SNP开发验证的研究方法和技术路线
snp基因芯片原理
snp基因芯片原理SNP基因芯片原理引言:随着基因组学和生物技术的快速发展，人类对于基因及其与疾病关联性的研究也越来越深入。
SNP（Single Nucleotide Polymorphism，单核苷酸多态性）是一种常见的基因变异形式，它在人类遗传变异中占据重要地位。
为了研究SNP与疾病之间的关系，科学家们开发了SNP基因芯片，它是一种高通量、高灵敏度的分子生物学工具。
本文将详细介绍SNP基因芯片的原理以及应用。
一、SNP基因芯片的定义及分类SNP基因芯片是一种利用高通量平行杂交技术检测SNP位点的工具。
根据其设计原理和应用领域的不同，SNP基因芯片可以分为两类，即基于探针的SNP芯片和基于测序的SNP芯片。
1. 基于探针的SNP芯片基于探针的SNP芯片利用DNA探针与待测样品中的基因组DNA 序列特异性杂交的原理，通过检测杂交信号来识别不同基因型。
这种芯片设计简单、成本较低，适用于小规模的SNP检测。
2. 基于测序的SNP芯片基于测序的SNP芯片采用高通量测序技术，可以直接测定待测样品中的SNP位点。
这种芯片设计复杂、成本较高，但可以同时检测数百万个SNP位点，具有更高的灵敏度和准确性。
二、SNP基因芯片的工作原理SNP基因芯片的工作原理主要包括芯片设计、杂交反应、信号检测和数据分析四个步骤。
1. 芯片设计芯片设计是SNP基因芯片的关键步骤。
首先，需要确定待测SNP 位点的基因型信息，包括目标基因型和野生型等。
然后，根据基因型信息设计一组特异性的DNA探针，这些探针可以与待测样品中的目标SNP位点特异性杂交。
2. 杂交反应杂交反应是SNP基因芯片的核心步骤。
将待测样品中的DNA与芯片上的DNA探针进行杂交反应，使其结合形成DNA双链。
杂交反应的条件包括温度、时间和缓冲液成分等，需要根据具体实验要求进行优化。
3. 信号检测信号检测是SNP基因芯片的关键步骤。
通过荧光染料或放射性同位素等标记探针，使其与芯片上的杂交DNA结合，形成信号。
基因组学中的SNP分析
基因组学中的SNP分析SNP（Single Nucleotide Polymorphism）是指基因组中的单个核苷酸突变。
SNP分析是基因组学研究中的重要分析方法之一，为了更好地了解SNP分析在基因组学中的作用，我们需要从以下几个方面进行逐步的了解。
一、SNP的特征SNP是常见的继承性遗传变异，主要发生在基因组中7-10%的位置。
它具备许多有价值的特征，例如高度多态性、共有性基因性和容易鉴定性等。
SNP的多态性使其成为研究人类及其他物种遗传标记的优良素材。
SNP基于其出现的频率可以分为高频和低频。
高频SNP在人类人群中具有普遍性，低频SNP在某些群体中出现的频率很低。
SNP在基因组中的位置也非常有规律，即位于编码区、非编码区、隐形区，以及转录因子结合区等重要区域中。
二、SNP分析的方法SNP分析的方法根据分析的目的和数据场景不同，可以分为不同的方法。
常见的SNP分析技术包括测序分析、芯片分析和PCR分析等。
测序分析是快速发展的分析技术，包括全基因组测序和目标基因测序两种。
芯片分析是目前应用比较广泛的SNP分析技术，可快速、准确地进行大规模的SNP检测。
PCR分析适用于单个SNP的检测和测序后验证，具有快速、灵敏度高、操作简单等优点。
三、SNP分析的应用SNP分析在基因组学中的应用非常广泛，主要应用于以下几个方面：1、研究遗传多样性SNP在人群中的频率不同，可以用于描述人类、动植物的遗传多样性，推断人类或种群的出现时间及演化过程等。
2、研究遗传病理学SNP分析也可用于研究不同类型的疾病和病态的发生机制，便于快速准确地识别和分析疾病易感性基因。
3、研究药理学SNP分析也可以帮助研究药物代谢方面的基因，寻找药物作用机制、筛选新药等。
4、研究育种学SNP不仅可应用于人类、动植物的遗传多样性研究中，还可以帮助育种与遗传改良中研究重要基因资源。
四、SNP分析的未来SNP分析虽然已经在基因组学研究中得到了广泛的应用，但随着科技的不断进步，SNP分析的应用范围将会更广泛。
SNP检测方法
基于SNPs 研究的单倍型图谱计划
