免疫组化染色的操作技巧和注意事项
免疫组化染色(石蜡切片)操作步骤及结果分析方法(精髓版)
免疫组化染色（石蜡切片）操作步骤及结果分析方法一、原理及应用免疫组化，简单说是用标记的抗体对组织中相应抗原进行定位、定性和部分定量的分析。
二、操作步骤：（1）将石蜡组织切片置于65°C恒温箱，烤片1h左右。
（2）脱蜡：二甲苯I 10min→二甲苯II 10min →梯度酒精（由高到低）各5min。
（3）1×PBS 洗涤3次，每次 5min。
（4）0.5% Triton X-100通透（PBS配制），目的是使抗体能够充分地进入胞内进行结合反应。
Triton X-100 可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内，这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合。
当然了，如果检测的是膜抗原无需通透，忽略该步骤。
（4）抗原修复：使用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，微波炉微波高火 3min，之后转成低火 15-30min。
注：福尔马林或多聚甲醛固定，会导致蛋白交联，而解交联的过程称为抗原修复。
所以冰冻切片不需要抗原修复！！抗原修复方法有多种，一般包括两大类：酶抗原修复(胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K) 热抗原修复(高压蒸汽法、微波法、水浴加热法)。
微波法最为常用。
（5）1×PBS 洗涤3次，每次5min。
（6）3% H2O2，室温孵育30min，目的是灭活内源性过氧化物酶。
（7）1×PBS 洗涤3次，每次5min。
（8）使用1% BSA 进行室温封闭30min，用于封闭非特异性抗原表位。
（9）根据抗体说明书使用合适浓度的特异性一抗，4°C 湿盒中静置过夜孵育。
（10）次日取出切片，室温下复温30min。
（11）1×PBS 洗涤3次，每次5min。
（12）按照免疫组化二抗试剂盒说明书操作。
（13）DAB 显色：DAB 显色液按说明书配制，使用时滴加到血管组织上，显微镜下观察并计时，待目的蛋白显色呈棕黄色时结束显色。
（14）苏木素染细胞核：苏木素染液5-10min（根据苏木素染液使用时间的长短，来调整染色时间）→ 流水清洗1min→ 1%盐酸酒精分化瞬时→ 流水清洗1 min→1%氨水反蓝瞬时→流水清洗1min。
免疫组化的染色操作的质控管理
1、 标本固定
固定液为 4%中性缓冲甲醛( 10 ml 甲醛 +90 ml PBS 缓冲液) 。要求离体后及时固定，固定液的量为标本体积的5 ～ 10 倍。固定不当，固定时间不够或过长，都可引起抗原丧失，尤其是一些较脆弱的膜抗原( 如 CD20 等) ，故固定应及时并充分。取材后小标本固定时间应 ＞ 6 h，肿瘤标本最好 ＞ 24 h。
复染是为了衬托免疫组化的阳性染色，所以苏木精颜色不宜太深，同时由于操作中使用了吸附玻片，所以建议复染的苏木精应勤于过滤，减少人为的背景染色。
8、 染色中的Biblioteka 些细节在整个染色过程中，切片始终保持湿润，不能干片。滴加一抗时应将切片上的水甩干，以免抗体被稀释。滴加抗体时要确保覆盖全部组织，以免边缘未覆盖到抗体，引起边缘效应。同时孵育盒要放平，以免抗体流至组织一端，造成假阴性或局部弱阳性结果。
6、 显色
如果发现配制好的 DAB 显色液中出现棕色沉淀那么此显色液可能失效，建议重新配制。在显色时，一般阳性局部广泛或阳性定位在胞质的组织，显色非常迅速，1 ～ 3 min 即可见明显的棕色，应及时终止显色。阳性局部稀少且定位在胞核的组织，那么需要显微镜下观察，时间不宜过长以免造成背景染色。
