第五章微生物酶的工业提取
酶的生产
限量
<40mg/kg <10mg/kg 3mg/kg 不准含有 <5 ×104 不准含有 不准含有 <100 不准含有 <30
∆
培养基成分
C源：碳素是菌体成分的主要元素，是细胞贮藏物质
和各种代谢物的骨架，还是能量的主要来源。
酶制剂生产上使用的菌种大都是利用有机碳的异养型微生物。 有机碳主要来源：
一是农副产品中如甘薯、麸皮、玉米、米糠等淀粉质原料及 其水解物； 二是野生的如土茯苓、橡子、石蒜等淀粉质资源。 此外，目前研究以石油产品中12-16碳的成分等作碳源.如 以某些嗜石油菌生产蛋白酶、脂酶均已获得成功
产酶促进剂：
于培养基中添加某种少量物质，能显著提高酶 的产率，这类物质叫产酶促进剂。 大体上分为两种： 一是诱导物 二是表面活性剂。如吐温-20的浓度为0.1%时， 能增加许多酶的产量。表面活性剂可能是： （1）增加细胞的通透性； （2）改善氧的传递速度； （3）保护酶活性。通常用非离子型表面活性剂如聚 乙二醇、聚乙烯醇衍生物、植酸类、焦糖、羧甲 基纤维素、苯乙醇等。离子型的表面活性剂对微 生物有害，同时表面活性剂还必须对人、畜无害。
S17，厨房空气中 分离S56，马铃薯 中分离
S114 AS1.357
蛋白酶 L-天门 冬酰胺 酶
目前工业用主要酶的生产菌来源
微生物类 别
菌 名
产生 的酶
葡萄 糖异 构酶 碱性 蛋白 酶 异淀 粉酶
用途
所用菌号分离筛 选来源
D-80,酸泡菜中 分离 209，河南省平 顶山制革晒生皮 场地的土壤中分 离
目前主要商品酶制剂及其来源
葡萄糖氧化酶 半纤维素酶 橙皮苷酶 菊粉酶 脂肪酶 黑曲霉、生机青霉、尼崎青霉 黑曲霉 黑曲霉 假丝酵母、曲霉属 黑曲霉、米曲霉、圆柱状假丝酵母、根 毛霉、无根毛霉、小球菌、类地青霉、 胰脏、山羊舌腺等
第五章 微生物工程的代谢调节和代谢工程
二、酶活性的调节
代谢调节是指在代谢途径水平上酶活性 和酶合成的调节。 酶活性调节： 激活剂→酶激活作用； 抑制剂→酶抑制作用； 可以是外源物，也可是自身代谢物。
1、酶激活作用与抑制作用
微生物代谢中，普遍存在酶既有激活作 用又有抑制作用的现象。 如：天门冬氨酸转氨甲酰酶受ATP激活， 受CTP抑制（终产物）。 大肠杆菌糖代谢过程中，许多酶都有 激活剂和抑制剂（表5-1）。共同控制糖 代谢。
酶的共价修饰。
生产目的：高浓度地积累人们所期望的产物。 办法：①育种，得到根本改变代谢的基因突变株；
②控制微生物培养条件，影响其代谢过程。 代谢工程：利用基因工程技术，扩展和构建、连接，形 成新的代谢流。（也称途径工程）
一、微生物的代谢类型和自我调节
1.代谢类型：分解代谢和合成代谢。 相互关联，相互制约。 细胞优先合成异化可维持更快生长的化合物 的酶。利用完后，再合成下一个酶。 2.微生物自我调节部位： ①细胞膜的屏障作用（多数亲水分子）和通道； ②控制通量，调节酶量和改变酶分子活性； ③限制基质的有形接近，可存在于不同细胞 器各个代谢库中，其酶量差别大。
价连接物（腺苷酰基）。
五、能荷调节
细胞的能荷计算式：
[ATP]+1/2[ADP] 能荷=—————————— [ATP]+ [ADP]+[AMP]
能荷高时，ATP的酶合成系统受抑制， ATP消耗酶系统被活化。 呈抑制与活化的中间状态的能荷大约是 0.85，此时两种酶系统达到平衡。
六、代谢调控
根据代谢调节理论,通过改变发酵工艺条 件(温度、PH、风量、培养基组成)和菌 种遗传特性，达到改变菌体内的代谢平 衡，过量产生所需产物的目的。 1.发酵条件的控制 2.改变细胞透性 3.菌种遗传特性的改变
脂肪酶的微生物生产技术综述
脂肪酶的微生物生产技术综述脂肪酶是一类催化脂肪水解的酶，在工业生产中具有广泛的应用。
传统的生产方法主要依赖于动物源脂肪提取，但存在成本高、工艺复杂等问题。
