊血清封闭，37℃, 10min （消除背景非特异性着色）Slide 7:5、吸干组织周围多余的血清，不洗，滴加第一抗体，37℃,孵育60min或孵育30min 再4℃冰箱过夜；PBS洗3次，每次5min。
6、擦干组织周围PBS, 滴加生物素标记的第二抗体，37c 孵育20min, PBS洗3次，每次5min。
Slide 8:7、擦干组织周围PBS,滴加链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液37c 孵育20min。
8、PBS洗3次，每次5min, D.W洗2次，DAB显色（DAB必须现用现配），镜下控制显色程度，自来水冲洗，苏木素复染胞核，烤干，中性树胶封片。
染色步骤:染色步骤石蜡切片脱蜡到水；3%H2O2阻断10min （以消除内源性过氧化物酶的活性，降低背景）；蒸馏水洗2次，PBS洗3次，每次5min。
免疫组化的完整步骤及各步原理
免疫组化的完整步骤及各步原理免疫组化是一种常用的实验诊断技术，它通过检测细胞或组织中的特定蛋白质来帮助诊断疾病。
免疫组化的完整步骤包括抗原制备、抗体制备、预处理、染色和结果分析等几个环节。
下面我将详细介绍每个环节的原理及操作步骤。
首先是抗原制备。
抗原是指能够与特异性抗体结合的物质，常见的抗原有蛋白质、多肽和核酸等。
在免疫组化中，我们需要选择一种合适的抗原，并将其制备成适合免疫反应的浓度和形式。
一般来说，抗原可以采用化学合成法、生物来源法或基因工程技术等方法进行制备。
接下来是抗体制备。
抗体是指能够与抗原特异性结合的免疫球蛋白，它是免疫组化的核心成分。
在抗体制备过程中，我们需要先确定需要检测的抗原类型和数量，然后选择合适的动物或植物源材料，进行细胞融合或表达纯化等步骤，最终得到高纯度的单克隆抗体。
第三步是预处理。
在进行免疫组化之前，我们需要对样品进行一系列的预处理操作，以去除杂质和干扰物质的影响。
预处理包括样品稀释、缓冲液调整、基质效应消除等步骤。
还需要根据具体的实验设计选择合适的预处理方法和条件。
第四步是染色。
染色是免疫组化的核心步骤之一，它可以将标记有抗体的二抗与待测样本中的抗原结合，形成可视化的斑点分布。
常用的染色方法包括直接荧光法、间接荧光法、免疫印迹法等。
在染色过程中，需要注意染料的选择、浓度和作用时间等因素，以保证染色效果的质量和稳定性。
最后一步是结果分析。
免疫组化的结果分析需要综合考虑多个因素，如阳性对照品的比较、背景值的控制、图像处理和统计分析等。
常用的结果分析方法包括图像分析软件(如ImageJ)和统计分析软件(如SPSS)。
在结果分析过程中，需要注意数据的可靠性和准确性，避免误判和漏判的情况发生。
免疫组化是一项复杂而精细的技术，它需要综合运用多种知识和技能才能完成高质量的实验诊断任务。
希望以上的介绍能对您有所帮助！。
免疫组化操作方法
免疫组化操作方法免疫组化是一种常用的实验方法，用于检测和定位细胞或组织中特定蛋白质的表达。
它结合了免疫学和生化学的原则和技术，可以提供对细胞或组织中不同蛋白质的分子特征、活动状态和相互作用的信息。
本文将详细介绍免疫组化的操作方法，包括材料和试剂的准备、标本的制备和固定、抗原检测和可视化等步骤。
材料和试剂的准备1.活体或固定的细胞或组织标本。
2.组织培养基和适当的培养器具。
3.PBS(磷酸缓冲盐溶液)或其他细胞/组织冲洗缓冲溶液。
4.组织切片刀、显微刀片、显微镊子、镊子等操作工具。
5.细胞/组织固定剂，如乙醛、甲醛、乙酸乙酯等。