7、 复染
综上所述，质控工作总是发生在实验检测前才能生效。
如标本制作前的处理固定以及制作中的质控流程和切片质量对免疫组化的染色效果，都是相互影响、相互依存的。在免疫组化操作过程中，有许多至关重要的步骤，都是一环扣一环，每走一步都要进行有效监控，才能做出高质量的切片。因此要求操作人员有高度的责任心，严格遵循操作标准，为病理诊断提供表达准确、染色清晰的高质量的免疫组化染色。
免疫组化步骤和注意事项
免疫组化步骤和注意事项免疫组化是一种重要的实验技术，用于鉴定细胞、组织或生物样本中特定抗原的分布和表达情况。
它可以通过对特定抗原与抗体的特异性结合来检测目标分子的存在和定位。
下面将介绍免疫组化的步骤和注意事项。
免疫组化的主要步骤包括抗原脱蜡、抗体反应、显色和染色。
1. 抗原脱蜡：免疫组化的第一步是将组织样本或细胞脱脂、脱蜡和重水化，以去除蜡质，并使抗体更容易与目标抗原反应。
2. 抗体反应：将脱蜡的组织样本或细胞块通过抗原修复处理，以恢复抗原的免疫反应性。
然后，将免疫抗体与待检测的抗原反应，形成免疫复合物。
免疫抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，可以与组织或细胞中的特定抗原高度特异性地结合。
3. 显色：免疫复合物形成后，可以使用标记有酶（如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶）或荧光标记的二抗来检测免疫复合物。
在酶法中，可添加草酰胺基苯酸（DAB）或硫代硝基羟基苯并啶（NBT/BCIP）等底物以产生可见的色素沉积。
在荧光法中，免疫复合物被激光器或荧光灯激发后，会发出特定颜色的荧光信号。
4. 染色：完成显色后，可以通过核染色（如用伊红、伊红和伊蓝）来观察细胞核的形态特征，以配合免疫标记物的定位。
虽然免疫组化是一种有价值的技术，但在实施过程中也需要注意一些问题：1. 选择合适的抗体：在进行免疫组化实验时，选择特异性高、效价好的一抗抗体非常重要。
一抗抗体的选择应基于抗原的特异性和病变的病理生理特性。
2. 优化抗体浓度：免疫组化实验中，抗体浓度的选择是关键因素。
过高的抗体浓度会导致非特异性的染色，而过低的浓度则无法检测到目标抗原。
3. 优化抗原修复处理：抗原修复处理对于免疫组化的成功非常重要。
选择合适的抗原修复方法可以增强组织或细胞中的抗原的免疫反应性。
4. 阴性对照和阳性对照：为了验证实验的可靠性，每次免疫组化实验都应包括阴性对照和阳性对照。
阴性对照不包含待检测的抗原，而阳性对照则确保抗体和显色试剂的正常工作。
5. 切片质量：免疫组化实验的结果直接受到切片质量的影响。
免疫组化的注意事项操作要点和技巧
免疫组化的注意事项、操作要点和技巧一些教训：1、对于多甲灌注固定的标本，如要长期保存，要先脱水后冻存，此法对于采用漂片法IHC 较适合。
正确操作：多甲灌注固定——多甲或甲醛后固定——蔗糖梯度脱水——负70度保存——冰冻切片错误操作：多甲灌注固定——多甲或甲醛后固定——负70度保存——蔗糖梯度脱水——冰冻切片，结果是会有大量冰晶形成。
2、如果能确认使用石蜡切片并使用贴片法进行下一步IHC，多甲或甲醛后固定后应尽快脱水并石蜡包埋。
要点和操作技巧：1.固定：最好用4%的多聚甲醛固定液。
对于冰冻切片，甲醛固定有时比冰冻丙酮好；但对于不同的组织和抗原，可选用不同的固定液。
有时候商品化的抗体会有比较适合而推荐的固定液，请于购置前注意说明书。
