PCR检测记录表
基因扩增荧光定量检测记录表
实验日期：检测项目：Linegene保存文件名：
使用说明
1、严格按单一流向进行实验，即试剂准备区（1区）→样本处理区（2区）→扩增分析区（3区），严禁逆向。本记录表的流向亦遵循此流程；
2、各项目执行后在相应项目前的方框内打√；
3、实验室内温度为15～30℃为合格范围；
4、实验后对实验室的清洁与消毒方法参见“PCR实验室清洁程序”，实验后次日关闭通风设备和移动紫外灯；
5、实验结束后，将标本的检测结果登记至标本记录本上以备查询。本记录表保存在归档文件夹中，存放在实验室文件柜中，保存2年；
6、Linegene扩增仪中结果保存于D盘对应实验日期的文件夹中，如2004年4月的结果保存于“D：\2004\04\”中，每月底将当月资料备份于软盘中，保存2年。
实时荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光基团，利用荧光信号来实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板浓度进行定量分析。 其特点有： (1)用产生荧光信号的指示剂显示扩增产物的量，进行实时动态连续的荧光监测，避免终点定量的不准确性，并且消除了标本和产物的污染，且无复杂的产物后续处理过程。 (2)荧光信号通过荧光染料嵌入双链DNA，或荧光探针特异结合木得检测物等方法获得，打打提高了检测的灵敏度、特异性和精确性。Real-time O-PCR可以应用于mRNA表达的研究、DNA拷贝数的检测、单核苷酸多态性的测定、细胞因子的表达分析、肿瘤耐药基因表达的研究以及病毒感染的定量监测。 实时荧光定量PCR技术的基本原理 在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光基团，这些荧光物质有其特定的波长。仪器可以自动检出，利用荧光信号积累，实时监测整个PCR进程，在PCR 循环中，测量的信号将作为荧光阈值的坐标。并且引入一个——Ct值（Threshold cycle）概念，Ct值是指产生可被检测到得荧光信号所需的最小循环数，是在PCR 循环过程中荧光信号由本底开始进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。 荧光阈值相当于基线荧光信号的平均信号标准偏差的10倍。一般认为在荧光阈值以上所测出的荧光信号是一个可信的信号，可以用于定义一个样本的Ct值。通常用不同浓度的标准样品的Ct值来产生标准曲线，然后计算相对方程式。 方程式的斜度可以用来检查PCR的效率，所有标准曲线的线性回归分析需要存在一个高相关系数（R2＞0.99），这样才能认为实验的过程和数据是可信的，使用这个方程式计算出未知样本的初始模板量。实时荧光定量PCR仪都有软件，可以从标准曲线中自动地计算出未知样本的初始模板量。 实时荧光定量PCR技术的应用 1. 基因工程研究领域 ①基因表达研究：对β地中海贫血症患者β与γ珠蛋白mRNA水平进行检测，其结果特异性强、定量准确，为了解β地中海贫血的分子病理机制及其临床诊断提供了可靠的检测数据。 ②转基因研究：利用两种发光探针及适当的循环阈值，扩增一个转移后的基因和一个对照基因，以分析转基因老鼠接合性。该方法为45个转基因动物的同型结合及异质结合提供了明确的鉴定结果。通过实时定量PCR检测，同型结合的异质接合动物交配后其子代中转基因的传递情况符合孟德尔遗传规律。这项技术在转基因动物繁育及基因剂量功能效应实验中将有很大的用途。
《食品安全学》综述 PCR快速检测技术综述 1．前言 聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍，是肉眼能直接观察和判断；可从一根头发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。过去几天几个星期才能做到的事情，用PCR几个小时便可完成。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。 该酶促反应最基本的3个环节是：[1]模板DNA的变性，即在94℃下模板双链DNA变为单链DNA；[2]引物与模板链的特异性复性；[3]引物链的延伸。 2.研究的目的与意义 聚合酶链反应（PCR）技术建立以来，定性技术不断改进和完善，可以达到检测单个靶序列的水平、但实际工作中常需要定量检测标本中核酸，而不是某一特定序列存在与否，借助PCR对基因快速、敏感、特异而准确定量成为目前分子生物学技术研究的热点之一。定量PCR旨在评估样品中靶分子数，此测定可以是绝对的，如每微克样本中靶DNA的分子数；也可以是相对定