寻找标记SNPs 的国际遗传变异图谱计划，即国际 单倍型图谱计划(Haplotype Map Project)已于2002 年10 月正式启动，2003 年中国承担了“国际单倍 型图谱计划”10% 的任务。 HapMap 计划的目标在于，确定人类基因组中普通 模式的DNA 序列变异，通过测定序列变异特征、变 异频率、它们之间的关联，绘出人类基因组的单倍 型块，以及不同单倍型块的标记SNPs 。
SNP检测技术
理想的检测SNPs的方法
——发现未知的SNPs，或检测已知的SNPs
必须具备以下优点: (1) 适合自动化操作,简便、迅速; (2) 分析费用低,特殊试剂用量少; (3) 反应要严紧,即使不纯的样品也可得到可靠的结果; (4) 数据分析简单,易于自动化分析; (5) 反应的通量要大而灵活,一天可以完成几百，甚至到上百万个样品的 检测与分析。
SNP应用前景
1、人类学研究中的应用：人类进化、不同人群、 民族之间的关系、人类的起源、人类的迁移等（例 如Y染色体SNP分型）。 2、遗传病的诊断和疾病的关联分析。 3、疾病相关基因的定位和克隆。 4、法医学中的个体识别和亲权鉴定。 5、个体化疾病预防，真正进入预防医学时代。 6、药物基因组学的应用：新药设计与发明，个体 化疾病治疗与用药。
单核苷酸多态性 （SNP）
林壹明 2011/5/9
主要内容
一、SNP概念、分类与特点 二、SNP检测技术 三、SNP研究现状 四、SNP应用前景
SNP概念
SNP(single nucleotide polymophism) 即单核苷酸 多态性，是指群体中变异频率大于1 %的单个核苷酸 改变而导致的核酸序列多态性，包括转换、颠换、缺 失和插入。但是比较常见的是转换和颠换，大约占 80%。 一般来说，一个 SNP 位点只有两种等位基因，因此 又叫双等位基因。SNP在人基因组中的发生频率比较 高，大约平均每1000个碱基中就有一个多态位点。
SNP检测工艺(建工)
原理图
单链构象多态性()
原理：单链 在中性条件下会形成二级结构，不同的 二级结构在电泳中会出现不同的迁移率。这种二级结构依赖 于碱基的组成，单个碱基的改变也会影响其构象，最终会导 致在凝胶上迁移速度的改变。
一、 经典检测方法
一大类是以凝胶电泳为基础的传统经典的检测方 法,如:
. 限制性片段长度多态性法 ;
.单链构象多态性法 ;
. 变性梯度凝胶电泳 (
);
.等位基因特异性 ( , )等等
方法
原理：利用限制性内切酶的酶切位点的特异性， 用两种或两种以上的限制性内切酶作用于同一片 断，如果存在位点，酶切片断的长度和数量则会 出现差异，根据电泳的结果就可以判断是否位 点。
变性条件产生差异, 从而在凝胶上形成不同的条
带。
等位基因特异 ( )
原理：根据 位点设计特异引物,其中一条链(特 异链)的′末端与 位点的碱基互补(或相同) , 另一条链(普通链)按常规方法进行设计,因此 技术是一种基于的标记。因为特异引 物在一种基因型中有扩增产物,在另一种基因型中没 有扩增产物,用凝胶电泳就能够很容易地分辨出扩增 产物的有无,从而确定基因型的 。
测 序和序列比较, 以确定所研究的碱基是否变异, 其
检 出率可达。
特点：可以得到 的类型及其准确位置等分 型所需要的重要参数。
基因芯片技术( )
原理:是将具有特定碱基序列的探针固定在特殊的 载体上，待测基因经提取、荧光标记后，与固定好 的探针进行杂交，最后根据荧光的强度和种类测出 待测序列的碱基类别。
度不同的原理,通过梯度变性胶将 片段分开
SNP技术
二、双脱氧链终止法
DNA核苷酸序列分析
Sanger 双 脱 氧 链 终 止 法
三、DNA自动测序
采用荧光替代放射性核素标记是实现DNA 序列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四 种双脱氧核苷酸，然后进行Sanger测序反应，反
应产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，
通过四种激光激发不同大小DNA片段上的荧光 分子，使之发射出四种不同波长荧光，检测器采 集荧光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。
基因芯片(gene chip)
