石蜡切片免疫组化中抗原修复方法的选择和注意事项
石蜡切片免疫组化染色步骤
石蜡切片免疫组化染色步骤石蜡切片免疫组化染色是一种常用的实验技术，用于研究组织、细胞和分子的结构与功能。
它通过使用抗体与特定抗原相互结合，然后使用酶、免疫荧光等标记物来检测这种结合，从而实现可视化染色和定位目标分子的目的。
下面，我们将详细介绍石蜡切片免疫组化染色的步骤。
步骤一：蜡块去蜡石蜡切片通常是由固定的组织样本制备而成，这些样本在处理过程中会被包埋在石蜡中。
因此，第一步是将蜡块去蜡。
首先，将蜡块放在温水中加热，使蜡块软化。
然后，将蜡块用刮刀从玻片上刮下。
这样可以得到蜡块去蜡后的组织样本。
步骤二：样本再固定在蜡块去蜡后，为了更好地保持组织的完整性和稳定性，通常需要对样本进行再固定。
常用的再固定方法是将样本放入4%的中性缓冲福尔马林溶液中，在室温下固定4-24小时。
固定后，将样本从福尔马林中取出，用PBS（磷酸缓冲盐溶液）洗涤数次，以去除残余的福尔马林。
步骤三：切片制备在样本再固定后，需要将样本制备成切片。
首先，将组织样本放入甲醇中脱水，然后转移到乙醚中脱脂。
脱脂后，将样本放入苯骚酸乙酯中浸泡，使样本渗透均匀。
在苯骚酸乙酯中浸泡一段时间后，将样本转移到石蜡中浸泡。
石蜡具有很好的切片性能，可以更好地保持组织的结构。
最后，将样本放入石蜡包埋机中，进行加热和固化，制备成为石蜡块。
之后，使用旋转切片机将石蜡块切成4-6微米厚的切片。
切片后，将切片浸泡在热水中，使其展开并粘附在玻片上。
步骤四：抗原修复切片制备完毕后，需要对切片进行抗原修复。
抗原修复是为了使样本中的抗原能够更好地暴露出来，增加抗体的结合效率。
常用的抗原修复方法有热处理和化学处理两种。
热处理通常是将切片浸泡在含有缓冲盐的蒸馏水中，然后加热至高温（如95摄氏度）保持一定时间。
化学处理通常是将切片浸泡在含有抗原修复试剂的溶液中，如EDTA（乙二胺四乙酸二钠）溶液。
抗原修复的时间和条件需根据具体实验的要求来确定。
步骤五：非特异性结合阻断为了减少非特异性结合，需要对切片进行非特异性结合阻断。
石蜡切片--免疫组化详细步骤
免疫组化染色
1.石蜡切片60℃烤片2h
2.二甲苯脱蜡15min X 2次
3.梯度乙醇水化：100%乙醇X 2次，95%乙醇X 1次，85%乙醇X 1次，75%乙醇X 1次，
纯水X 2次，各5min。
4.抗原修复:
方法一（微波修复）：将玻片浸没在EDTA或枸橼酸钠抗原修复液中，微波炉高火5min，解冻2min，中低火20min，自然冷却到室温。
方法二（高压修复）：将玻片浸没在枸橼酸钠抗原修复液中，121℃，高压5min，自然冷却到室温。
1L抗原修复液：3g柠檬酸钠+0.4g柠檬酸。
5.灭火内源性过氧化物酶：将玻片浸入3% H2O2，室温15min，避光。
6.双蒸水浸泡3min，去除H2O2。
7.PBS洗3次，每次5min
8.甩干，将玻片摆放在湿盒上，免疫组化笔花圈，加入0.3% TritonX-100穿透细胞15min。
如果检测细胞质蛋白，此步骤科省略。
9.甩干，加入10% BSA 封闭1h。
10.加入2% BSA稀释好的一抗，4℃孵育过夜。
11.第二天，把湿盒从4℃拿出恢复至室温，PBS洗3次，每次5min
12.甩干，加入对应的二抗，室温孵育1h
13.PBS洗3次，每次5min
14.甩干，加入新鲜配置的DAB，显色时间需要摸索，最长不超过10min
15.清水终止显色，自来水冲洗20min以上。
16.苏木素染色30s，自来水冲洗返蓝
17.梯度乙醇脱水：75%乙醇X 1次30s，85%乙醇X 1次30s，95%乙醇X 1次30s，100%