量，即与设定的内参照或外参照比较而言。鉴于PCR方法主要有5个，即对PCR产物的直接定量、极限稀释法、靶基因与参照基因的同步扩增、竞争性PCR和荧光定量PCR[1]。这几种放啊各有利弊，对其选择取决于靶基因的特性、对PCR产量的期望值、对准确度的要求、需要相对还是绝对定量。 人类对于核酸的研究已经有100多年的历史。20世纪60年代末70年代初，人们致力于研究基因的体外分离技术。但是，由于核酸的含量较少，一定程度上限制了DNA的体外操作。Khorana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想。但是，当时的基因序列分析方法尚未成熟，对热具有较强稳定性的DNA聚合酶还未发现，寡核苷酸引物的合成仍处在手工、半自动合成阶段，这种想法似乎没有任何实际意义。 1985年，美国科学家Kary Mullis在高速公路的启发下，经过两年的努力，发明了PCR技术，并在Science杂志上发表了关于PCR技术的第一篇学术论文。从此，PCR技术得到了生命科学界的普遍认同，Kary Mullis也因此而获得1993年的诺贝尔化学奖。 但是，最初的PCR技术相当不成熟，在当时是一种操作复杂、成本高昂、“中看不中用”的实验室技术。1988年初，Keohanog通过对所使用的酶的改进，提高了扩增的真实性。尔后，Saiki 等人又从生活在温泉中的水生嗜热杆菌内提取到一种耐热的DNA聚合酶，使得PCR技术的扩增效率大大提高。也正是由于此酶的发现使得PCR技术得到了广泛地应用，使该技术成为遗传与分子生物学分析的根本性基石。在以后的几十年里，PCR方法被不断改进：它从一种定性的分析方法发展到定量测定；从原先只能扩增几个kb的基因到目前已能扩增长达几十个kb的DNA片段。到目前为止，PCR技术已有十几种之多，例如，将PCR与反转录酶结合，成为反转录PCR，将PCR 与抗体等相结合就成为免疫PCR等。 3.国内外研究现状 3.1. 基础研究方面的应用 目前从事分子生物学的实验室和研究人员，几乎每天都在使用PCR，可以说几乎没有一个分子生物学家没有使用过PCR。因此，PCR与分子克隆一样是分子生物学实验室的常规方法，可用于达到以下目的： [1] 扩增目的基因和鉴定重组子； [2]克隆基因； [3]基因功能和表达调控的研究； [4]基因组测序； [5]制备单链模板； [6]致突变； 3.2. PCR在临床上的应用[2] [1]在遗传学上的应用：人类的遗传性疾病是因为某一碱基序列发生了突变，使之缺失或形成某一限制性内切酶的识别位点，通过PCR结合限制片段长度多态性分析（PCR-RFLP），就可以从基因的水平对遗传性疾病进行分析。例如，血友病甲是一种常见的遗传性出血性疾病，患者体内缺乏凝血因子FVIII这是由于基因第14个外显子的第336位氨基酸的编码基因发生了突变，产生了一个新的PstI酶切点，因此可以使用PCR-RFLP对血友病进行诊断。PCR还可以用来检测遗传性耳聋和Leber遗传性视神经病。 [2]在肿瘤研究中的应用：PCR已日益广泛应用于肿瘤的病因与发病机理研究以及肿瘤诊断与治疗的研究中。例如，差异显示PCR技术能针对不同肿瘤寻找其特异而敏感的标志物，并用于肿瘤早期诊断、判断预后及疗效评估。另一方面，在使用普通放疗、化疗的同时可结合定量PCR 技术检测微小残留病灶，以进一步改进治疗方案。此外，由于癌症的发生在一定意义上是单个细胞分子发生变化，因而可以使用单细胞PCR技术对癌症的发病机理进行研究。
许昌学院食品与生物工程学院2015-2016学年第一学期《现代食品检测技术》课程论文 PCR技术在食品检测中的应用
PCR技术在食品检测中的应用 许昌学院食品与生物工程学院，河南许昌461000 传统检测食品中微生物的方法主要是分离和培养鉴别，该方法操作繁琐，有些微生物很难培养。尤其是针对检测食品中的弱势菌，使用传统的方法基本无法检测出来。聚合酶链式反应（PCR）是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，由于它可以将微量的DNA大幅增加的特点，所以能够比较准确地检测食品中微生物。本文主要介绍PCF技术的操作原理和目前运用到食品检测中的几种具体的PCR技术特点，包括：多重PCR技术、实时荧光定量PCF检测技术、免疫PCR检测技术。并且对PCR技术在食品检测方面予以展望，为解决食品安全问题和相关食品检测做出导向作用。 关键词：食品检测；微生物培养；聚合酶链式反应；食品安全问题