•DNA芯片(DNA chip) •cDNA芯片(cDNA chip) 是指将许多特定的DNA片段或cDNA片 段作为探针，有规律地紧密排列固定于单位
面积的支持物上 。
蛋白质芯片
蛋白质芯片(protein chip)
是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点 阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反
DNA自动测序结果举例
遗传修饰动物模型的建立 及应用
The Establishment and Application of Heredity-Modified Animal Model
一、转基因技术
转基因技术
采用基因转移技术使目的基因整合入受精 卵细胞或胚胎干细胞，然后将细胞导入动物子 宫，使之发育成个体。 转基因——被导入的目的基因 转基因动物(transgenic animal)
一个SNP表示在基因组某个位点上一个核 苷酸的变化，可以是转换，也可是颠换。 具有转换型变异的SNP约占SNP总量的2/3， 这是因为胞嘧啶是人类基因组中最易发生 突变的位点，其中大多数是甲基化，可自 发脱氨基形成T。 位于染色体上某些区域的一组相关联的 SNP等位位点称为单倍型，相邻SNPs的等 位位点倾向于以一个整体遗传给后代。
基因组snp遗传多样性分析流程
基因组snp遗传多样性分析流程基因组SNP遗传多样性分析流程1. 样本准备和DNA提取- 收集研究对象的样本,如植物、动物或人类样本- 从样本中提取高质量、高纯度的DNA2. 基因组测序- 利用高通量测序技术(如Illumina测序或纳米孔测序)对DNA样本进行全基因组测序- 获得大量原始测序数据3. 数据质控和过滤- 对原始测序数据进行质量评估和过滤- 去除低质量reads和接头序列等- 得到高质量的clean reads4. 比对参考基因组- 将clean reads比对到参考基因组序列上- 使用生物信息学工具(如BWA或Bowtie2)进行比对5. 变异检测- 基于比对结果,使用变异检测软件(如GATK或Samtools)检测SNP 和InDel等变异位点- 生成变异位点文件(VCF格式)6. 变异过滤- 根据变异质量值、缺失率、深度等参数对变异位点进行过滤- 去除低质量或可疑的变异位点7. 群体结构分析- 利用过滤后的SNP数据,分析种群或群体的遗传结构- 使用软件如STRUCTURE、ADMIXTURE或PCA等进行群体分层和聚类分析8. 遗传多样性分析- 计算各群体或种群的遗传多样性指数,如等位基因多样性、杂合度等- 评估不同群体间的遗传分化程度9. 选择压力分析- 基于SNP数据,检测是否存在遗传hitchhiking或选择性扫除的信号- 识别可能受到正向或负向选择作用的基因或基因组区域10. 关联分析- 对表型数据(如性状或疾病状态)与SNP数据进行关联分析- 鉴定与目标性状或疾病相关的基因或SNP位点11. 结果可视化和解释- 使用统计图表和绘图工具对分析结果进行可视化展示- 综合解释遗传多样性、群体结构、选择压力和关联分析结果12. 报告撰写- 总结分析过程和主要发现- 撰写科学论文或报告,描述研究目的、方法、结果和讨论该流程适用于利用SNP数据分析物种或群体的遗传多样性、群体结构、选择压力和基因型-表型关联等,是基因组学研究的重要环节。
使用生物大数据技术进行SNP关联分析的方法与工具推荐
使用生物大数据技术进行SNP关联分析的方法与工具推荐随着生物学研究的不断发展，基因组学数据的积累和可用性不断增加。
其中，单核苷酸多态性（SNP）是一类广泛存在于基因组中的遗传变异，是研究复杂性疾病和个体差异的重要标记。
SNP关联分析是一种常用的研究方法，可以帮助我们识别与疾病发展或生物表型相关的SNP。
本文将介绍使用生物大数据技术进行SNP关联分析的方法和一些推荐的工具。
这些工具可以加快分析过程并提供丰富的数据可视化和解释。
一、SNP数据预处理进行SNP关联分析之前，首要任务是预处理SNP数据。
这包括数据清洗、格式转换、去除无关变异和处理缺失数据等步骤。
常用的SNP数据预处理工具包括PLINK、VCFtools和GATK等。