乙醇X 1次30s，二甲苯6min
18.中性树胶封片。
抗原修复方法及注意事项
柠檬酸缓冲液高温高压抗原修复法(强烈推荐)1.适用范围：适合于大量中性福尔马林固定、石蜡包埋组织切片的抗原修复，其效果优于微波修复法和直接煮沸修复法,使得免疫组化结果更加可靠2.仪器设备：市售不锈钢家用压力锅，大小尺寸可根据需要而定(内径18cm为好)；1000-1500W电炉一台；不锈钢或耐高温塑料切片架。
3.所需试剂：0.01M柠檬酸型缓冲液，pH=6.0±0.14.操作步骤：(1)常规组织切片经二甲苯脱蜡、梯度酒精水化后，浸泡于蒸馏水中待用。
(2)取一定量pH=6.0柠檬酸盐缓冲液(800-1500ml)于压力锅中，大火加热直至沸腾；将脱蜡水化后的组织切片置于不锈钢或耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中。
盖上锅盖，扣上压力阀，继续加热至喷汽，从喷汽开始计时，1-2分钟后，压力锅离开热源，冷却至室温(稍冷后，可在自来水笼头下加速冷却)，取出玻片，先用蒸馏水冲洗两次，之后用PBS(pH=7.2-7.4)冲洗两次，每次3分钟(2×3')。
(3)按有关试剂盒的操作步骤执行。
5.注意事项：(1)加热时间长短的控制很重要，从组织切片放入缓冲液到高压锅离开火源的总时间控制在5-8分钟为好，时间过长可能会使染色背景加深。
(2)必须使用不锈钢或耐高温塑料切片架，不能使用铜架，以防缓冲液pH值增高而导致掉片。
(3)高压锅离开火源后必须等缓冲液冷切后，才能把切片取出。
(4)为防止组织脱落，玻片必须经清洁处理后，涂覆Poly-L-Lysine((5)缓冲液的量必须保证所有切片都能浸泡到，用过的柠檬酸缓冲液不能反复使用。
EDTA 抗原热修复法1. 适用范围：适用于部分中性福尔马林固定、石蜡包埋组织切片的抗原修复。
2. 仪器设备：电磁炉、不锈钢锅和耐高温塑料染色架。
3. 所需试剂：EDTA抗原修复液，pH9 .04. 操作步骤：(1)抗原修复液的配制：根据所需工作液的量，取迈新公司产品MVS-0098适量，按1:50 的比例稀释。
不同的抗原修复方法对肾活检标本石蜡切片免疫荧光染色的影响
不同的抗原修复方法对肾活检标本石蜡切片免疫荧光染色的影响简介肾活检是诊断某些肾脏疾病的重要手段。
在进行肾活检时，通常需要进行免疫荧光染色来确定肾脏病理组织的类型和程度。
在进行免疫荧光染色时，免疫抗原修复是一个关键的步骤，它可以增强抗原在组织中的表达，提高染色效果。
本文将探讨不同的抗原修复方法对肾活检标本石蜡切片免疫荧光染色的影响。
抗原修复方法在进行免疫荧光染色时，抗原修复的主要目的是恢复或增强组织中的抗原表达，使其更易于被抗体检测。
目前常用的抗原修复方法包括化学方法、热处理法和酶消解法。
下面分别介绍它们的原理和操作步骤。
化学方法化学方法是一种使用化学物质对组织进行抗原修复的方法。
化学物质一般都是酸、碱或其他特定化合物，它们可以通过改变组织中蛋白质的构象，使其易于与抗体结合。
常用的化学物质包括醋酸、乙酸、甲酸、谷氨酰胺等。
操作步骤1.将药液加入试管中。
2.离心石蜡切片，并将其放入药液中。
3.在适当的温度和时间下进行反应。
4.在 PBS 溶液中洗涤石蜡切片。
5.进行抗体染色。
热处理法热处理法是将组织样本放入高温环境中，以改变蛋白质的构象。
它可以使组织中抗原更易于被抗体识别和结合。
该法使用方便，但需要控制好时间和温度，过渡的热处理会导致组织破坏或失去抗原，而时间过短则容易影响染色效果。
操作步骤1.将石蜡切片放到蛋白酶降解试剂中，进行蛋白酶降解。