6.可溶性和固相抗原检测试剂，如抗体、蛋白质等。
7.染色试剂，如荧光染料、酶底物等。
8.实验室耗材和设备。
标本的制备和固定1.如果使用活体标本，如细胞培养物，应先将其转移到无菌培养器皿中，并在适当的培养条件下培养至合适的生长期。
2.对于组织标本，可以通过切片或切块的方式进行制备。
切片时要求切片薄而均匀，一般为5-10μm。
切块时要求尽量保持组织完整性。
3.制备好的细胞或组织标本需要尽快进行固定，以保持其形态和蛋白质的天然状态。
常用的细胞/组织固定剂有乙醛、甲醛和乙酸乙酯。
不同的固定剂选用方法有一定差异，具体应根据实验要求和文献建议进行选择。
抗原检测和可视化1.固定后的标本需要进行脱水和透明化处理，以便于抗原检测的进行。
可以使用乙醇或队列进行脱水处理，然后用透明化溶剂进行透明化处理。
2.抗原检测需要使用抗体识别目标蛋白质。
对于免疫组织化学，常用的抗体类型包括一抗和二抗。
一抗为直接与目标抗原反应的抗体，二抗为与一抗结合并由可视化标记物进行信号产生的抗体。
一抗和二抗的选择应根据目标抗原和实验要求进行合理选择。
3.免疫染色前，可进行一些前处理步骤以增强染色效果，如抗体预处理、抗原修复、背景消除等。
4.免疫染色操作中，需要逐层进行抗体处理、洗涤和可视化标记物处理。
一般步骤包括：一抗与标本结合、一次洗涤、二抗与一抗结合、二次洗涤、可视化标记物与二抗结合、最终洗涤。
免疫组化方法
免疫组化方法
免疫组化是一种常用的实验技术，用于检测组织或细胞中特定蛋白质
的表达和定位。
其基本原理是利用特异性抗体与目标蛋白质结合，再通过
染色或荧光标记等方法来检测抗体与蛋白质的结合情况。
免疫组化方法主
要包括以下几个步骤：1.样品制备：将组织或细胞样品固定、切片或涂片
等处理，以便于后续的抗体结合和检测。
2.抗原修复：对于某些抗原易于
失活或难以检测的样品，需要进行抗原修复处理，如加热、酶解等，以恢
复抗原的结构和活性。
3.抗体结合：将特异性抗体加入样品中，与目标蛋
白质结合形成免疫复合物。
抗体可以是单克隆或多克隆，也可以是直接标
记或间接标记的。
4.洗涤：用缓冲液洗涤样品，去除未结合的抗体和杂质，以减少假阳性的干扰。
5.检测标记：将荧光标记、酶标记或金标记等标记
物加入样品中，与免疫复合物结合，以便于检测和定位。
6.显色或荧光：
通过染色或荧光显微镜等设备，观察样品中的免疫复合物的分布和定位，
以确定目标蛋白质的表达和定位情况。
总之，免疫组化方法是一种高灵敏度、高特异性的实验技术，广泛应用于生物医学研究、临床诊断和药物开
发等领域。
免疫组化方法和步骤
免疫组化方法和步骤免疫组化是一种常用的实验技术，用于检测细胞或组织中特定蛋白质的表达水平，以及研究细胞或组织中的蛋白质定位和相互作用。
免疫组化方法涉及一系列步骤，包括样本固定、抗原检测与标记、抗体与抗原结合、可视化和结果分析。
以下是免疫组化方法及步骤的详细介绍。
一、样本固定免疫组化实验的第一步是固定样本，通常使用福尔马林或乙醛等化学物质进行固定。
固定的目的是保持细胞和组织的形态结构，并防止蛋白质的降解。
固定过程中，需要将样本固定在载玻片或膜上，以便之后的实验操作。
可使用刷子或杆状工具将样本涂布在载玻片上，或者使用离心管和离心机将细胞沉淀在载膜上。
二、抗原检测与标记样本固定后，下一步是检测和标记目标抗原。
有两种常用的方法供选择：直接法和间接法。
1.直接法：直接法在一个步骤中同时检测和标记抗原。
直接法可以快速获得结果，但受到抗体的特异性和标记物的可用性的限制。