1. PLINK（Purcell et al., 2007）是一个功能强大的工具集，用于进行基因组关联分析。
它可以处理各种格式的SNP数据，包括PED/MAP、BED等，并提供了丰富的数据处理和统计分析功能。
2. VCFtools是一个专门用于VCF格式（Variant Call Format，常用于常见SNP格式）的SNP数据处理工具。
它可以用来过滤、格式转换、计算遗传群体统计信息等。
3. GATK（Genome Analysis Toolkit）是一个广泛使用的工具包，用于分析高通量测序数据。
它可以进行SNP/Indel检测、变异质量评估、基于家系或群体的SNP筛选等。
二、SNP关联分析SNP关联分析是通过比较个体的基因型和表型来寻找与表型相关的SNP。
这一步骤通常涉及人群结构分析、关联测试和多重比较校正等。
1. 人群结构分析可以帮助去除由于人群混合导致的伪关联。
常用的人群结构分析工具包括ADMIXTURE和STRUCTURE等。
这些工具可以将样本划分为亚群，并提供每个样本在亚群中的成分比例。
2. 关联测试是判断SNP与表型之间是否存在相关性的关键步骤。
一种常见的关联测试方法是单SNP关联分析，可以使用PLINK、SNPTEST或GEMMA等工具进行。
snp芯片
snp芯片SNP芯片（Single Nucleotide Polymorphism chips）是一种高通量基因分型技术，目前广泛应用于基因组学研究和个体遗传变异的检测。
SNP芯片可以同时检测数千至数百万个单核苷酸多态性位点，从而快速、精准地分析个体间的遗传差异。
SNP（Single Nucleotide Polymorphism）是指基因组中单个核苷酸发生变异的位置。
它们是人类遗传变异中最常见的形式，每个人的基因组中大约有数百万个SNP。
通过对SNP的识别和分析，可以研究个体之间的遗传差异，并且了解这些差异与健康、疾病以及药物反应等方面的关系。
SNP芯片是通过DNA芯片技术实现SNP的检测和分析。
其基本原理是将经过特定设计的探针固定在芯片上，探针可以与特定的SNP序列互相匹配。
然后，样本DNA经过扩增和标记处理，与芯片上的探针进行杂交，并通过荧光等方式进行信号检测。
根据信号的强度，可以确定每个位点上的SNP类型。
SNP芯片的优势在于高通量、高准确性和高效率。
相比传统的基因分型方法，SNP芯片可以同时分析大量SNP位点，大大提高了研究效率。
同时，SNP芯片的准确性也非常高，可以达到99%以上。
此外，SNP芯片还具有良好的可重复性和可比性，可以在不同实验室之间进行数据交流和共享。
SNP芯片广泛应用于基因组学研究、人类遗传学和药物研发等领域。
在基因组学研究中，SNP芯片可以用于遗传关联研究，寻找与疾病或性状相关的SNP位点。
在人类遗传学中，SNP芯片可以用于研究不同人群之间的遗传差异，了解人类种群演化和迁移的历史。
在药物研发中，SNP芯片可以用于个体化药物治疗的研究，根据个体的遗传信息优化药物方案，提高疗效和减少副作用。
然而，SNP芯片也存在一些局限性。
首先，SNP芯片只能检测已知的SNP位点，对于未知或罕见的变异无法检测。
其次，SNP芯片无法检测复杂的遗传变异，如插入缺失、倒位等结构变异。
此外，SNP芯片的解读和分析需要复杂的生物信息学算法和数据库支持，对研究人员的专业水平提出了要求。
SNP突变点检测方法进展( 完整版)
（polymerase chain reaction-sequence specific primer）
1
2 3 4 5
简 特 经 直
便 异 济
准确
观
一般DNA实验室能满足实验 要求
Tagman探针技术（分子信标、分子灯塔） 实时荧光PCR技术 SYBR Green Ⅰ法（结合熔解曲线分析） 芯片分析（微阵列杂交实验技术）
特异性高；
引物设计简单； 反应条件易于优化；
分辨能力高。
随着科技的进步，SNP突变点检测方法在继续改进演 变。我们选择经济实用的技术方法来满足自己所做课题需 求。就目前来说，SNP检测技术手段还有待进一步提高。 科研在呼唤着一种最为理想的SNP检测方法，其能具 备以下优点: 1. 适合自动化操作, 简便快速;
基于PCR
荧光标记检测
相 关 技 术