2.将石蜡切片放入热处理缓冲液中。
3.用高压蒸气炉进行热处理，温度一般在 90-100°C，时间在 10-20 分钟。
4.在 PBS 溶液中洗涤石蜡切片。
5.进行抗体染色。
酶消解法酶消解法是将组织中的蛋白质通过裂解和水解等方式分解为更容易被抗体检测的分子。
酶消解法适用于形态不易被破坏的组织样本，如肝、肾等。
操作步骤1.将石蜡切片放入酶消解缓冲液中进行反应，时间一般在 20-30 分钟。
2.在 PBS 溶液中洗涤石蜡切片。
3.进行抗体染色。
影响因素抗原修复方法的选择需要考虑多个因素，如待测抗原类型、形态、表达水平、抗体类型等。
抗原修复注意事项
抗原修复是一种用于提高免疫组织化学（IHC）或免疫荧光（IF）染色效果的技术。
以下是一些抗原修复的注意事项：
1. 选择合适的修复方法：不同的抗原需要不同的修复方法。
例如，一些抗原需要使用蛋白酶消化来暴露抗原表位，而另一些抗原则需要使用热修复或化学修复。
因此，在进行抗原修复之前，需要了解待检测抗原的性质，并选择适当的修复方法。
2. 控制修复时间和温度：抗原修复的时间和温度是影响修复效果的重要因素。
通常，修复时间和温度需要根据不同的修复方法和抗原进行调整。
如果修复时间过长或温度过高，可能会导致抗原的过度修复，从而影响染色效果。
3. 避免抗原丢失：在进行抗原修复时，需要注意避免抗原的丢失。
例如，在蛋白酶消化过程中，需要控制消化时间和浓度，以避免过度消化导致抗原丢失。
4. 控制修复液的 pH 值：抗原修复液的 pH 值也会影响修复效果。
通常，修复液的 pH 值需要根据不同的修复方法和抗原进行调整。
如果 pH 值过高或过低，可能会导致抗原的变性或丢失。
5. 避免交叉污染：在进行抗原修复时，需要注意避免交叉污染。
例如，使用不同的修复液和器具处理不同的样本，以避免交叉污染。
总之，抗原修复是 IHC 和 IF 染色过程中的重要步骤，需要仔细控制修复时间、温度、修复液的 pH 值等因素，以确保获得最佳的染色效果。
石蜡切片免疫组化实验方法
石蜡切片免疫组化实验方法预处理：1.收集组织样品：选择实验需要的组织样品，如病变组织或动物组织，固定在4%的中性缓冲福尔马林溶液中，通常时间为24小时。
2.脱水：将固定的组织样品进行脱水处理，使用升级的乙醇浓度，如70%乙醇、85%乙醇和95%乙醇各浸泡5-10分钟，然后在无水乙醇中浸泡2-3次，每次浸泡时间为10分钟。
3.渗透剂处理：将组织样品置于染料渗透剂（如苯酚甲醛、苯酚）中进行渗透处理。
渗透剂的选择根据实验需要的类型来确定。
4.包埋：将已经渗透处理的组织样品放入合适大小的模具中，加入石蜡进行包埋，通常使用两次石蜡浸渍15-20分钟，然后定位标本，放入包埋模具中。
切片：1.切片机调节：根据具体的切片机和刀片的不同，调节适当的角度和切片速度。
2. 切片：将包埋好的组织块放入切片机的切片盘中，以适当的角度切出厚度约为4-6um的石蜡切片，切片时需要保持刀片的清洁，避免刮伤组织。
3.切片回收：使用刀片回收装置将切下的切片轻轻回收至水中，再将切片转移到预处理盒中。
染色：1. 去蜡：将石蜡切片放入脱蜡溶液（如xylene）中进行脱蜡处理，每个浸泡站点持续3-5分钟。
2.脱水：将石蜡切片从脱蜡溶液中取出，放入浓度递减的乙醇溶液中，分别浸泡5分钟，如95%乙醇、70%乙醇和纯水。
3.抗原修复：为恢复组织切片的抗原表位，可以选择酶消化、高压加热或微波处理等方法来进行抗原修复，常用的抗原修复方法包括热处理和酶切法。
4.屏障消除：为了阻止非特异性结合，需要进行屏障消除，使用5%非脂干奶粉或血清进行预阻断，通常需要在37°C孵育1小时。