2.间接法：间接法需要两个步骤，先使用特异性初级抗体与抗原结合，再使用标记有染料或标记物的二级抗体与初级抗体结合。
间接法具有较高的灵敏度和特异性，可以用于多重标记和检测多个蛋白质。
三、抗体与抗原结合蛋白质和抗体结合是免疫组化的关键步骤。
待检样本上固定的抗原与抗体结合可以直接检测或通过信号增强来检测。
抗体与抗原结合的时间和温度取决于抗体的亲和力和特异性，通常需要在较低的温度下进行孵育，并在孵育过程中提供充分的抗体与抗原接触时间。
四、可视化可视化是将抗原抗体结合信号转化为可见光信号的过程。
最常见的可视化方法之一是使用酶标测定法。
酶标测定法将酶（如辣根过氧化物酶）结合到标记物（如荧光素黄标记的二级抗体）上，然后通过加入底物（如DAB）产生可见的色素反应。
除了酶标测定法外，还有其他可视化方法，如免疫荧光技术和原位杂交。
免疫荧光技术使用标记的荧光染料标记一级或二级抗体，然后通过荧光显微镜观察样本。
原位杂交使用与DNA序列互补的标记探针识别特定的DNA序列，并通过可视化标记（如荧光）来检测靶标。
免疫组化简要步骤
免疫组化是一种用于检测细胞或组织中特定抗原的方法。
以下是免疫组化的简要步骤：
1. 样本固定：将待检测的组织样本或细胞样本固定在载玻片上，通常使用福尔马林或乙醇等化学物质进行固定。
2. 抗原恢复：对于一些组织样本，固定后的抗原可能会变性，需要进行抗原恢复步骤，以使抗原恢复其天然的形态和可检测性。
抗原恢复可以通过热处理、酶解或化学处理等方法实现。
3. 阻断非特异性结合：在进行免疫染色之前，需要使用一种非特异性抗体或蛋白质（如牛血清蛋白）来阻断非特异性结合位点，以减少假阳性结果。
4. 抗体结合：将特异性的一抗（一般为单克隆或多克隆抗体）加入样本中，与待检测的抗原结合。
一抗可以是直接标记的，也可以是未标记的。
5. 洗涤：洗涤去除未结合的一抗，以减少背景干扰。
6. 二抗结合：加入与一抗来源不同物种的二抗，该二抗能够与一抗结合并标记有荧光素、酶或其他可视化标记。
二抗的选择取决于一抗的
种类。
7. 再次洗涤：洗涤去除未结合的二抗。
8. 可视化：根据二抗的标记方式，使用荧光显微镜、酶标仪或其他适当的设备对样本进行可视化。
9. 分析和解释：观察和分析样本中的标记信号，并根据标记的位置和强度来解释结果。
需要注意的是，具体的免疫组化步骤可能会因实验目的、样本类型和使用的抗体等因素而有所不同。
以上步骤仅为一般性的简要流程，实际操作中可能会有一些细微的差异。
免疫组化实验方法
免疫组化实验方法免疫组化（Immunohistochemistry，简称IHC）是一种利用特异性抗体与组织或细胞特定抗原结合的方法，以此可以检测细胞或组织中蛋白质的表达和分布情况。
IHC技术已广泛应用于病理学、癌症诊断、生物医学研究等领域。
以下是免疫组化实验的常用方法：1.样本处理：通常以石蜡包埋切片作为实验样本。
首先，从固定的组织或细胞中取得标本，然后进行脱水、透明化和浸蜡等处理。
接下来，使用切片机将组织或细胞切割成厚度为3-5μm的切片。
2.抗原恢复：由于样本的固定和包埋可能导致抗原的损伤，因此需要对切片进行抗原恢复处理。
常见的抗原恢复方法包括热处理、酶解法和酸性水解法。
热处理是将切片置于缓冲液中，在高温下进行退火。
酶解法是使用胰蛋白酶等酶对切片进行消化。
酸性水解法则使用盐酸或酶进行酸性处理。
3.抗体结合：选择特异性的一抗体与目标抗原结合。
一抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，可以经商业采购或自家制备。