Bouin S固定液：饱和苦味酸750ml，甲醛250ml，冰醋酸50ml，其对组织的穿透力较强，固定较好，结构完整，但因偏酸，对抗原有一定损害，且组织收缩明显，不适于组织标本的长期保存。
PLP液：即高碘酸钠-赖氨酸-多聚甲醛，适于固定石蜡切片。
适于富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。
2．组织脱水，透明：时间不能太长，否则在切片时容易碎片，切不完整。
3．切片时展片：有些组织在切片后难以在水中展开，这时可适当地在水中加入几滴乙醇。
4．烤片：60℃ 30分钟或37℃过夜，温度太高或时间太长，抗原容易丢失。
5．蜡块及切片的保存：最好在4℃保存6．脱片问题：Poly-L-Lysine(多聚赖氨酸)为目前免疫组化染色工作中最常用的一种防脱片剂，6ml的多聚赖氨酸溶液可按1:10稀释成60ml的工作液，适合于需要酶消化、微波、高温高压的防脱片处理。
如不行，可用双重处理（APES和Poly-L-Lysine）的切片。
在以上两种条件都行不通的情况下，可用如下方法：切片在脱蜡前，放在APES 1：50 丙酮溶液中浸泡3分钟，晾干，即可进行下一步。
7．灭活内源性酶：HRP系统：3%双氧水灭活；AP系统：3%HAc灭活。
免疫组化染色评分方法
免疫组化染色评分方法摘要：一、免疫组化染色评分方法简介二、评分方法的具体步骤1.切片处理2.抗原修复3.抗体孵育4.染色5.洗涤6.复染7.评分三、评分标准及注意事项四、免疫组化染色评分在临床实践中的应用五、总结与展望正文：免疫组化染色评分方法是一种通过检测抗原与抗体反应来评估蛋白质表达水平的实验技术。
该方法广泛应用于生物学、病理学和临床检验等领域，为疾病诊断、疗效监测和疾病研究提供了重要依据。
本文将对免疫组化染色评分方法的具体步骤、评分标准及注意事项进行详细介绍，并探讨其在临床实践中的应用。
一、免疫组化染色评分方法简介免疫组化染色评分方法是一种通过检测抗原与抗体反应来评估蛋白质表达水平的实验技术。
它利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应将蛋白质抗原暴露出来，再与特异性抗体结合，最后通过显色剂显色，从而判断抗原的表达情况。
二、评分方法的具体步骤1.切片处理：将组织样本固定在载玻片上，并进行脱水、透明、浸蜡等处理。
2.抗原修复：采用热或酶消化法对切片进行抗原修复，以恢复抗原活性。
3.抗体孵育：将切片与第一抗体共同孵育，特异性结合抗原与抗体。
4.染色：加入显色剂，使结合的抗体显色。
5.洗涤：去除未结合的抗体和多余的显色剂，以便进行下一步操作。
6.复染：用苏木精或其他染料对细胞核进行复染，使细胞结构清晰。
7.评分：根据染色强度、阳性细胞比例和染色均匀性对免疫组化染色结果进行评分。
三、评分标准及注意事项1.评分标准：通常采用4级评分法，即0分为无染色，1分为弱染色，2分为中等染色，3分为强染色。
2.注意事项：a.抗原修复过程中，要根据组织类型和实验目的选择合适的修复方法。
b.抗体孵育时，应确保抗体浓度、孵育时间和温度等条件适宜。
c.染色过程中，要控制显色时间，避免过度染色或染色不均。
d.评分时应充分考虑染色强度、阳性细胞比例和染色均匀性三个方面的因素。
四、免疫组化染色评分在临床实践中的应用免疫组化染色评分方法在临床实践中具有重要意义，如评估肿瘤患者的病情、监测治疗效果和预测疾病预后等。
Mayer'苏木素染液(免疫组化)使用说明及注意事项
Mayer'苏木素染液(免疫组化)使用说明及注意事项
货号：G1080
规格：10mL/100mL
保存：室温避光保存，有效期至少一年。