5.一抗处理：将相应的一抗加入切片上，覆盖玻璃片，通常需要在4°C下孵育过夜。
6.洗涤：用洗涤缓冲液对切片进行洗涤，通常重复3次，每次5分钟。
7.二抗处理：将荧光标记的二抗加入切片上，覆盖玻璃片，通常需要在室温下孵育1小时。
8.洗涤：用洗涤缓冲液对切片进行洗涤，通常重复3次，每次5分钟。
免疫组化中抗原修复的方法(一)
免疫组化中抗原修复的方法(一)免疫组化中抗原修复1. 引言在免疫组化实验中，抗原修复是一项重要的步骤。
由于组织样本中的抗原可能会被固定、石化或脱变，导致免疫染色的效果不佳。
因此，进行抗原修复可以提高抗体与抗原的结合率，增强信号的强度和特异性。
2. 抗原修复的方法热原修复法热原修复法是最常用的抗原修复方法之一。
具体步骤如下：•将切片置于含有缓冲液的载玻片上；•将载玻片放置在加热板上，设定适当的温度和时间，通常为95°C，15-20分钟；•等待切片冷却至室温，继续下一步的处理。
酶解原修复法酶解原修复法适用于某些情况下，特别是当形状石化的抗原需要修复时。
具体步骤如下：•将切片置于含有酶解液的载玻片上；•将载玻片放置在适当的温度和湿度条件下进行酶解，通常为37°C，30分钟；•冷却切片至室温，然后进行下一步处理。
酸性原修复法酸性原修复法主要用于修复石蜡包埋组织标本中的抗原。
具体步骤如下：•将切片浸泡在含有酸性溶液的容器中，通常使用的酸性溶液；•在合适的温度条件下进行酸解，通常为95°C，30分钟；•将切片冷却至室温，并进行下一步处理。
高压原修复法高压原修复法是相对较新的抗原修复方法，它利用高压力来提高修复效果。
具体步骤如下：•将切片置于含有修复液的载玻片上；•将载玻片放置在高压原修复设备中，设定适当的压力和时间；•冷却切片至室温，并进行后续处理。
3. 结论抗原修复在免疫组化实验中起到至关重要的作用，可以修复被固定、石化或脱变的抗原，提高抗体与抗原的结合率，增强信号的强度和特异性。
常用的抗原修复方法包括热原修复法、酶解原修复法、酸性原修复法和高压原修复法。
选择合适的方法进行抗原修复，可以提高免疫组化实验的准确性和可靠性。
以上就是本文对免疫组化中抗原修复的相关方法进行的详细介绍。
希望对读者在免疫组化实验中的抗原修复环节有所帮助。
4. 热原修复法的原理和优缺点原理热原修复法是利用高温对抗原进行恢复性变性处理，使其重回天然的结构状态。
免疫组化常见抗原修复方法
免疫组化常见抗原修复方法大多数甲醛固定的组织在开始染色之前都需要先修复抗原，这是由于在固定过程中产生了亚甲基桥使蛋白之间交联屏蔽了抗原位点。
两种抗原修复方法为热修复法（称之为热诱导抗原表位修复或HIER）和酶解法。
一、热修复法1. 热修复缓冲溶液下面是三种HIER较为常用的缓冲溶液，对于一个特定的抗体，在没有其他研究者建议的情况下，要通过实验确定选用哪种修复缓冲液。
1) 枸橼酸钠缓冲液(10 mM Sodium Citrate，0.05% 吐温- 20, pH 6.0)2) 1 mM EDTA, 调至pH 8.03) Tris/EDTA 缓冲液(10mM Tris, 1 mM EDTA 溶液， 0.05% 吐温-20, pH 9.0)2. 热修复方法a) 高压蒸汽法玻片要置于金属架上1)材料及试剂· 家用不锈钢高压锅· 加热板· 玻片架放置容器（容量大约400-500ml）· 抗原修复缓冲液（如Tris/EDTA pH 9.0，枸橼酸钠pH 6.0）2)方法1. 将合适的抗原修复缓冲液加入高压锅内，然后将锅置于加热板并开至最大功率，此时不要把盖子盖紧。
在等待煮沸过程中，进行脱蜡至水。