将一抗体加入待检测切片上，让其与目标抗原结合。
4. 第二抗体结合：待检测切片上结合了一抗体的抗原后，需要添加第二抗体与一抗体结合。
第二抗体通常是反相应物免疫球蛋白（Secondary Antibody），如反人IgG，反兔IgG等。
第二抗体上常会标记有发光物质、酶标记物或荧光染料，用于可视化结果。
5.可视化和显色：根据选择的第二抗体，可以选择显色方法。
例如，辣根过氧化物酶（HRP）结合的第二抗体可以使用3,3'-二氨基联苯思（DAB）作为底物，呈棕色或棕黄色；荧光标记的第二抗体可以用荧光显微镜进行观察。
6.伪染色：为了辅助观察和识别目标组织或细胞，可以进行伪染色。
常见的伪染色方法有对比染色、核染色和细胞质染色等。
7.阴性对照和阳性对照：为了确保实验结果的准确性和可靠性，同时进行阴性对照和阳性对照实验。
阴性对照是在实验中将第一抗体替换为非特异性抗体或缺少抗体的处理组织或细胞组织；阳性对照是在实验中使用已知表达目标蛋白的组织或细胞进行处理。
免疫组化鉴定菌种的方法
免疫组化鉴定菌种的方法免疫组化是一种常用的实验技术，用于鉴定菌种和研究细胞和组织之间的相互作用。
该技术基于免疫学原理，通过特异性抗体与靶分子结合来检测菌种的存在和特有的生物学功能。
本文将介绍免疫组化鉴定菌种的原理和常见的实验方法。
一、免疫组化原理免疫组化利用抗体与其特异性蛋白质抗原结合的特性，通过荧光染料或酶标记来检测目标分子的存在。
该技术主要包括以下几个步骤：1.样品处理：菌株或细胞培养液通常需要经过固定、包埋或脱水等处理，以保持其形态和结构的完整性。
2.抗体孵育：将标记有特异性抗体的荧光染料或酶标记与待检测的样品接触，使其与目标抗原结合。
3.清洗：将未结合的抗体去除，以减少非特异性背景信号。
4.信号检测：通过荧光显微镜或酶标测定，观察目标分子的位置和表达水平。
二、免疫组化实验方法1.免疫组化染色法免疫组化染色法是一种常用的实验方法，用于在细胞和组织中检测特定抗原的分布和表达。
该方法可分为直接法和间接法：直接法：将已标记的抗原直接与待检测的组织或细胞接触，然后观察染色结果。
这种方法操作简单、快速，但特异性较差，主要适用于已知抗原的情况。
间接法：通过与辅助抗体结合来增强染色信号的强度和特异性。
首先将待检测样品孵育于特异性抗原的抗体中，然后孵育与特异性抗体结合的辅助抗体，最后使用荧光染料或酶标记的二抗进行检测。
该方法灵敏度高，适用于未知抗原的情况。
2.免疫组化电镜法免疫组化电镜法结合了免疫组化和电子显微镜技术，可用于检测细胞和组织中微小结构的特异性抗原。
该方法主要分为直接法和间接法：直接法：直接将标记有特异性抗体的金或其他金属胶体颗粒与待检测的组织或细胞接触，观察金颗粒在电镜下的位置。
间接法：与免疫组化染色法类似，通过辅助抗体结合来增强信号强度和特异性。
在免疫反应后，使用标记有金或其他金属胶体颗粒的二抗进行检测。
3.免疫组化流式细胞术免疫组化流式细胞术常用于检测细胞表面或细胞内特异的蛋白质抗原。
该方法主要分为两种：直接流式细胞术：将标记有荧光染料的特异性抗体与待检测细胞接触，然后通过流式细胞仪测定细胞的荧光强度和受体数目。
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免疫组化技术及其注意事项一、免疫组化染色前处理技术操作规范1、取材：理想的取材厚度是0.2cm~0.3cm，大多数实验室都认为组织在加热抗原修复过程中造成脱片的主要原因是取材过厚或脱水浸蜡处理不当所致。