产品简介：
Mayer'苏木素染液(免疫组化)适合免疫组化中组织切片的复染，染色后细胞核呈蓝色。
本产品为工作液，可直接使用。
染色液可重复使用多次，但染色效果会逐渐降低。
使用方法：
1、免疫组化显色后，将组织切片浸入苏木素染色液，也可以直接滴加到样本上染色
5-10分钟(深染)，或0.5-2分钟（浅染）。
2、浸自来水中冲洗去除多余的染色液。
3、颜色过深可以在分化液（1%盐酸）中分化几秒钟，再用氨水(0.25%)或PBS(pH7.4)
冲洗返蓝，镜下观察结果。
4、染色、分化、返蓝时间都需要预实验优化至最佳，分化和返蓝步骤可选。
5、根据显色液的种类，用水性封片剂直接封片或梯度酒精脱水，二甲苯透明后用中性
树胶封片。
注意事项：
1、第一次使用本试剂盒时建议先取1-2个样品做预实验。
2、室温避光保存，2-8℃保存最佳，至少一年有效。
3、染色过程推荐浅染，通常只需能够分辨细胞核即可，颜色过深有可能影响细胞质颜色。
4、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
免疫组化染色（石蜡切片）操作步骤及结果分析方法（精髓版）
免疫组化染色（石蜡切片）操作步骤及结果分析方法（精髓版）免疫组化染色（石蜡切片）操作步骤及结果分析方法一、原理及应用免疫组化，简单说是用标记的抗体对组织中相应抗原进行定位、定性和部分定量的分析。
二、操作步骤：（1）将石蜡组织切片置于65°C恒温箱，烤片1h左右。
（2）脱蜡：二甲苯I 10min→二甲苯II 10min →梯度酒精（由高到低）各5min。
（3）1×PBS 洗涤3次，每次 5min。
（4）0.5% Triton X-100通透（PBS配制），目的是使抗体能够充分地进入胞内进行结合反应。
Triton X-100 可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内，这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合。
当然了，如果检测的是膜抗原无需通透，忽略该步骤。
（4）抗原修复：使用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，微波炉微波高火 3min，之后转成低火 15-30min。
注：福尔马林或多聚甲醛固定，会导致蛋白交联，而解交联的过程称为抗原修复。
所以冰冻切片不需要抗原修复！！抗原修复方法有多种，一般包括两大类：酶抗原修复(胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K) 热抗原修复(高压蒸汽法、微波法、水浴加热法)。
微波法最为常用。
（5）1×PBS 洗涤3次，每次5min。
（6）3% H2O2，室温孵育30min，目的是灭活内源性过氧化物酶。
（7）1×PBS 洗涤3次，每次5min。
（8）使用1% BSA 进行室温封闭30min，用于封闭非特异性抗原表位。
（9）根据抗体说明书使用合适浓度的特异性一抗，4°C 湿盒中静置过夜孵育。
（10）次日取出切片，室温下复温30min。
（11）1×PBS 洗涤3次，每次5min。
（12）按照免疫组化二抗试剂盒说明书操作。
（13）DAB 显色：DAB 显色液按说明书配制，使用时滴加到血管组织上，显微镜下观察并计时，待目的蛋白显色呈棕黄色时结束显色。
免疫组化染色步骤
免疫组化染色步骤：（两步法）第一天下午一、备片1、5微米厚组织涂有APES的胶片，干燥切片烤片：60℃、60-90min。
至蜡融化组织贴在玻片上。
2、二甲苯脱蜡：15minX3。
