固定化青霉素酰化酶
戊二醛交联壳聚糖固定化青霉素G酰化酶及其性质研究
活 ６ ／ ） ４ Ｕ ｍＬ 华东理 工 大 学鲁 华 生 物 技术 研 究所
惠赠 ； 其余 试剂 均 为分 析纯 ． ７０ ２０型分光 光度计 ， 上海 精 密科 学仪 器公 司 ；
Ｓ Ｂ一Ⅲ循环水 式多用 真 空泵 ， Ｈ 郑州 长城 科工 贸公 司 ；Ｈ Ｃ水浴 恒温振荡 器 ， Ｓ Ａ— 金坛市恒 丰仪器厂．
酰化 酶显 得尤 为 重要 ． 双功 能试 剂 戊 二 醛 的 醛基
将 壳 聚糖用 去离 子 水 浸 泡 洗 涤 ， 并且 轻 轻 搅 拌 ， 混 匀后静 置 ２ ｈ后抽 滤 ． 理后 壳 聚糖 在不 待 处 同浓度 的戊 二 醛溶 液 中反应 ２ ４ ｈ后 ， 滤 ， ｐ 抽 用 Ｈ
０ １ｇ交联 后 壳 聚糖 置 于不 同 ｐ 盐 浓 度 的 ． Ｈ、 缓 冲 体 系 中 ， 入 一 定 量 的 酶 液． 其 轻 轻 混 匀 加 将 后， 在一定 温度 下反应 一定 时间． 固定 化后 的酶 经
２ １２ 加酶量 对 固定化 的影 响 固定化酶 的活力 ．． 先随着加酶量的增多而升高 ， 酶量为 １０Ｕ时达最 ６ 大 ； 酶 量 继续 加 大反 而 固定 化 效 果 不 理 想 （ 加 图
７５的缓 冲液 淋洗 ３次 ． ．
作 者 简 介 ： 仕 伟 （ ９６ ） 男 ， 东 潍 坊 人 ， 士 ， 师 ， 究 方 向 ： 工 程 程 １７ 一 ， 山 博 讲 研 酶
１４ ６
烟 台大 学学报 （ 自然科 学与工 程版 ） 造成酶 与载体结 合 的能力 降低 ．
第２ ４卷
程仕伟 ， 贾彦 荣 ， 缪 静 ， 慧鸽 屈
（ 东大学生命科学学院 ， 鲁 山东 烟 台 ２４ ２ ） ６ ０ ５
摘 要 ：以戊二醛 为 交联 剂 ， 壳聚糖 为载 体 固定化粪 产碱杆 菌来 源的青 霉 素 Ｇ酰化 酶． 通过
功能化介孔分子筛用于固定化青霉素酰化酶
ＮＣ Ｍ Ｃ ｎ － ＣＦ ｗｅ ｅ ｈ ｇ ｅ ｈ ｎ ｔ ａ ｎ ｔ ｅ ｈ ｄ ｏ ｈ ｌ Ｍ ＣＦ ａ ｄ ＭＣＦ． Ｔｈ ｐ ａ ｅ ｔ ａ ｔｖｔ ｆ — Ｆ ａ ｄ ＨＳ Ｍ ｒ ｉ ｈ ｒ ｔ ａ ｈ ｔ ｏ ｈ ｙ ｒ ｐ ｉ ｃ Ｈ２ ｉ Ｎ— ｎ ｅ ａ ｐ ｒ ｎ ｃｉ ｉｙ ｏ
ｗ ｅ ｅ ｃ ｍ ｐａ ａ ｉ ｌ ｔ ｄｉｄ． Ｔｈｅ ｒ ｓ ｌｓ ｉ ｉａ ｅ ｈａ ｈｅＰＧ Ａ ｏ ｄｉ ａ ｅ ｏ ｈｅ ｈ ｒ ｏ ｒ ｔｖｅｙ ｓ ｕ ｅ ｅ ｕ ｔ ｎｄｃ ｔ ｄ ｔ ｔｔ ｌａ ｎｇ ｒ ｔ ｎ ｔ ｙｄｒ ｐｈｏ ｃ ＣＨ ２一 ＣＨ — ＣＦ ， ｏ ｂｉ Ｍ
（ ｙ Ｌ ｂ ｒ ｔ ｒ ｆ Ｅ ｅ ｇ ｏ ｒ ｅ ｎ ｈ ｍｉ ｌＥ ｇ ｎ ｅ ｉ ｇ，Ｎｉｇ ｉ Ｕ ｉｅ ｓｔ Ｋｅ ａ ｏ ａ ｏ ｙ ｏ ｎ ｒ ｙ Ｓ ｕ ｃｓ ｄ Ｃ ｅ ｃ ｎ ｉｅ ｒｎ ａ ａ ｎ ｘ ａ ｎ ｖ ｒｉ ｙ，Ｙ ｎ ｈ ａ ５ ０ １ ｈｎ ） ｉｃ ｕ ｎ ７ ０ ２ ，Ｃ ｉａ