寡核苷酸连接 分析
基于物理技术
内切酶酶切技 术
其它
单链构象多态性（SSCP） 变性梯度凝胶电泳（DGGE）
变性高效液相色谱分析技术（DHPLC）
(一)PCR-SSCP
1. 基本原理:
经PCR 扩增的目的片段在变性剂或低离子浓度下经 高温处理使之解链并保证在单链状态下,然后在一定浓度 的非变性聚丙稀酰胺凝胶中电泳。相同长度的单链DNA , 可以因其顺序或单个碱基差异,所形成的空间构象就会不 同,其在凝胶中泳动速度不一样,从而显示出带型的差异, 即多态型
20bp
优势
局 限 性
序列多态性座位中大约只有1/3的
碱基涉及限制酶识别序列；
遗传标记系统的个人识别能力有限； 限制酶消化条件较高。
微测序技术（SNaPshot）
焦测序技术（Pyrosequencing）
分子生物学第五章-分子生物学的常规技术(四)SNP及其应用
具有转换型变异的SNP约占SNP总量的2／3左右。
转换的发生率总是明显高于其它几种变异，而 且在CG序列上出现最为频繁，多是发生C—T的转换， 原因是CG中的C是甲基化的，它能自发的脱氨基而替 换为胸腺嘧啶。
一致。
ATP驱动萤光素酶介导的萤光素向氧化萤光素
(oxyluclferin)的转化，氧化萤光素发出与ATP含量成正
比的可见光信号。
光信号由CCD摄像机检测并通过相应的软件得到反映。
每个峰的高度(光信号）与反应中掺入的核苷酸数成正 比，ATP和未掺入的dNTP由双磷酸酶降解，猝灭光信号， 并再生反应体系，加入另一种dNTP进行下一轮反应。随着 以上过程的循环进行，互补DNA链合成，DNA序列信号峰确
SNP的检测方法
单链构象多态性(single-strand conformational polymorphism,SSCP)
原理： 单链DNA的折叠结构是由单核苷酸序列
决定的，当某一个碱基发生突变时，便会直 接影响该链的构象，非变性聚丙烯酰胺凝胶 电泳时迁移率会发生改变。
SNP的检测方法
变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE) 原理:
基因调控区SNP(pSNP)
基因间随机编码区SNP(rSNP)
等三类。
因为编码区内的变异率占周围序列的 1/5，cRNP的总量显著少于其他两类SNPs。
cSNP又可分为2种：
同义cSNP(synonymous cSNP)： 非同义cSNP(non-synonymous cSNP)
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SNP开发/验证的研究方法和技术路线1分子标记：分子标记，我想这部分是我们分子标记组最核心的任务。
现在，我们没有任何可用的标记检测我们的定位材料。
即使想要验证已经定位的QTLs，我们也需要相对应的区间的分子标记，尤其是SNP标记。
1.1 全基因组SNP—Affymetrix芯片：一套完整的全基因组的SNP芯片，相对于Douglas体系，其操作简单，高通量。
可以直接对定位群体进行初定位的扫描或是对育种材料的背景进行分析。
在国家玉米改良中心，有一套3k的Illumina芯片，就是用来对玉米材料进行高通量检测，基因型检测结果通常可以用来QTLs初定位，育种材料的群体划分与纯度鉴定以及低密度的关联分析等。
在此，我建议我们应该开发一套番茄基因型检测的芯片。
目前，只是查找到Illumina芯片有一套全基因SNP信息，包含7,720条探针。
而Affymetrix公司目前并没有相应的产品。
但是通过跟Affymetrix公司了解，可以利用Illumina芯片已有的结果进行开发。
番茄目前测序结果显示其全基因组大小为~760Mb，而玉米为~2,500Mb，但是他们包括的基因数目~30,000个，整体情况相近。
另外，番茄作为自交植物，其LD的衰减值应该更大，有效的历史重组会更少，遗传多样性低。
因此，综合考虑，我建议我们可以开发~3k芯片，应该可以满足大多数研究材料、育种材料的基因型检测需求。
虽然目前下一代测序技术蓬勃发展，但是对于用于基因型检测来讲，其数据分析与成本相对于芯片都要更复杂和更高。
总之，我们番茄处于刚刚发展阶段，我认为就基因型检测方面，芯片有其很高的应用价值。