2.煮沸后，将玻片从自来水中取出放入高压锅内。
小心热溶液- 使用镊子。
依照说明书加上加压阀。
3.高压锅达到最大压力后，维持3分钟。
4.3分钟过后，关掉加热板，将高压锅取下放置。
5.打开高压锅阀门，冷水冷却锅身。
压力降下后，打开锅盖，冷水冷却10分钟。
6.继续染色。
b) 微波法1)材料和试剂· 家用(850W)或科研专用微波炉· 微波炉专用玻片放置架及容器（容量大约400-500ml）或染色缸· 抗原修复缓冲液（如Tris/EDTA pH 9.0，枸橼酸钠溶液pH 6.0，等等）2)方法1.将切片脱蜡至水。
2.向微波炉专用容器中加入合适的修复缓冲液。
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石蜡切片免疫组化中抗原修复方法的选择和注意事项
免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC）是一种通过抗原抗体特异性反应来检测并定位蛋白的方法，目前广泛应用于组织病理学诊断。
其中，抗原修复（Antigen repair，AR）是免疫组化过程中不可忽略的关键步骤。
原因是组织经福尔马林等固定液固定和石蜡包埋后，抗原决定簇与核酸易发生交联，引起蛋白质空间结构的改变，导致抗原决定簇被封闭，使抗原与抗体的结合点减少，从而令抗原的阳性检测率及着色强度相对减弱。
这种交联在高温加热或是蛋白酶水解的作用下会发生可逆反应，恢复蛋白的原有构象，这一过程就是抗原修复。
一AR常用的方法是否进行AR、采用什么方法进行AR 要按抗体说明书的要求决定，不同的抗体选择适合该抗体的AR方法，有的要求高温修复，有的要求酶消化。
➤微波法
方法：切片于抗原修复液中经微波炉内微波辐射5-20min。
它是利用微波每秒以24亿5千万次的快速运动产生瞬间热。
微波辐射可以使各物质分子作极性运动，促进形成的醛键断裂开。
分子间运动所产生的瞬间热可导致甲醛固定后的蛋白的变性。
该法的特点是：产热迅速，容易操作，但也容易引起抗原修复液的沸腾，使得修复液温度不稳定。
➤高温高压法
方法：切片于抗原修复液中在高压锅中加热至沸腾，盖上压力阀至喷汽后持续1-5min。
该法利用高压和高热来促进醛键的断裂，当加热至开锅，加上高压阀后，汽体喷出，此时的温度在100℃-120℃之间，而高压也易使蛋白变性。
➤真空负压法
方法：切片于抗原修复液中在预先调至95℃的真空负压干燥箱中真空负压处理5-10min。
这是一种操作简单，效果特佳，温度恒定，能一次性处理大量切片的方法。
该法特点是分子在失重的情况下四处飘游，可以增加各分子间的碰撞机会，而且恒定的温度能保证使甲醛固定的蛋白发生变性又不会使抗原修复液达到沸点。
➤酶修复法
方法：0.10%胰蛋白酶或0.40%胃蛋白酶在室温或37℃消化切片15-30min。
除上述两种常用蛋白酶，链霉蛋白酶、无花果蛋白酶和菠萝蛋白酶等也可被用来消化切片。
现今应用酶来消化切片，主要是根据抗体的要求来进行的，或者是在前面几种修复方法都达不到理想染色效果时才考虑选择和叠加的，因为酶消化容易引起脱片，甚至会破坏抗原性和组织结构，在消化的温度、时间上也较难把握。
目前微波法和高压锅法是常用的两种修复方法，其中高温高压比微波处理的染色结果的好。
这可能是因为高压锅加压后可使温度达到120℃，而微波的温度仅能达到100℃，组织在120℃的高温下，使维持蛋白质三级结构的氨基酸侧链基团的次级链断裂，产生较多有功能的特征性的蛋白质三级结构，为抗体的结合提供了更多的机会。
但因
其修复温度过高，脱片现象也较微波法严重。