至蜡消失。
可第一缸时间较长，第二三缸较快。
需上下提洗，加快速度。
3、水化：梯度酒精水化（100%，90%，80%）入自来水。
如未洗净，则片子看上去有油腻感。
洗至看上去非常干净。
也宜上下提洗。
二、免疫组化染色1、3%双氧水封闭10-15min。
（注：现用现配，30%双氧水用蒸馏水稀释1：10）；蒸馏水洗一次，冲一下即可。
2、依据抗体说明热修复，高火每盒3min，然后低火12min。
过夜。
一些抗体比较特殊：CD68、Vimentin、S－100水化后胰酶消化15min，用TBS冲干净后，放入缓冲液中过夜；Kappa、Lambda需修复两次，即低火12min两次；第二天上午3、擦干背面及组织周围的水（注意：分清正反不要擦掉组织）；加1XTBS稀释后一抗30-50微升/张（注：一般为1：50；多抗1：100；可依据抗体说明书摸索）室温40min，TBS洗5min×3次；4、加A液（聚合物增强剂）20min，TBS洗3min×3次；5、加B液（二抗即酶标抗鼠/兔聚合物）30min，TBS洗3min×3次；6、DAB显色（A液B液15μl/1000μl，现配现用）3-10min。
7、显微镜下观察显色满意后自来水终止显色。
8、用Mayer’s苏木素复染核（新配1－2min），分化（盐酸酒精），返蓝（自来水）。
三、脱水（80%，90%，100%酒精）；透明（纯二甲苯3X5min）；封片。
免疫组化配液一、1XTBS：(5000ml，1XTris-NaCl，PH=7.6)二、修复液1、0.01M枸橼酸盐缓冲液：（1000ml，PH=6.0）配置前摇匀，配后摇匀测PH值。
2、10XTris-EDTA抗原修复液：（500ml，PH=9.0）用前稀释10倍3、Mayer’s苏木素甲液：苏木精1g，无水酒精20ml。
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免疫组化染色的操作技巧和注意事项
【摘要】目的本院对免疫组化染色过程中存在的问题及对策进行深入的探讨以及仔细的分析。
方法自从2010 年6 月~2011 年7 月期间, 本院共收治免疫组化染色标本患者有200 例, 对其中存在问题的60例患者标本进行了仔细的分析, 并且要提出科学的应对措施。
结果本院对疫组化染色过程提出了主要的积极应对措施和科学的建议。
结论对于每一个步骤以及环节, 都会影响到染色的最终后果, 对此, 要尽量避免在染色过程中会出现一些问题, 会使免疫组化染色的质量有所提高。
【关键词】免疫组化；技术方法；质量控制；抗原修复；原因分析对于免疫组化(IHC) 技术在上世纪的80 年代之后, 在我国就迅速的开展, 至今已经有20 年快速发展的历程, 现在已经逐渐的成为病理科工作中主要的组成要素。
综合性操作技术主要是导致免疫组化, 这样会使其反应步骤增加, 出现复杂的影响因素, 技术员在基础技术上的操作要求是相对较高的, 对免疫组织学习要进行不断的提高, 了解这种技术在病理诊断方面是主要的辅助方式, 在对疾病诊断、分析、预后以及指导临床个体化治疗等方面, 都有着主要的作用。
在免疫组化的技术方面, 也存在着各种实质性的问题, 收治免疫组化染色标本200 例, 其中有60 例标本存在着问题, 本院对其进行仔细的分析, 并且提出相应的科学对策治疗方式。
1 免疫组化染色不理想的原因分析及改进措施
1. 1 由于大分子的化学结构相对稳定, 它在水中呈现胶状体, 不易被机体破坏或排除, 这样在体内存留时间就很长, 有利于持续刺激淋巴细胞。