、、■ 刖言 食品⑴是指原料不经加工或经过加工或改变性状、具有一定营养价值、对人体无害、可供人类食用的物质。它不仅富含营养成分和水等物质更容易滋生微生物，而且它能最直接的与人体接触，进入人体的消化系统，所以食品安全问题[2-4] 不容轻视。现代食品行业，在生产、运输、销售过程中有很多有害的微生物，这将严重危害食品的品质和人们的健康，甚至会引起一些严重的疾病。现代食品检测技术⑸是对食品按其原定用途进行制作和食用时不会使消费者受到伤害的一种担保。为保证食品安全急需一些快速、敏感、特异的检测方法，以及时发现致病菌，控制污染及其可能对人体健康产生的危害。PCR检测技术具有敏感性、 特异性、简便、快速的优点，现已广泛应用于微生物检测，尤其对培养困难的细菌检测和抗原结构复杂的细菌鉴定方面，具有常规方法无法比拟的优越性。 随着分子微生物学和分子化学的飞速发展，对病原微生物的鉴定已不再局限于对它的外部形态结构及生理特性等一般检验上，而是从分子生物学水平上研究生物大分子，特别是核酸结构及其组成部分。在此基础上建立的众多检测技术中，尤其是聚合酶链反应（PCR）成为世人瞩目的生物技术革命的新产物，已逐步应用于食品的检测，具有广阔的发展前景。 1 PCR技术的原理 PCR是在体外人为控制的合适条件下，以单链DNA或RNA为模板，以1 对人工合成的寡核苷酸序列为引物，在耐热Tap DNA聚合酶作用下特异性扩增基因片段的技术。整个反应过程除了需要加入待扩增的DNA片段和两个决定特 异性的引物外，还需加入适量的缓冲液、四种脱氧核糖核苷酸溶液（dNTP）、Tap DNA聚合酶、Mg2+等。每个PCR循环包括模板DNA变性、模板DNA与引物的退火（复性）、引物的延伸3个基础步骤。反应时，首先将靶DNA双链加热变性为单链状态，然后降低溶液温度，加入2段人工合成的与靶DNA端邻序列互补的寡核苷酸片段作为引物，即左端引物和右端引物，使合成引物在低温下与其靶序列特异配对，形成部分双链。然后，在Tap DNA聚合酶和4种dNTP 底物存在的情况下，引物沿模板DNA链（靶DNA单链）按5 '末端向3 '末端方向延伸，自动合成新的DNA双链，新合成的DNA片段又可作为扩增的模板。如此重复改变温度，由高温变性、低温复性、和适温延伸组成一个周期，每个周
PCR及其改进技术在食品检测中的应用Application of PCR and PCR improved technology for detection in foods 刘辉1，杨利平1，2，张滨1* Liu Hui1,Yang Liping1,2,Zhang Bin1* （1．长沙环境保护职业技术学院，长沙410004；2．湖南师范大学生命科学学院，长沙410081） (1.Changsha Environmental Protection and Professional technique College,Changsha410004,China; 2.Department of life science,Hunan normal university.Changsha410081,China) 摘要：在介绍传统PCR的基础上，简介实时定量PCR、多重PCR、PCR-DGGE等几种常用的PCR改进技术在食品检测方面的应用。 关键词：PCR改进技术；传统PCR；食品检测 Abstract:The methods were rapidly upgraded for detection in foods when the factors of food-pollution became more and more complicated.PCR improved technology gradually replace the role of traditional PCR for detection in foods.In this paper,we introduced the application of three PCR improved technologies for detection in foods on the base of introducing traditional PCR. The three PCR improved technologies include real-time PCR,MULTIPLEX-PCR and PCR-DGGE. Key words:Traditional PCR;PCR improved technology;Detection in 近年来,随着我国社会经济的快速发展，人们的生活得到很大改善，对食品质量的要求也越来越高。