一般而言，对于大部分胞质和胞膜表达的抗原，多采用微波修复法进行抗原修复，对于胞核表达的抗原和少部分胞质表达的抗原（如CD5、Bcl-2等），建议使用高温高压法修复。
二抗原修复液的选择
抗原修复缓冲液有多种，常用的有0.01M柠檬酸缓冲液（pH 6.0）、2-氨基-2-（羟甲基）-1，3-丙二醇缓冲液（Tris，pH 7.0～9.0）和乙二胺四乙酸缓冲液（EDTA，pH 8.0～9.0）修复液。
这几种缓冲液最大的区别在于pH值不同和是否存在EDTA。
pH 对抗原修复影响很大，有些抗原可以在较大的pH范围内进行修复，而有些抗原只能在某一特定的pH值被修复。
此外，高pH缓冲液更容易造成脱片和使组织中内源性生物素暴露。
因此，在使用SP法进行实验时，对酶系丰富的组织，如肝、肾等，应优先使用低pH缓冲液进行实验。
EDTA是一种钙或其他二价离子的螯合剂，钙离子可以诱导蛋白构象发生改变最终引起免疫活性的改变，即对于信号较弱的抗原能起到很好的修复效果。
对于大部分抗原的修复，我们建议优先使用0.01M柠檬酸缓冲液（pH 6.0），若是修复效果不理想，再考虑提高pH值或加入EDTA进行尝试。
三AR时温度和持续时间
蛋白经福尔马林等固定液固定后，要使其发生变性，温度必须在高于90℃，尤其是恒定在95℃时最好，这是因为：①修复液温度未达到沸点，不容易造成脱片；②能够解离和破坏与蛋白交联的甲醛醛键等；③处理时可以稳定控制和确定抗原修复的作用时间。
不同抗原修复方法，所需温度和持续时间也不同。
例如：真空负压法需达到预定的温度和所需的负压（66.7KPa）后持续5-10min，微波修复时温度不好控制，抗原修复液容易沸腾，一般任凭其沸腾持
续5-10min，但要保证修复液足够防止干片。
如果切片容易脱片，可以在修复液沸腾后关掉电源，待温度下降后，再重开电源。
如此反复数次，使之持续10-15min。
如果修复效果较差，也可以延长修复时间至20min。
而高温高压修复法因其温度可达到120℃，只需在抗原修复液沸腾后，加上压力阀，出现喷气后，持续1-5min即可达到很好的修复效果。
应用不同的方法进行抗原修复时，应在达到其有效温度后再计算修复时间，才能更好地进行质控和达到理想的修复效果。
四AR时需要注意的问题
✤ AR后需自然降温
抗原修复持续时间过后，需放于室温中让其慢慢地降温，决不能为了争取时间，强行用冰块或冷水令其降温。
这是因为当高温中的抗原蛋白分子链脱离了其它的束缚或联结，要有一个自然环境让其自然放松下来，随着温度的降低，它们会慢慢地恢复原来的形态和构型。
如果用冰块和冷水强行令其降温，松开后的蛋白分子肽链突遇降温而固定下来，恢复不了原有的构型，则达不到预想的效果。
✤抗原修复液需足量
由于抗原修复多采用加热的方法使修复液沸腾，尤其是微波法产热更快，修复液容易挥发导致干片，从而造成假阴性以及背景着色。
而足量的抗原修复液，也可以使得修复时温度更加稳定，有利于我们更好地对实验进行质控。
✤抗体与AR关系
在进行免疫组化实验之前，我们不仅要了解抗体的种属，还应知道其表达位置，是否需要AR和AR方式以及是否适用于石蜡切片
（IHC-P）等等。
有些抗体只适合用酶修复法进行修复，而对于在胞核表达和信号较弱的抗原，则推荐选用高温高压法进行修复，抗原修复液pH值也应提高和加入EDTA。
甚至可以考虑联合处理法，即先进行酶消化，然后再进行热修复。
没有一种抗原修复方法能适用于所有的抗体。
我们应该根据不同的抗体、不同的公司产品以及各自科室、实验室的实际情况，在实际操作过程中反复摸索和不断完善出一套合适的抗原修复方法，其主要目的是提高抗原检测率和染色强度，为病理诊断提供准确性和稳定性的参考依据。