Ｎ — Ｆ Ｃ ＭＣ 、Ｃ 一 ＣＨ ＭＣ 和 ＨＳＭＣ Ｈ — Ｆ — Ｆ对 Ｐ Ａ 的负 载 速 率 高 于 具 有 亲 水 性 的 Ｈｚ — Ｆ 和 ＭＣ ； 固定 化 酶 Ｇ Ｎ ＭＣ Ｆ Ｐ Ａ／ Ｃ ＭＣ 和 Ｐ ／ Ｇ Ｎ － Ｆ ＧＡ ＣＨ２ Ｃ ＭＣ 的 表 观 活 性 分 别 为 １ ９ Ｕ／ 一 Ｈ— Ｆ ７ ０Ｉ ｇ和 １６ Ｕ／ ，明 显 高 于 Ｐ ６ ７Ｉ ｇ ＧＡ／ Ｆ ＭＣ 。 关 键 词 ： 孔 材 料 ；功 能 化 ；青 霉 素 酰化 酶 ；固定 化 介
Ａｂ ｔａ ｔ ｓ ｒ ｃ ：Ｏｒ ａ ｉ ｆ ｎ ｔ ｎ ｌ ｅ ｓ ｐ ｒ ｕ ｔ ｒａ Ｍ ＣＦ ｗｉ ｉ ｙ 一 ＣＨ — ＣＨｚ ， ｃ ａ ｏ （ ＣＮ ） ｍｉ ｏ ｇ ｎ ｃ ｕ ｃ ｉ ａ ｉ ｄ ｍｅ ｏ ｏ ｏ ｓ ｍａ ｅ ｉｌＲ— ｏ ｚ ｔ ｖｎ ｌ（ ｈ ） ｙｎ 一 ，ａ ｎ
固定化青霉素酰化酶在双水相体系中催化合成氨苄西林
摘
要： 通过 研 究氨 苄 西林 、一 基 青 霉 烷 酸 （－ Ａ） Ｄ＿ 甘 氨 酸 甲 酯 （ － Ｇ ６氨 ６ＡＰ 和 苯 Ｄ Ｐ ＭＥ 在 聚 乙二 醇 （ Ｅ 和 不 同盐 ） Ｐ Ｇ）
组 成 的双 水 相 体 系（ ＴＰ ） 的分 配行 为 ， 立 了一 个 由 Ｐ Ｇ－０ ０ 一２ ） 硫 酸 铵 （ 一１ ） 成 的 双 水 相 Ａ Ｓ中 建 Ｅ ４０ （ ０ 和 ５ 组
风 海 德 尔 公 司 ） 聚 乙 二 醇一０ Ｐ Ｇ ４ ０ Ｍｒ ， ４ ０（ Ｅ 一０ ， 一
３ ０ ６ ， 海浦 东 高 南 化 工 厂 ， 析 纯 ） 聚 乙二 ７ ￣４ ０ 上 分 ，
醇～０ ０ Ｐ Ｇ－０ ０ Ｍ ０ ～４５０ 上 海浦 东高 ４ ０ （ Ｅ ４ ０ ， 一３５ ０ ０ ， 南化工 厂 ， 析纯 ） 正 硅 酸 乙 酯 （ 分 ， 上海 化 学 试 剂 公
体 系． 此 体 系 中 ， 苄 西 林 的 分 配 系数 为 ５ ０ ６ＡＰ 和 Ｄ— 在 氨 ． ，－ Ａ ＰＧＭＥ 的 分 配 系数 分 别 为 ｌ ７和 １ ４ ＿ ． ．以环 氧 基 功 能
化介孔分子筛 Ｓ Ａ １ Ｂ 一５为载 体 固定 青 霉 素酰 化 酶 （ ｅ ｉｌｎＧ Ａ ｙａｅ Ｐ Ａ） 并 在 双 水 相 体 系 中催 化 合 成 氨 苄 西 Ｐ ｎｃ ｌ ｃｌｓ， Ｇ ， ｉｉ 林 ， 率 为 ８ ， 过 ４ 次 的连 续 合 成 ， 率提 高到 ９ ， 产 Ｏ 经 批 产 ８ 而在 水 相 体 系 中酶促 合 成 氨 苄 西 林 的 产 率仅 为 ２ ． ７
２０ Ｐ ２ ０ Ｃ型 ｘ 射线 粉 末衍 射仪 ， 国 Ｍｉ ｏ ｒ ｉ 美 ｃ ｍｅｉｃ ｒ ｔｓ
纯度为 ９ ， ｒ Ａｅａ ８ ＡＩ ｓｒ公 司 ） 青 霉 素 酰 化 酶 ａ ，
青霉素酰化酶固定化工艺浅析
回收 率 ＝ 固定 化 酶 活 总量 ， 结合酶活总量 ：