加入WTO以后，国外对我国出口食品的质量要求也越来越严格。食品安全是一个重大的世界性公共卫生问题，随着食品生产的工业化和新技术、原材料、新产品的采用，食品污染的因素日趋复杂，因此食品安全检测的方法也需日新月异。自从1985年问世以来，PCR（Polymerase Chain Reaction）技术因其灵敏、快速、操作简便的优点，在食品检测领域具有广泛的应用。但是传统PCR检测技术一直面临着假阳性污染和定量准确度两大难题，用传统的PCR检测技术都依赖于各种不同类型的PCR后处理过程，而这些处理过程很容易使数量巨大的PCR产物飞散到空气中形成气溶胶，使PCR假阳性污染成为可能，而且电泳所用染色剂EB（溴化乙锭）为强烈致癌物质，容易危害操作者的健康。近年来，PCR改进技术在食品检测中的应用研究得越来越多，本文将简介几种PCR改进技术在食品检测中得应用研究进展。 1传统PCR技术在食品检测中的应用及其缺点 PCR（Polymerase Chain Reaction）技术即聚合酶链式反应技术，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。该技术自从1985年问世以来，最早应用于基因克隆和转基因检测，但由于其精确、微量的特点，已经广泛应用到其他领域。随着对一些主要食品微生物遗传性质了解的逐渐深入，许多致病菌的遗传背景进一步明了，PCR技术在食品检测中也逐渐显示出其应用前景[1]。近年来，PCR技术在食品检测中的应用主要体现在如下几个方面： 基金项目：长沙环境保护职业技术学院生物化学精品课程建设项目资助（项目编号：？） 作者简介：刘辉(1976-),女,长沙环境保护职业技术学院讲师。Email:? *通讯作者，张滨
实验五 PCR扩增技术与琼脂糖凝胶电泳检测 一、实验目的 1. 掌握PCR扩增技术的基本原理 2. 掌握PCR的常规操作 3. 熟悉PCR反应体系中几种主要成分的作用 4. 了解PCR技术的应用 5. 掌握琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的方法 6. 熟悉DNA在电泳过程中迁移率的决定因素 二、实验原理 1. PCR基本原理 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于在体外快速扩增DNA，类似DNA的细胞内复制过程:由一对引物介导，通过温度的调节，使双链DNA变性为单链DNA、单链DNA能与引物复性（退火）成为引物-DNA单链复合物、以及在dNTPs存在下DNA聚合酶能使引物沿单链模板延伸成为双链DNA（引物的延伸）；这种热变性-复性-延伸的过程，就是一个PCR循环；一般通过20-30个循环之后，就可获得大量（106倍）的要扩增的DNA片段。 PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成： ①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； ②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； ③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。 重复循环“变性—退火—延伸”三个过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 2. PCR反应体系 3. 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳是分离、纯化、鉴定DNA片断的典型方法，其特点为简便、快速。DNA 片断琼脂糖凝胶电泳的原理与蛋白质的电泳原理基本相同，DNA分子在高于其等电点的pH 溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。DNA分子在电场中通过介质而泳动，除电荷效应外，凝胶介质还有分子筛效应，与分子大小及构想有关。对于线形DNA分子，其电场中的迁移率与其分子量的对数值成反比。在凝胶中加入少量溴化乙锭（有毒！），其分子可插入DNA的碱基之间，形成一种光络合物，在254~365nm波长紫外光照射下，呈现桔红色的