抗体是人体抵抗感染的一种重要武器, 抗体是人或动物受抗原物质刺激后, 由浆细胞合成和分泌的一种特异性蛋白质, 并具有疏水性, 因此当对抗体进行稀释时可降低它的疏水性, 当pH 接近抗体的等电点时, 抗体的疏水性能十分巨大。
1. 2 抗体与抗原的交叉反应抗原是一类能诱导免疫系统发生免疫应答, 并能与免疫应答的产物发生特异性结合的物质；抗体是人或动物受抗原物质刺激后, 由浆细胞合成和分泌的一种特异性蛋白质。
组织中其它蛋白质存在相同的抗原, 就能与抗体直接产生反应, 会有其它反应, 临床由于多克隆抗体适应性强, 极容易有交叉反应单克隆抗体也能产生交叉反应, 所以对克隆抗体的应用必须谨慎, 使交叉反应降到最低。
1. 3 抗原修复不足对于固定的组织, 会导致抗原之间有相交的联系, 是抗原决定簇被封闭, 对此, 要尽早的对抗原进行有效的修复。
应根据需要进行选择在修复时所用
的方式, 通常可以使用酶消化修复以及热修复等方式。
在使用微波修复还是高压高温进行修复, 热修复都能达到有效的修复作为实验的科学依据。
1. 4 组织固定不恰当当试验的组织固定的位置是否正确时对试验结果有很大影响, 它的好与坏与抗原的保存有直接关系；当固定不及时会出现组织自行溶解或者干硬变形, 一旦出现自溶就会造成抗原丢失, 而干硬就是蛋白质变性的结果, 就会出现大量抗原性功能消失, 极易脱色即便染上也会是棕色的, 所以对体积的要求就更严格了。
2IHC 过程及注意事项
2. 1组织准备对于IHC 先决条件是进行良好的组织处理组织固定要确保能够做到最好, 包括对保存细胞以及组织的形态的结构, 并且在最大限度方面, 能够保存其抗原的免疫活性值。
这样, 在组织和固定反方面必须进行即时、必要处理。
2. 2 蜡块选择与切片质量对于脱水和包埋质量好的蜡块在选择上, 能够充分的保证蜡膜的完整、均匀程度。
通常, 切片的厚度要确保在3卩m之内，对于出现过厚的切片会导致与载玻片的粘附性不牢固, 对于乳腺组织是人体中脂肪含量最多的部位之一, 在高温和高压的修复处理作用时, 容易产生脱片现象［1］。
2. 3 抗原修复在整个修复的过程中, 逐渐的减弱多聚
赖氨酸分子和组织切片之间的有效结合力, 这样, 修复是免疫组化最常出现的脱片现象。
对于适当将修复
液是非常重要的可以选择相对比较温和药物, 比如是
枸橼酸修复液等。
2. 4 染色中应注意的一些细节把孵育盒放置在一个比较平稳的地方, 不要使抗体液流到组织的另一侧, 这会使结果呈现假阴性反应；另外抗体孵育盒里面要留有适量的蒸馏水但水不宜过多, 防止因水蒸汽在盒盖聚成水滴, 掉落在切片上, 造成抗体稀释；再有就是保持切片在整个染色过程中, 一定要保持湿润, 不要出现干片的现象。
最后在加入抗体的时候, 要把组织上的水弄干, 避免抗体稀释影响检测结果。
3 结果对于免疫组化染色过程, 提出了主要的应对措施以及科学合理的建议。
4 讨论因为人体的抗体和抗原之间的结合具有高度的特异性而免疫组织化学正是通过这种原理。
它先将组织或细胞中的某种化学物质提取出来, 以此作为抗原或半抗原, 并通过免疫动物后获得特异性的抗体, 在用抗体去检测组织或细胞中的同类的抗原物质。
由于免疫组化技术是一个貌似单一的技术, 但其中千变万化的环节却很难掌握。
只有在关键的地方达到标准化, 才能取得较好好的检测结果。
现在科技更新较快, 结合大量的临床先进经验要求医护人员熟练的掌握操作技能, 只有认真的规范和严格遵守各项标
准, 才能让免疫组化技术在临床发挥更完善、更彻底、更好的为患者治疗。
参考文献
[1] 李德本, 王涛, 姜骏.免疫组化染色的操作技巧和注意事项.临床与实验病理学杂志, 2011, 27(11):1260-1261.
[收稿日期：2014-04-01 ]。