即使像玉米，这样测序技术发展很多年的材料，芯片技术也在应用。
1.2全基因组SNP—Douglas：当用Affymetrix芯片检测鉴定完番茄基因型并完成基因型分析之后，1）对于优良的QTLs或是基因，我们可以直接选择覆盖整个区间的分子标记运行Douglas系统进行分子标记辅助育种，2）对于需要进一步验证的QTLs，我们也可以利用Douglas系统只检测材料覆盖定位区间的基因型，而不需要再一次利用Affymetrix芯片或是其他方法进行全基因检测（图1.1）。
3）对于一些高信息量，均匀分布在全基因的SNP分子标记，可以用来构建番茄的指纹图谱。
因此，一套完整能够与Affymetrix芯片相对应的SNP标记是必不可少的。
图1.1 QTL区间上的SNP标记分布图注：蓝色为深入片段，棕色为背景染色体。
1.3 Douglas系统下SNP标记的开发通过建立稳定、可靠的番茄DNA提取流程与优化PCR反应体系，筛选具有一致性、稳定性与多态性SNP分子标记引物，从而构建番茄全基因组SNP分子标记。
全基因组的SNP分子标记，可以用于番茄QTL定位群体的检测，分子标记辅助育种的选择以及全基因组选择的群体基因型的检测。
同时，从中挑选高质量，高信息量的分子标记用于构建一套完成的番茄指纹图谱，检测品种一致性。
1.3.1 供试材料：22份材料的DNA用作特异性引物筛选，2份水作为NTC（None Template Control），共计24份模板作为SNP引物的初期筛选。
以上实验在Q6仪器上进行。
对于筛选获得的一致性引物，在利用94株番茄自交系与2份水作为模板，进一步在Douglas仪器上验证。
1.3.2 DNA提取：1. 取~10mg 植物组织，加入研磨介质和400μl 裂解液，研磨5min，3000g离心5min。
2. 加入裂解液1/3 体积的提取液，旋涡振荡混匀，冰浴（或置于-20℃冰箱中）5min，于4℃，3200×g 离心10min，吸取上清300~400μl 加入到样品板中。
3. 按照下表在各96 孔板中加入试剂：板号板型板名成分样品及试剂体积1 Microtiter deep well96plate 样品板（Lysis）样品反应液无水乙醇300~400μl400μl2 Microtiter deep well96plate 洗涤板I（W1）PW磁珠800μl30μl3 Microtiter deep well 洗涤板II（W2）80%乙醇800μl96plate 磁套4 KingFisher 96 KF plate 洗脱板（Elution）TE1.0 50~100μl4. 将各96 孔板按仪器提示顺序放入仪器中，运行程序。
5. 程序运行结束后，将DNA 溶液转移PCR 板中并测量浓度（>100ng/μl），进行后续实验或于-20℃保存待用。
1.3.3 分子标记命名：分子标记全部采用统一的命名规则，这样有利于结果的修改与维护。
例如：引物合成：由生工公司负责引物合成。
1.3.4 SNP分子标记的开发：最近，Sim等人利用番茄的Illumina芯片检测410份自交系与16份番茄品种的基因型。
本研究在此基础上，利用Illumina开发的7,720条探针序列，选择其中丢失频率小于10%，等位基因频率大于10%的探针序列，获得~3,500条探针序列，作为SNP引物开发的模板序列（），每条序列的长度为~100bp，SNP 上下游各50bp。
初期，我们可以从~3500条探针中，选取~120探针序列作为模板发展引物，这120条序列要求分布在12条染色体上而且在每条染色体上尽量保证均匀分布。
如果实验成功，我们可以逐步地将剩余的探针序列发展成为SNP引物。
1.3.5正向引物设计：由于我们需要使用KASP基因分型检测试剂盒，本试剂盒对正向引物已经确定为SNP位点上游~20bp（包括SNP位点），同时需要人工加上FAM或是HEX 序列（图1.2）。
因此，我们需要单独设计反向引物。
图1.2 正向引物设计1.3.6反向引物设计：利用Primer3.0软件对模板序列进行引物选择，引物参数设定如下：1 引物长度为18~25bp；2 GC含量为40~60%；3 TM值58~62°C。
如果其上述模板序列不足以满足引物开发的需要：我们可以利用剩余~4,200条探针，继续开发新的引物。