PCR 技术的种类及其应用 1 PCR 技术的基本原理 PCR 技术是在模板DNA、引物和四种dNTP等存在的条件下, 依赖于DNA聚合酶(T aq 酶)的酶促合成反应。其具体反应分三步：变性、退火、聚合。以上三步为一个循环，每一循环的产物DNA又可以作为下一个循环模板，数小时后，介于两个引物之间的目的DNA得到了大量的复制，经25～30次循环DNA数量可达2×106～7拷贝数。 2PCR技术的种类 2.1 反向PCR( Inverse PCR, IPCR)技术 原理：反向PCR是克隆已知序列旁侧序列的一种方法．主要原理是用一种在已知序列中无切点的限制性内切酶消化基因组I)NA．后酶切片段自身环化．以环化的DNA作为模板，用一对与已知序列两端特异性结合的引物，扩增夹在中间的未知序列。该扩增产物是线性的DNA片段，大小取决于上述限制性内切酶在已知基闲侧翼DNA序列内部的酶切位点分布情况。用不同的限制性内切酶消化，可以得到大小不同的模板DNA，再通过反向PCR获得未知片段。 该方法的不足是：①需要从许多酶中选择限制酶，或者说必须选择一种合适的酶进行酶 切才能得到合理大小的DNA片段。这种选择不能在非酶切位点切断靶DNA。②大多数有核基因组含有大量中度和高度重复序列，而在YAC或Cosmid中的未知功能序列中有时也会有这些序列，这样，通过反向PCR得到的探针就有可能与多个基因序列杂交。 2.2锚定PCR(Anchored PCR, APCR)技术 用酶法在一通用引物反转录cDNA3’-末端加上一段已知序列, 然后以此序列为引物结合位点对该cDNA进行扩增, 称为APCR。 应用：它可用于扩增未知或全知序列, 如未知cDNA的制备及低丰度cDNA文库的构建。 2.3不对称PCR(asymmetric PCR)技术 两种引物浓度比例相差较大的PCR技术称不对称PCR。在扩增循环中引入不同的引物浓度, 常用50～100÷1比例。在最初的10～15个循环中主要产物还是双链DNA, 但当低浓度引物被消耗尽后, 高浓度引物介导的PCR反应就会产生大量单链DNA。 应用：可制备单链DNA片段用于序列分析或核酸杂交的探针。 2.4反转录PCR(reverse transcription, RT- PCR)技术 当扩增模板为RNA时, 需先通过反转录酶将其反转录为cDNA才能进行扩增。RT - PCR应用非常广泛, 无论是分子生物学还是临床检验等都经常采用。 2.5修饰引物PCR技术 为达到某些特殊应用目的, 如定向克隆、定点突变、体外转录及序列分析等, 可在引物的5’-端加上酶切位点、突变序列、转录启动子及序列分析结合位点等。 2.6巢式PCR(NEST PCR)技术 先用一对靶序列的外引物扩增以提高模板量, 然后再用一对内引物扩增以得到特异的PCR带, 此为巢式PCR。若用一条外引物作内引物则称之为半巢式PCR。为减少巢式PCR的操作步骤可将外引物设计得比内引物长些, 且用量较少, 同时在第一次PCR时采用较高的退火温度而第二 次采用较低的退火温度, 这样在第一次PCR时, 由于较高退火温度下内引物不能与模板结合, 故只有外引物扩增产物, 经过若干次循环, 待外引物基本消耗尽, 无需取出第一次PCR产物, 只需降低退火即可直接进行PCR扩增。这不仅减少操作步骤, 同时也降低了交叉污染的机会。这种PCR称中途进退式PCR( drop-in, drop-out PCR)。上述三种方法主要用于极少量DNA模板的扩增。 2.7等位基因特异性PCR(Allele- specificPCR, ASPCR)技术 ASPCR依赖于引物3’- 端的一个碱基错配,不仅减少多聚酶的延伸效率,而且降低引物-模板复合物的热稳定性。这样有点突变的模板进行PCR扩增后检测不到扩增产物,可用于检测基因点突变。 2.8单链构型多态性PCR(single- strandconformational polymorphism PCR, SSCPPCR)技术SSCP- PCR是根据形成不同构象的等长DNA单链在中性聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率变化来