近年来，随着微生物生产技术的发展，利用微生物生产脂肪酶成为一种新的制备方法。
本文将对脂肪酶的微生物生产技术进行综述。
脂肪酶的微生物生产技术可以分为两大类：传统培养法和发酵工程法。
传统培养法主要是利用微生物本身产生的脂肪酶，在培养基中添加一定的诱导物质，刺激脂肪酶的合成。
常用的微生物有大肠杆菌、毕赤酵母、真菌等。
通过优化培养基成分、培养条件等因素，可以提高脂肪酶的产量和活性。
发酵工程法主要是通过基因工程手段改造微生物，使其能够高效表达目标脂肪酶的基因。
一般而言，利用真菌、大肠杆菌等基因工程菌株进行转基因技术的研究较多。
基因工程技术可以精确控制脂肪酶基因的表达，从而实现高效产酶。
同时，通过对菌株进行改造，还可以改善酶的稳定性、抗脂肪酸的能力等性能。
在微生物生产脂肪酶的过程中，存在一些关键技术需要克服。
首先是选择适宜的菌株。
不同的菌株对酶的产量和产酶条件有一定的要求，需要根据具体情况选择适宜的菌株。
其次是培养条件的优化。
如温度、pH值、培养基成分等因素对微生物生长和脂肪酶合成有重要影响，需要进行合理的调控。
此外，脂肪酶的分离纯化技术也是关键环节，通常采用离心、超滤、柱层析等方法进行分离纯化。
微生物生产脂肪酶的技术具有许多优点。
首先，可以避免对动物的依赖，减少对环境的影响，同时可持续生产，降低制备成本。
其次，基因工程技术的应用使得脂肪酶的产量和活性大幅度提高，可以满足工业需求。
此外，微生物生产脂肪酶的过程相对简单，易于规模化生产。
总之，微生物生产脂肪酶是一种新的制备方法，具有广阔的应用前景。
在今后的研究和开发中，需要进一步提高产酶菌株的稳定性和活性，改进酶的纯化技术，同时探索更多种类的微生物用于生产脂肪酶。
相信随着技术的发展，微生物生产脂肪酶的工艺将得到进一步完善和优化。
酶的生产与分离纯化
重要
（3） 碳氮比 在微生物酶生产培养基中碳源与氮源的比例是
随生产的酶类、生产菌株的性质和培养阶段的 不同而改变的。 一般蛋白酶 (包括酸性、中性和碱性蛋白酶) 生 产采用碳氮比低的培养基比较有利，例如黑曲 霉3.350酸性蛋白酶生产采用由豆饼粉3.75 %、 玉 米 粉 0.625% 、 鱼 粉 0.625% 。 NH4Cl 1% 、 CaCl2 0.5%、Na2HP04 0.2%、豆饼石灰水解液 10%组成的培养基；
2.2.2.3 液体深层发酵的工艺控制
酶的发酵生产中发酵效果除了受到菌种产酶性能的影响外，还 受到发酵温度、pH、溶氧量等条件的影响。
(1) 温度对产酶的影响 发酵温度的变化主要随着微生物代谢反应、发酵中通风、搅
拌速度的变化而变化的。微生物在生长发育中，不断地吸收 培养基营养成分来合成菌体的细胞物质和酶时的生化反应都 是吸热反应；培养基中的营养物质被大量分解时的生化反应 都是放热反应。发酵初期合成反应吸收的热量大于分解反应 放出的热量，发酵液需要升温。当菌体繁殖旺盛时，情况则 相反，发酵液温度就自行上升，加上通风搅拌所带来的热量， 这时，发酵液必须降温，以保持微生物生长繁殖和产酶所需 的适宜温度。
重要
不同的细胞对各种氮源的要求各不相同，应根据 要求进行选择和配制。一般来说，动物细胞要求 有机氮，植物细胞主要要求无机氮。多数情况下 将有机氮源和无机氮源配合使用才能取得较好的 效果。例如黑曲霉酸性蛋白酶生产，只用铵盐或 硝酸盐为氮源时，酶产量仅为有胨时的30%。只 用有机氮源而不用无机氮源时产量也低，故一般 除使用高浓度有机氮源外尚需添加1%用以基因工程为主的现代分子生物学技术，选育
菌种、增加酶产率和开发新酶种。因此，下面将主要介绍微 生物发酵法产酶的一般原理和工艺。
辅酶发酵提取工艺(一)
辅酶发酵提取工艺(一)辅酶发酵提取工艺简介•辅酶发酵提取工艺是一种在生物制药领域应用广泛的技术。