酶 固定 在 一 些 坚 固 耐 磨 的 载 体 ． 能够反复 多次使用 ， 减 少 酶 的用 量 和 酶 对 下 游 产 品 的 污 染 ． 节约分离 费用 ． 减 少 对 刺 激 性化学 品的需求 ， 在 温和 、 无 环 境 污染 的 条 件 下 完 成 化 工 医 药 生产 ． 从 而 实 现绿 色化 学 ， 有 助 于保 护 环 境 。 经 固定 化 的 酶 与 游 离 酶 相 比具 有 稳 定 性 高 、 回 收方 便 、 易与反应体系分离 、 可多次反复使 用 、 成本低廉 等优点 ． 可 以有 效 防 止 对 产 物 的 蛋 白污染 和微 生 物 污 染 等 。 具 有 非 常 广 阔的 发 展 前途 。
时 间为 ２ ４ ｈ ～ ２ ８ ｈ 表 ２ 固定 化 时 间 对 固定 化 酶 活 及 回收 率 的 影 响
时 间
ｈ
２ ０ ２ ４
２ ８
产 品的性能 、 质量 及成本等有 直接影响 的工序 ， 固 定 化 效 果 的好 坏 直 接 影 响 了产 品 收 率及 酶 的使 用 效 果 。固定 化 酶 应 用
序 号 残 余 酶 液 结 合 酶 活 固定 化 酶 活
酶活 Ｉ ｌ ／ ｒ ｎ ｌ 总量 Ｍｕ
１ ３． ８ ２ ０ ８ ． ３ ４
主 要 研 究 内容 生 物 工 程 酶 是 一 种 可 使 生 物 降解 的蛋 白质 ，
它可以提高生产效率 、 降 低 成 本并 生 产 出 更 优 质 的 产 品 。青 霉 素 酰 化 酶 可 用 于 制 备半 合 成 青 霉 素 的关 键 中 间 体 ６ 一 氨 基 青霉烷酸 （ ６ － Ａ Ｐ Ａ） ， 青 霉 素 Ｇ钾 盐 在 青 霉 素 酰 化 酶 的作 用 下
青霉素酰化酶的固定化与应用新进展
Ｐｈ ｒ ｃ ｕ ｉａ ｇ ｎ ｅ ｉｇ．Ｎａ ｊ ｇＵｎｖ ｒｉｙｏ ｃ ｎ ｌｇ Ｎａ ｊ ｇ ２ ０ ９ ａｍａ ｅ ｔ ｌ ｃ Ｅｎ ｉｅ ｒｎ ｎｉ ｉｅｓｔ ｆＴｅ ｈ ｏｏ ｙ， ｎ ｎｉ １ ０ ； ｎ ０
摘 要 ： 青 霉 素 酰化 酶 被 广 泛 应 用 于 半 合 成 抗 生 素 及 中间 体 的 制 备 、 性 药 物 的拆 分 和 多 肽 合 成 等 方 面 。 效 固定 青 霉 素 酰 化 手 高 酶 能 提 高酶 对 温 度 、Ｈ 值 、 剂 极 性 等方 面 的 适 用 性 和 反 复 使 用 的稳 定 性 ， 成 为 拓 宽 青 霉 素 酰 化 酶 在 工 业 中应 用 的 必 然 选 择 和 ｐ 溶 将 关键 。 文 主 要 介 绍 了青 霉 索酰 化酶 固定 化 技 术 的 进 展 ， 论 了 不 同 固 定 化 技 术 的 特 点 和 固 定 化 酶在 非水 相体 系 中 的催 化 作 用 ， 本 讨 并
２ Ｓｔ ｅ Ｋｅ ｂ ａｔ ｒ ａ ｅ ｉｌ — ｉｎｔ ｄ Ｃｈｅ ｉａｌＥｎ ｎｅ ｒｎ ａｔ ｙ Ｌａ ｏｒ ｏ ｙ ｏｆＭ ｔ ｒａ ｓ Ｏｒｅ ｅ ｍ ｃ ｇｉ ｅ ｉｇ，Ｃｏｌｅ ｅ ｏｆＭ ａ ｅ ｉｌ ｃｅ ｅ ｌｇ ｔ ｒａ Ｓ ｉｎｃ