机房设备、系统运行及维护记录表 机房管理员：检查月份：年月 检查日期及时间：日点分（第周） 机房环境 温度（10～30℃）□正常□异常噪声（30～120dB) □正常□异常 湿度（30～80%）□正常□异常环境洁净程度□正常□异常 LIS服务器 电源正常工作，无损毁 □正常□异常风扇正常运转□正常□异常情况 磁盘读写正常，报警灯 □正常□异常设备声音是否正常□正常□异常不闪亮 设备表面、风扇口、电 源网格无灰尘、杂物， □正常□异常内部系统运行正常□正常□异常 无污渍、锈蚀 CIS服务器 电源正常工作，无损毁 □正常□异常风扇正常运转□正常□异常情况 磁盘读写正常，报警灯 □正常□异常设备声音是否正常□正常□异常不闪亮 设备表面、风扇口、电 □正常□异常内部系统运行正常□正常□异常源网格无灰尘、杂物， 无污渍、锈蚀 HIS服务器 电源正常工作，无损毁 □正常□异常风扇正常运转□正常□异常情况 磁盘读写正常，报警灯 □正常□异常设备声音是否正常□正常□异常不闪亮 设备表面、风扇口、电 源网格无灰尘、杂物， □正常□异常内部系统运行正常□正常□异常 无污渍、锈蚀 PACS服务器 电源正常工作，无损毁 □正常□异常风扇正常运转□正常□异常情况 磁盘读写正常，报警灯 □正常□异常设备声音是否正常□正常□异常不闪亮 设备表面、风扇口、电 源网格无灰尘、杂物， □正常□异常内部系统运行正常□正常□异常 无污渍、锈蚀 财务、农合服务器 电源正常工作，无损毁 □正常□异常风扇正常运转□正常□异常情况 磁盘读写正常，报警灯 □正常□异常设备声音是否正常□正常□异常不闪亮 设备表面、风扇口、电□正常□异常内部系统运行正常□正常□异常
ctDNA检测技术 循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)来源于肿瘤细胞的凋亡、坏死或分泌产生的DNA片段，是循环游离DNA(circulating cell-free DNA,cfDNA)的一部分[1]。ctDNA含有与其来源肿瘤DNA同样的基因缺陷，如点突变，重排，扩增等[2]；其在血液中的半衰期短，可实时反映肿瘤的动态变化[3];作为液体活检的一种，可克服组织活检中由于肿瘤异质性带来的缺陷，检测更全面[4],因此ctDNA的检测可用于癌症早期诊断与癌症分期、肿瘤的疗效评估、复发监测和预后判断等[5]。由ctDNA的质量和数量变化大, 因此需要高特异性和高灵敏度的检测方法。目前常用的方法有数字PCR (digital PCR, dPCR)、BEAMing (bead, emulsion,amplification and magnetic)、高通量测序(next generation sequencing, NGS)、ARMS等[6]。 1.数字PCR 1999年V ogelstein等提出了数字PCR(digtal PCR,dPCR)的概念[7]。数字PCR包括两部分，即PCR 扩增和荧光信号分析。先将是样品稀释后分配到大量微小的反应单元中，每个单元包含或不包含一个或多个拷贝的目标分子,然后分别对目标分子进行扩增，扩增结束后对每个反应单元的荧光信号进行采集。数字PCR 采用直接计数的方法进行定量分析,有荧光信号的反应单元中至少包含一个拷贝的目标分子，记为1，无荧光信号的则即为0，理论上，在样品中极限稀释的情况下，有荧光信号的反应单元数目等于目标DNA 分子的拷贝数。但是有的反应单元中可能包含两个或两个以上的目标分子，这时需要用泊松概率分布公式进行计算[8]。不同于传统的qPCR技术,数字PCR 不受扩增曲线的循环阈值(C T) 和扩增效率的影响，无需参照，准确性和重复性好，可实现绝对定量分析[9]。 根据反应单元类型不同，数字PCR分为三类:微反应室/ 孔板数字PCR、微流控芯片和微滴数字PCR系统。微反应室/孔板数字PCR借助高通量自动上样设备和增加的反应单元数,实现快速精确取样，提高检测灵敏度。微流控芯片技术是一种基于含有数千个超高密度亲疏水微孔芯片的dPCR平台，可实现高通量、低成本分析。微滴数字PCＲ( droplet digital PCＲ,ddPCR)是将含有目标分子的样品分成成千上万个纳升级的油包水微滴，再对每个微滴进行扩增，和荧光信号的采