•它利用微生物代谢过程中产生的辅酶来增强药物的纯度和活性。
•辅酶发酵提取工艺已成为现代制药行业中重要的生产技术之一。
工艺流程1.选取高产辅酶的微生物菌种。
–通过筛选和培养，选取出产量高、稳定性好的微生物菌株。
–常用的菌株包括大肠杆菌、酿酒酵母等。
2.制备种子液。
–在合适的培养基中培养高产辅酶的微生物菌株，获得菌量充足的种子液。
–种子液中含有大量的活性酶和对辅酶产生有利的代谢产物。
3.发酵过程。
–将种子液接种至发酵罐中，控制好发酵温度、pH值和氧气供应等条件。
–发酵过程中微生物菌株产生的酶能够有效地转化底物成为目标产物。
4.提取纯化。
–通过离心、过滤和萃取等方法，将发酵液中的细胞残渣和杂质去除。
–进一步采用硅胶柱层析、凝胶过滤等技术，提高目标产物的纯度。
5.产品包装与贮存。
–将纯化后的目标产物进行包装和标记，确保产品质量和安全。
–根据产品特性和使用需求，选择适当的贮存条件和包装方式。
应用领域•制药领域：辅酶发酵提取工艺广泛应用于药物的生产和制备过程中。
•食品工业：辅酶可以增强食品的口感、香味和色泽，提高产品品质。
•化妆品：某些辅酶在化妆品中具有保湿、抗衰老等功效，通过发酵提取可以得到更高纯度的辅酶。
优势与挑战•优势：–提高产量：辅酶发酵提取工艺能够增加目标产物的产量，提高生产效率。
–改善品质：通过辅酶发酵提取，可以获得更高纯度、更活性的目标产物。
–环保可持续：相比传统化学合成方法，辅酶发酵提取具有更低的能耗和排放，更具可持续性。
•挑战：–工艺优化：改善发酵条件、提高产量和纯度仍然是工艺优化中的挑战。
–菌种选育：寻找更高产和更稳定的微生物菌株仍然是一个艰巨的任务。
–成本控制：提高辅酶发酵提取工艺的经济效益仍然需要进一步研究和实践。
结语辅酶发酵提取工艺在生物制药领域发挥着重要作用，它提高了生产效率、改善了产品品质，并具有较低的环境影响。
5 发酵产物的分离纯化
不适用热敏性的物质
3、等电点法
调节溶液pH至等电点处，可使两性电解质所带净电荷为 零，相邻分子之间由于没有静电斥力而趋于沉淀。 适用于氨基酸、蛋白质和其他两性物质的沉淀分离。
4. 凝聚和絮凝法
原理：电解质将胶体粒子表面上的电荷中和，减少存在于 胶体粒子间的静电斥力，使范德华力占优势，这样胶体就
会凝聚成较大、较密实的粒子（凝聚）。
萃取和扩张床吸附等方法。
影响发酵液固-液分离的主要因素：菌体的大小、形状及发 酵液的黏度，还有发酵液的温度、pH值、加热时间等。
1. 过滤 定义：用过滤介质将悬液中的固形颗粒与液体分离的过程。 常用的过滤方式：加压过滤和真空过滤 典型设备主要有：板框压滤机和鼓式真空过滤机
（1）板框压滤机
1）优点：
三、发酵液预处理的方法
1. 重力法 2. 热处理法
3.等电点法
4. 絮凝法
1. 重力法
在工业上用的较多的主要是离心和过滤
过滤常用板框真空吸滤或电动筛等，离心和过滤能否顺利
进行取决于很多因素。 一般温度高，压力大，发酵液粘度小，滤布选用适当，助 溶剂适宜，搅拌都可以提高过滤速度。
2、加热法
降低悬浮液的黏度，除去某些杂蛋白，降低悬浮物的最终 体积，破坏凝胶状结构、增加滤饼的空隙度。
原理：将细胞放在高渗透压的介质中，达到平衡后，介质
被突然稀释，或者将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压
的突然变化，水迅速进入细胞内，引起细胞壁的破裂。 特点：较温和的一种破碎方法，操作也简单。
应用：仅对细胞壁较脆弱的菌，或者细胞壁预先用酶处理，
或合成受抑制而强度减弱时才是合适的。
②增溶法:
原理：利用某些化学试剂如有表面活性剂等，增加细胞壁 或膜的通透性，而使细胞破碎的方法。 该法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的结构与组成。 常用的表面活性剂有SDS、Triton X-100，有机溶剂有乙醇、 异丙醇、盐酸胍和尿素。