ａ ｄ Ｅｎ ｉｅ ｒｎ ｎ ｇ ｎ ｅ ｉｇ，Ｎａ ｊ ｇ Ｕｎｖ ｒ ｉ ｆＴｅ ｈ ｏｏ ｙ， Ｎａ ｊｎ １ ０ ９ ｎｉ ｉｅ ｓｔ ｏ ｃ ｎ ｌｇ ｎ ｙ ｎｉｇ ２ ０ ０ ）
酶固定化实验报告
一、实验目的1. 了解酶固定化的原理和方法。
2. 掌握酶固定化过程中的关键步骤。
3. 分析固定化酶的性能及其影响因素。
二、实验原理酶固定化是将酶固定在固体载体上，使其在反应过程中保持活性，便于重复使用。
固定化酶具有以下优点：1. 提高酶的稳定性，延长酶的使用寿命。
2. 降低酶的生产成本，提高生产效率。
3. 方便酶的分离和回收，减少环境污染。
三、实验材料1. 酶：青霉素酰化酶（PGA）2. 固定化载体：海藻酸钠、明胶、壳聚糖等3. 试剂：NaCl、CaCl2、HCl、NaOH、磷酸盐缓冲液等4. 仪器：恒温水浴、pH计、分光光度计、移液器、离心机等四、实验步骤1. 酶的活化将青霉素酰化酶溶于磷酸盐缓冲液，调节pH值为7.0，在37℃下活化30分钟。
2. 载体的准备将海藻酸钠、明胶、壳聚糖等载体分别溶解于磷酸盐缓冲液中，制备成浓度为1%的溶液。
3. 酶的固定化将活化后的酶与载体溶液混合，搅拌混合均匀。
将混合液滴入CaCl2溶液中，使酶与载体形成凝胶珠。
4. 固定化酶的洗涤用磷酸盐缓冲液反复洗涤固定化酶凝胶珠，去除未固定的酶和杂质。
5. 固定化酶的活化将洗涤后的固定化酶凝胶珠放入磷酸盐缓冲液中，在37℃下活化30分钟。
6. 酶活性的测定采用比色法测定固定化酶的活性。
以青霉素G为底物，在37℃下反应30分钟，用紫外分光光度计测定反应液中的青霉素G浓度，计算酶活性。
7. 固定化酶的稳定性测试将固定化酶凝胶珠分别在不同温度、pH值、离子强度等条件下进行稳定性测试。
五、实验结果与分析1. 酶的固定化效果通过比色法测定，固定化酶的活性与游离酶活性相近，表明固定化过程未对酶活性产生显著影响。
2. 固定化酶的稳定性固定化酶在不同温度、pH值、离子强度等条件下均表现出良好的稳定性，表明固定化酶具有良好的耐温、耐酸碱、耐盐等性能。
3. 固定化酶的重复使用性固定化酶经过多次反应和洗涤后，仍保持较高的酶活性，表明固定化酶具有良好的重复使用性。
青霉素酰化酶的固定技术分析
青霉素酰化酶的固定技术分析作者：高磊来源：《中国科技博览》2014年第11期论文摘要：文章讨论了不同固定化技术的特点和固定化酶在非水相体系中的催化作用，并展望了固定化青霉素酰化酶的发展前景。
一、青霉素酰化酶的固定化方法固定方法的选择是酶与载体固定过程的关键步骤。
载体固定通常有吸附法、包埋法和共价偶联法；无载体固定法常用无载体交联酶和交联酶聚集体两种。
1 、载体固定法吸附法通过载体表面与酶表面次级键互相作用固定，可分为物理吸附和离子吸附。
物理吸附要求载体表面对蛋白质有高吸附性。
离子吸附是利用酶解离状态2、无载体固定法（1）交联酶晶体（CLECs）晶体晶格中蛋白质浓度接近理论极限，浓缩的蛋白形成晶体，通过戊二醛等多功能试剂将酶永久交联，分子中静电反应和疏水反应数量增加，明显增强了蛋白质的稳定性。