良好的取材、固定、脱水过程是免疫组化质控的前提，如果H&E切片都做不出满意的染色结果，那么免疫组化染色也将无从谈起,根本无法保证染色质量。
2、固定：在众多的组织固定液中（如甲醛、乙醇、戊二醛、多聚甲醛等），不同的实验方法在使用上各有千秋。
但在保持组织细胞结构的完整性、抗原可测定性、组织渗透性以及试剂的价格上，福尔马林是最好、既经济又通用。
而含酸或含汞的固定液对抗原保存均不理想。
组织离体后固定一般不要超过30分钟，在常温条件下固定时间为8-24小时。
同时还要注意避免福尔马林过度固定造成的组织抗原丢失，有研究发现新鲜组织经过福尔马林一周固定后组织抗原丢失严重，抗原几乎不能被检测，因为组织固定后会引起蛋白或蛋白分子之间形成交联，导致抗原位点遮盖，可以通过抗原修复方法来修正，若加抗体前不采用抗原修复，则免疫组化染色常不能到达理想结果或不成功。
组织同样不能长时间放置在70%的乙醇中，酒精固定后的组织形态不如福尔马林固定的组织.脱钙液对抗原破坏较为严重，因此在组织脱钙前最好在福尔马林液中固定48小时，若组织没有固定透则酸会破坏抗原，脱钙液中酸的浓度与脱钙时间都必须尽量控制在最低的限度。
3、浸蜡：我们认为浸蜡温度应控制在58~60℃左右，浸蜡用的石蜡应经常更换，以减少石蜡中二甲苯的含量。
高温下的二甲苯容易使组织发脆，细胞收缩，更容易掉片。
4、切片厚度：用于免疫组织化学染色的切片厚度为3-4微米。
为防止在染色过程中脱片，需要使用硅化玻片裱片。
5、硅化玻片的制备：载玻片经酸洗冲洗干净后烤干；2%APES丙酮或无水酒精中浸泡1~2min；丙酮或无水酒精洗1~2分钟；蒸馏水浸洗1~2min；烤干备用。
6、烤片：切片在60℃~65℃烤箱中烤片30-60分钟左右。
有些实验室采用烤片过夜。
有报导烤片温度超过60℃时，烤片时间超过18小时的切片，免疫组化染色强度比烤4小时的切片要略弱。
温度过高或时间过长均会影响抗原的活性，原因是在高温干燥条件下可以加速组织切片中抗原的氧化。
7、切片保存：一些实验室研究人员习惯将组织蜡块连续切片后长期保存在室温条件下，切片后的组织在室温下长期保存抗原可以损失。
迈新实验室在实验中发现蜡块切片后，在室温下保存三个月以上，免疫组化染色结果会出现减弱或阴性情况。
并进行了新、旧切片的保存时间对照实验，选择11种不同组织蜡块每例连续切片10片，共110片，常温空气中放置一个月、三个月、半年、一年与新切片进行成对对照实验。
实验结果表明：组织蜡块切片后在室温下保存三个月，抗原对多数抗体的敏感性约下降一半，部分切片丢失更多。
切片保存半年多数的抗体不能出现阳性标记结果，保存一年以上仅有个别的切片能够有微弱的阳性表达，尤其核表达的抗原丢失更为突出。
国外也有类似的资料报道。
其原因可能与空气中的氧化作用有关，所以在实际工作可以采用蜡封切片来避免抗原损失以便长期保存，也可4℃冰箱冷藏保存，尤其是用于科研集中实验的切片更应注意切片的保存。
8、脱蜡：免疫组化的脱蜡步骤与常规H&E脱蜡步骤相同，免疫组化实验室中脱蜡需与H&E常规脱蜡分离，以保证脱蜡彻底，否则可能导致染色结果的异常。
二、免疫组化实验中的抗原修复1、酶消化：如胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白水解酶2、抗原热修复：高压法、微波法、水煮法众所周知，免疫组化染色中最关键的莫过于抗原修复，而绝大多数常用抗体的修复是通过加热来完成的，热抗原修复优于酶消化，更有效，染色结果更易一致，操作单一。