第五章微生物的营养
有机氮
氮源
无机氮
作用：合成细胞中的含氮物质；提供生理活动所需的能量。
在缺糖条件下，某些厌氧细菌能以氨基酸为能源物质：三功能营 养物 = 氮源 + 碳源 + 能源
按对氮源的要求不同，微生物可分为：
固氮微生物
利用空气中的N2合成自身所需的氨基酸及蛋白质 代表：根瘤菌、固氮蓝菌、固氮菌
渗透压与等渗培养液
渗透压：恰好能阻止渗透发生的施加于溶液液面上方的额外 压强称为渗透压。与溶液中不能通过半透膜的微粒数目和 温度有关。 指溶液中溶质 微粒对水的吸 引力
半透膜只允许 溶剂通过而不 允许溶质通过。 细胞膜
渗透压与等渗培养液
等渗：胞内外溶质的渗透压相近。 高渗：胞外溶质的渗透压 >胞内。 低渗：胞外溶质的渗透压<胞内。
（2）根据物理状态分类 1）液体培养基 定义：不加凝固剂的的液态培养基。 用途：大规模工业生产及在实验室用于不需要挑选 单克隆的大规模养菌。水处理中的废水即可以看作 液体培养基。
2）半固体培养基 定义：液体培养基中加入0.2-0.7%的凝固剂形成的 培养基。 用途：常用于观察细菌的运动、厌氧菌的分离和菌 种鉴定等。
化能自养型 无机物 （化能无机营养型）
无机物
无机碳
化能异养型 有机物 （化能有机营养型）
有机物
有机碳
绝大多数细菌和全部 真核微生物
以供氢体分：
无机营养型：以无机物为氢供体。 有机营养型：以有机物为供氢体。 以生长因子的需求分： 原养型或野生型：不需要从外界吸收任何生长因子。 营养缺陷型：需要从外界吸收一种或几种生长因子。 以取食方式分： 渗透营养型：通过细胞膜的渗透和选择吸收作用从外界吸收营 养物质。
微生物的发酵与产酶过程
微生物的发酵与产酶过程微生物的发酵与产酶过程是一种重要的生物技术，在食品工业、药品制造以及环境保护等领域扮演着重要角色。
微生物发酵通过利用微生物的代谢作用，将有机废弃物转变为有用的化合物，产酶则是指微生物在发酵过程中产生并分泌的特定酶类。
本文将从微生物发酵和产酶的定义、发酵与产酶的应用以及发酵与产酶的前景等方面来探讨微生物的发酵与产酶过程。
一、微生物发酵和产酶的定义微生物发酵是指在合适的条件下，利用微生物的代谢活动，通过控制发酵过程，获得所需产物的一种生物技术。
微生物发酵一般分为液态发酵和固态发酵两种形式。
液态发酵常用于大规模工业生产，而固态发酵则更适用于小规模生产和特定产品的制备。
产酶是微生物在发酵过程中分泌的特定酶类，这些酶能够催化特定底物的转化反应。
产酶的种类很多，包括脂肪酶、蛋白酶、纤维素酶等。
这些酶在医药、食品、化工等行业中具有重要的应用价值。
二、发酵与产酶的应用1. 食品工业中的应用微生物发酵在食品工业中被广泛应用。
例如，嗜酸乳杆菌可以发酵牛奶，制成酸奶。
酸奶中的乳酸菌有助于改善肠道菌群，增强人体免疫能力。
此外，假丝酵母菌的发酵可以产生酵母、面包、啤酒等食品。
2. 药品制造中的应用微生物发酵在药品制造中也起到重要的作用。
通过微生物发酵，可以产生多种药用物质，如抗生素、肽类药物等。
其中，青霉素是一种广泛应用的抗生素，通过青霉菌的发酵生产得到。
3. 环境保护中的应用微生物发酵还可以应用于环境保护领域。
例如，利用微生物发酵处理有机废弃物，可以将废物转化为有机肥料或生物柴油。
这种方法不仅能减少废弃物对环境的污染，还能获得可再利用的资源。
三、发酵与产酶的前景微生物的发酵与产酶技术在许多领域都显示出广阔的应用前景。
随着科学技术的不断发展，微生物的发酵与产酶技术也在不断创新和改进。
以下是展望微生物发酵与产酶技术的几个发展方向。
1. 高效产酶菌株的筛选与改造在微生物发酵过程中，寻找和改造高产酶菌株是提高产酶效率的关键。