交联酶晶体可用于多肽合成、酶传感器、化妆品和洗涤剂等需要高稳定性和高活性蛋白质的领域，应用前景广泛。
（2）交联酶聚集体（CLEAs） CLEAs的活性和稳定性可与CLECs相媲美。
在CLEAs制备中，浓缩的酶蛋白会发生物理聚集而形成超分子结构，加入无机盐、有机溶剂或其他大分子试剂可使其聚集体沉淀析出，能保持酶的三维构象和活性。
再用多功能交联剂将该酶聚集体交联捆绑形成CLEAs。
CLEAs催化的高效转化率和高效可循环再利用的特点，有利于实现固定化青霉素酰化酶的工业应用价值。
二、不同菌属青霉素酰化酶的固定化条件不同菌属所产青霉素酰化酶可能对应不同的固定化条件。
大规模生产青霉素G酰化酶的菌种有巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）、埃希菌属大肠埃希菌（Escherichia coli）、雷氏普罗威登菌（Providencia rettgeri）和粪产碱杆菌（Alcaligenes faecalis）等，尤以前两种最常见。
产青霉素V酰化酶的菌种多为淡紫链霉菌（Streptomyces lavendulae）、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、球形杆菌（Bacillus sphaericus）和气单胞菌属（Aeromonas）等。
青霉素G酰化酶的改造和固定化研究的开题报告
青霉素G酰化酶的改造和固定化研究的开题报告一、选题背景及意义青霉素G是一种具有广谱抗菌活性的β内酰胺类抗生素，在医学和兽药领域被广泛应用。
但是，青霉素酰基水解酶的存在限制了其使用范围和药效，因此寻找革新青霉素酰化技术的方法显得尤为重要。
而酰化酶的改造和固定化则成为了当前较为研究的方向与方法。
二、研究目的本研究的目的在于通过改造青霉素G酰化酶的活性位点，构建出具有高活性和产率的工程菌，并通过固定化技术，提高酰化酶的稳定性与重复使用性，从而实现合成高纯度、高质量的青霉素G。
三、研究内容和方法1.青霉素G酰化酶的建模与分析。
利用生物信息学和分子模拟等方法，根据已知的结构信息和功能位点，建立青霉素G酰化酶的三维结构模型，分析酶的结构特征和作用机制。
2.酶的改造与筛选。
利用线性和平面的改造方法改变酶的活性位点，经过筛选与优化，得到具有高活性和稳定性的新型青霉素G酰化酶。
3.青霉素G的合成实验。
选取酰化酶的最佳条件，苯丙酸（或其酯）和青霉素G为底物，通过化学合成制备合成前体，最终通过提纯得到高纯度、高质量的青霉素G。
4.酶的固定化实验。
通过将酰化酶固定在载体上，如Nylon 6和聚乙烯醇（PVA）等，使其具有更好的稳定性和重复利用性。
并在不同的操作条件下，比较固定化酶和游离酶的酰化效率、产率和稳定性差异。
四、研究预期结果1.成功建立青霉素G酰化酶的三维结构模型，分析了其结构和功能特点。
2.通过改造酶的活性位点，筛选出具有高活性和高稳定性的酯化酶，并合成了高纯度、高质量的青霉素G。