3、修复时间：既要获得最强的染色结果，又要保持组织形态的完整性。
许多抗原修复存在的问题是组织固定时间过短时，强烈的抗原修复可引起形态破坏、脱片及组织完全消化，解决的方法可采用较短时间的热修复或减少酶的消化时间。
4、抗原修复缓冲液：有柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）、Tris （pH7-8）、EDTA （pH8.0~9.0）、EGTA（pH9.0）等，柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）的优点是染色背景清晰，适合于大多数抗体，Tris和EDTA两种修复液对部分抗原修复效果较强，但其染色背景同时加深，如使用不当易造成假阳性结果的判断。
目前还没有一种抗原修复液能适合于所有的抗体，柠檬酸缓冲液（pH6.0）可作为免疫组化常规使用的抗原修复缓冲液，但也不能除外某些抗体适用于EDTA和EGTA 缓冲修复液，一般抗原比较难于表达的抗体多选择高pH值的修复液。
例如：ER、PR、Bcl-2、Bcl-6、TdT、Ki-67、Cyclin D1等。
5、抗原热修复注意事项：无论哪一步都不要让切片干凅，加热后需要冷却15-30分钟。
充分的抗原修复是影响染色结果的唯一重要因素，加热的温度和时间可导致修复不足或过度修复。
6、抗原热修复对组织中内源性生物素的影响：抗原热修复在增强抗原决定簇表达的同时，也增强了组织中内源性生物素的反应。
采用卵白素-生物素（Avidin- biotin）检测系统，组织中内源性生物素容易出现人为假象，在加热抗原处理条件完全相同的阴性对照片中可以观察到较强的内源性生物素的反应，没有经过热抗原处理的切片中没有出现类似的情况。
在细胞浆中呈均一的细颗粒状的浅棕色阳性，有时表达也非常强，与真阳性的结果表达很相似，在以往的免疫组化染色中内源性生物素的影响对诊断造成许多的误差，却常常被忽略。
值得提醒的是在概念上一定要十分清楚，阴性对照片必须与一抗的抗原修复处理条件完全相同，才能准确发现内源性生物素出现的部位。
7、内源性生物素封闭方法：一般在抗原修复以后，加抗体前使用卵白素进行生物素阻断处理，也可使用非生物素的检测系统，如：EliVision、EnVision、SuperVesion等。
三、免疫组化染色实验操作规范1、脱蜡：二甲苯⇒酒精⇒蒸馏水2、内源性过氧化物酶的消除：采用过氧化物酶的检测系统，必须进行内源性过氧化物酶封闭处理。
如果不进行处理，组织中的红细胞、粒细胞会干扰染色结果的判断。
常用0.3%H2O2作用切片10分钟，对染色结果及抗原保存都没有影响，封闭效果比较显著。
3、血清封闭：在加入一抗前需用二抗的正常血清进行封闭，可以减少非特异性结合。
目前使用的二步法检测系统可以免去这一步骤。
4、抗体使用：已有大量的即用型抗体供实验室使用，厂家已进行过多次的实验检测，可按厂家提供的条件进行操作。
浓缩型抗体一般按照厂家提供的建议稀释度，进行对倍稀释预实验。
选定最佳的稀释滴度后再进行批量实验。
染色背景深大多是抗体浓度过高所致。
抗体孵育温度一般以常温25℃为基准或37℃30分钟，也可4℃冰箱过夜。
5、冲洗：常用的冲洗液为PBS或TBS缓冲液,要严格执行冲洗步骤，防止因冲洗不净引起的背景着色，缓冲液中加入Tween20可以增强冲洗效果。
6、检测系统：通用的检测系统有生物素标记的ABC、SP、LSAB等，此类检测系统较为经济，日前仍有不少医院在使用。
非生物素类检测系统价钱较贵，由于不需通过生物素的结合，可以避免内源性生物素的干扰，其特点：敏感、省时、方便、背景低。