另外，我们还可以利用PCR产物测序的方式获得gap中序列，寻找新的SNP位点。
1.3.6 PCR反应：PCR反应体系：PCR反应体系需要保证均一化，这样可以满足将来在Douglas系统下进行SNP检测。
初期我们会在Q6仪器上进行预实验，摸索一致后，再在Douglas系统中进行。
Primer Mix反应体系：名称体积（μl）FAM-Primer 12HEX-Primer 12Reverse-Primer 30ddH2O 46Total 100PCR反应体系：名称体积（μl）Reaction Mix 2.5Primer Mix 0.7ddH2O 0.8DNA 1Total 51.3.7 PCR反应程序：我们的PCR产物应该都为<100bp，因此我们可以采用统一设定，保证均一化。
采用两步法进行PCR反应，前期筛选引物我们设计3个复性梯度：60°C、57°C以及55°C，以便找到最合适的复性温度。
首先，利用60°C的复性温度进行筛选：步骤参数意义1 25°C 1:30min 反应前收集荧光2 94°C 10min 预变性3 94°C 15s 变性4 60°C 1min 复性，延伸5 3-4重复40个循环6 25°C 1:30min 反应完收集荧光如果SNP引物在60°C复性温度时扩增结果正常，则保留该引物在60°C复性进行PCR反应。
如果得到引物扩增效果不好，则降低复性温度，利用57°C 进行复性。
57 °C复性温度PCR反应程序筛选：步骤参数意义1 25°C 1:30min 反应前收集荧光2 94°C 10min 预变性3 94°C 15s 变性4 57°C 1min 复性，延伸5 3-4重复40个循环6 25°C 1:30min 反应完收集荧光如果SNP引物在57°C复性温度时扩增结果正常，则保留该引物在57°C复性进行PCR反应。
如果得到引物扩增效果不好，则降低复性温度，利用55°C 进行复性。
最终，如果55°C复性温度时，反应结果不好，则该SNP引物剔除去掉。
55°C复性温度PCR反应程序筛选：步骤参数意义1 25°C 1:30min 反应前收集荧光2 94°C 10min 预变性3 94°C 15s 变性4 55°C 1min 复性，延伸5 3-4重复40个循环6 25°C 1:30min 反应完收集荧光1.3.8 SNP分子标记准确性验证：对于已在21份模板DNA扩增稳定的SNP引物，需要进一步在大群体中验证其稳定性、一致性、多态性。
选择84份番茄自交系或品种的DNA，通过相同的PCR方法，验证新开发的SNP分子标记。
1.3.9目标要求：番茄全基因组SNP标记：在番茄的全基因上，我们获得1200对特异的SNP 引物（平均100对/染色体）覆盖番茄的全基因组。
已获得在12份模板DNA 能够稳定扩增的SNP分子标记，全部保留。
2分子标记辅助育种：2.1 ILs群体：如果利用现在群体不再进一步构建亚群体，ILs群体（L pennellii渐渗系群体）~76个自交系，整个群体数目较小，不利于定位及QTLs验证（图2.1）。
但是对于这些材料的渗入片段都已经注视清楚，因此我们可以直接比较深入系与M82自交系的表型差异，如果存在显著性差异，则可以定义为有深入片段引起的表型差异。
当鉴定结果与已定位的QTLs信息一致时，我们就认为此QTL在区间。
同时我们要检索此QTL定位时的位置，以此为基础发展SNP标记，用于以后分子标记辅助育种。
对于每个QTL的区间，需要发展4~8个SNP标记覆盖其定位区间（图1.1），其中，区间外两段各一个标记，部2~6个SNP标记。
这样可以保证目标QTL 被完整的应用。
SNP标记的开发，此时的SNP标记只需要在ILs群体的两个亲本中有多态性就可以应用。
引物设计同全基因组SNP引物设计相同。
性状验证：对于确定的QTLs，我们需要开发对应的SNP标记，利用这些标记重新验证定位结果：图2.1 深入系材料的基因型2.2I BLs群体：IBLs群体本身就是分离群体，因此可以直接用作定位（图2.2）。
如果该群体基因型已经被鉴定，我们可以直接利用鉴定的基因型结合我们自己调查的表型，获得QTL初定位的结果。
同时，利用Affymetrix芯片进行全基因组的SNP 检测，然后与表型数据相结合进行分析。