3.通过固定化实验，得到具有更高稳定性和重复利用性的酰化酶。
五、研究进度安排1.前期准备和文献调研：一周。
2.酶的结构建模与分析：两周。
3.酶的改造和筛选：三周。
4.青霉素G的合成实验：三周。
5.酶的固定化实验：两周。
6.结果分析和论文撰写：两周。
7.答辩准备和论文修改：一周。
总计实践时间：14周。
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以琳固定化青霉素酰化酶
由于β-内酰胺类抗生素（β-lactam antibiotics）广谱的抗菌作用，使得这类抗生素在临床上得到了广泛的应用。
随着各类青霉素衍生物：如苄青霉素（Benzylpenicillin）、阿莫西林（Amoxicillin）、福米西林（formidacillin）等在医疗上的广泛应用，半合成（semisynthetic)β-内酰胺母核的需求量已经超过了青霉素。
目前PGA 主要用于水解青霉素G生成6-氨基青霉烷酸（6-APA）及苯乙酸，然后催化母核和不同的侧链间的合成反应生成半合成的β－内酰胺类抗生素，生物催化合成半合成的β－内酰胺类抗生素在工艺要求、产率、经济效益及环保方面都优于化学法，因此人们在这一方面进行了深入和细致的研究。
早在50 年代初就有人发现，黄青霉Q176（PenicillinmChrysoyeumn）和米曲霉（Aspergillus.oryzae）中存在水解青霉素成为6-APA的酶，即青霉素酰化酶（Penicillin acylase）青霉素G 酰化酶主要有两种来源，革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，其中四种来源于革兰氏阴性菌的PGA（大肠杆菌青霉素酰化酶、类粪产碱杆菌青霉素酰化酶、雷氏普罗威登斯菌青霉素酰
化酶、克莱博氏菌青霉素酰化酶）已经克隆到大肠杆菌中进行了重组表达,并测定了序列。
青霉素酰化酶根据其底物的专一性不同，可分为三种：（1）优先水解青霉素G 的叫青霉素G 酰化酶（PGA），（2）优先水解青霉素V的叫青霉素V 酰化酶（PVA），（3）专一水解氨苄西林的氨苄青霉素酰化酶。
青霉素是一种胞内酶，PGA由α，β亚基组成，PGA 的两亚基通过轻键作用结合在一起。
单独的α亚基和β亚基均不具有酶的活性，只有当两者以适当的形式结合后才具有活性。
PGA的α亚基与青霉素的侧链结合，决定酶的底物专一性；β亚基包含催化位点以及与催化有关的残基。
固定化青霉素G酰化酶
本产品大肠基因工程菌发酵产生，通过分离、纯化，然后以共价键的形式结合到多孔性颗粒状高分子聚合物载体上，制成的固定化酶使用稳定性好，酶蛋白不易脱落。
菌株:大肠杆菌
E C号:3.5.1.11
外观: 白色或浅黄色颗粒
活性（28℃湿酶）: 100~130U/g
颗粒大小:100-300μm
固定化形式:共价键连接
标准:企标
储存:在4°C，隔绝空气下，密闭储存
用途：
（1）工业应用生产抗生素母核。
例如6-APA,7-ADCA,。