7、显色系统：由于检测系统采用的是辣根过氧化物酶，因此选择DAB（棕色）和AEC（红色）作为酶的底物，若采用碱性磷酸酶系统则选择BCIP/NBT（蓝紫色），常规免疫组化显色首选的仍然是DAB，定位清晰，易于保存。
AEC不能耐受酒精及敏感性低，BCIP/NBT阳性虽鲜艳，但阳性定位不准确。
8、复染：衬染步骤十分简单，但衬染的好坏对染色最终结果的质量影响很大。
有的选用Harris苏木素，有的用Mayer’s苏木素，且与DAB染色对照效果最好，在绝大多数实验室中使用简单方便。
也有实验室使用甲基绿衬染衬染，但不能经有机溶剂，容易退色。
四、染色结果的观察1、阳性结果应定位在细胞相应的部位，在细胞膜表达的抗原阳性结果应定位在细胞膜上，在其他部位的阳性反应均为非特异性染色。
不当的抗原修复会导致抗原在组织细胞中定位的改变。
根据所检测抗原的不同，抗原分别定位在：（1）细胞膜：如LCA和CD3、CD20等；（2）细胞质：如Cytokeratin 、GFAP、S100 、CgA、AFP等；（3）细胞核：如Ki-67、ER、PR、TTF-1、HPV-Ag、Cyclin D1、TDT等.2、组织的周边、气泡、刀痕、皱折等部位往往呈现非特异性阳性表达.3、染色结果呈阴性并非都是抗原不表达，要考虑是否与组织中的抗原受到破坏有关.4、组织切片背景深与下列因素有关：（1）石蜡切片脱蜡不干净；（2）第一抗体浓度过高或孵育时间过长,温度过高；（3）显色剂DAB浓度过高或H2O2太多；（4）抗体不纯；（5）抗体孵育后切片清洗不干净。
五、免疫组化实验对照为证实抗体和检测试剂盒效价是否可靠，染色操作是否正确，一般需要进行实验对照，以避免试剂失效或操作失当而出现假阴性和假阳性，确保染色结果的可靠性。
1、阳性对照：选用已知染色中度阳性以上的组织切片染色，阳性切片应呈阳性，此外组织中的内对照也是很好的阳性对照。
2、阴性对照：选用已知染色阴性的组织切片染色，其结果应为阴性。
每次实验中增加Vimentin染色作为对照，目的是观察组织经福尔马林固定后预期抗原表达的敏感性，按福尔马林固定后抗原损伤的程度来进行分析。
Vimentin几乎在任何组织中都有表达，尤其适合活检组织中的免疫组化染色观察。
在与上皮组织相连接的间质中存在着大量的血管Vimentin可阳性表达，如果在同一张切片的间质中出现Vimentin染色微弱或部分区域变弱的情况，表明是不当的固定导致抗原破坏。
所以在每批次实验中应常规加入Vimentin染色，用于指导观察福尔马林固定后抗原表达敏感性情况。
六、抗体的保存和稀释一般来说，抗体应放在4℃冰箱中保存，第一抗体可分成小包装于-20℃保存，使用时存放在4℃，不宜反复存放于4℃和-20℃之间，反复冻融会使抗体效价下跌。
检测系统一般不宜于-20℃保存，因为反复冻融使得与抗体结合的酶容易分解，导致检测的敏感度降低。
浓缩的抗体在染色前应根据说明书要求或自行摸索出的最佳工作浓度进行稀释。
可将抗体稀释至1：10,染色前再稀释成工作液。
浓缩液抗体保存的时间较长，反之稀释后的抗体保存的期限较短，如使用即用型抗体，经过一定时间后应注意其效价时否有所降低，避免出现假阴性染色。
Nestin、PDGFR可用于胃肠间质瘤的诊断指标，尤其对CD117阴性胃肠间质瘤在诊断上有很大的帮助，在国外已有文献报导。
这两种抗体可用于常规固定的石蜡切片，经实验证明Nestin 用PH8.0 EDTA高压修复，PDGFR用PH6.0柠檬酸微波修复效果较好。