最新化学发光免疫分析技术

分配样品, 磁颗粒 和试剂
孵育 使反应物
结合
在磁场中 清洗去除 未结合物质
加入 底物 产生 信号
孵育, 促使信号
的产生
信号 检测
三、电化学发光免疫分析
电化学发光免疫分析 （electrochemiluminescence immunoassay， ECLIA）是以电化学发光剂三联吡啶钌标记 抗体(抗原)，以三丙胺(TPA)为电子供体， 在电场中因电子转移而发生特异性化学发光 反应，它包括电化学和化学发光两个过程。
㈡ 碱性磷酸酶标记的化学发光免疫分析
该分析系统以碱性磷酸酶 标记抗体(或抗原)， 在与反应体系中的待测标本和固相载体发生 免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-酶 标记抗体复合物，这时加入AMPPD发光剂， 碱性磷酸酶使AMPPD脱去磷酸根基团而发光。
碱性磷酸酶标记化学发光免疫分析示意图
分析步骤
影响标记的因素
1．发光剂的选择 2．被标记蛋白质的性质 3．标记方法的选择 4．原料比 5．标记率 6．温度 7．纯化与保存
第三节 化学发光免疫分析的类型
一、直接化学发光免疫分析
用吖啶酯直接标记抗体(抗原)，与待测标本中相应的抗原 (抗体)发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-吖啶 酯标记抗体复合物，这时只需加入氧化剂（H2O2）和 NaOH使成碱性环境，吖啶酯在不需要催化剂的情况下分 解、发光 。
第二节 化学发光剂和标记技术
一、化学发光剂
在化学发光反应中参与能量转移并最终以 发射光子的形式释放能量的化合物，称为化 学发光剂或发光底物。
能作为化学发光剂的条件： ①发光的量子产率高； ②它的物理-化学特性要与被标记或测定的
物质相匹配； ③能与抗原或抗体形成稳定的偶联结合物； ④其化学发光常是氧化反应的结果； ⑤在所使用的浓度范围内对生物体没有毒性。
D分子从激发态回到基态时发光，这种过
程叫间接化学发光。反应过程可表示如下：
A十B
C*
C*十D
C十D*
D*
D十h·γ
二、化学发光效率
化学发光效率决定于生成激发态产物分子的化学 激发效率（φCE）和激发态分子的发射效率 （φEM）。化学发光反应的发光效率、光辐射的 能量大小以及光谱范围，完全由发光物质的性质所 决定，每一个发光反应都具有其特征性的化学发光 光谱和不同的化学发光效率。
㈠直接化学发光剂
直接化学发光剂在发光免疫分析过程中不需 酶的催化作用，直接参与发光反应，它们在 化学结构上有产生发光的特有基团，可直接 标记抗原或抗体。
1. 吖啶酯 在碱性条件下被H2O2氧化 时,发出波长为470nm的光，具有很高的
发光效率，其激发态产物 N-甲基吖啶
酮是该发光反应体系的发光体。
2．三联吡啶钌 三联吡啶钌 [RU(bpy)3]2+是 电化学发光剂，它和电子供体三丙胺（TPA） 在阳电极表面可同时失去一个电子而发生氧化 反应。
三联吡啶钌
电化学发光剂反应原理
㈡ 酶促反应发光剂： 是利用标记酶的催化作用，使发光剂（底 物）发光，这一类需酶催化后发光的发光剂 称为酶促反应发光剂。
一些化学反应能释放足够
的能量把参加反应的物质激
发到能发射光的电子激发态，
若被激发的是一个反应产物
分子，则这种反应过程叫直
接化学发光。反应过程可简单地描述如下：
A十B
C*
C*
C＋ h·γ
其中γ为光子，C*表示C处于单线激发态。
若激发能传递到另一个未参加化学反应
的分子D上，使D分子激发到电子激发态，
化学发光免疫分析技术
第十章 化学发光免疫 分析技术
第一节 慨 述 一、化学发光 二、化学发光效率
第二节 化学发光剂和标记技术 一、化学发光剂 二、发光剂的标记技术
一、化学发光
化学发光（chemiluminescence）是指伴随化学反 应过程所产生的光的发射现象。某些物质(发光剂) 在化学反应时，吸收了反应过程中所产生的化学能， 使反应的产物分子或反应的中间态分子中的电子跃 迁到激发态，当电子从激发态回复到基态时，以发 射光子的形式释放出能量，这一现象称为化学发光。
㈠ 辣根过氧化物酶标记的化学发光免疫分析
该分析系统采用辣根过氧化物酶（HRP）标 记抗体(或抗原)，在与反应体系中的待测标 本和固相载体发生免疫反应后，形成固相包 被抗体-待测抗原-酶（HRP）标记抗体复合 物，这时加入鲁米诺发光剂、H2O2和化学发 光增强剂使产生化学发光。
辣根过氧化物酶标记化学发光免疫分析示意图
在电化学发光免疫分析系统中，磁性微粒为固相载体 包被抗体(抗原)，用三联吡啶钌标记抗体(抗原)，在反 应体系内待测标本与相应的抗原 (抗体)发生免疫反应 后，形成磁性微粒包被抗体-待测抗原-三联吡啶钌标 记抗体复合物，这时将上述复合物吸入流动室，同时 引人TPA缓冲液。当磁性微粒流经电极表面时，被安 装在电极下面的电磁铁吸引住，而未结合的标记抗体 和标本被缓冲液冲走。与此同时电极加压，启动电化 学发光反应，使三联吡啶钌和TPA在电极表面进行电 子转移，产生电化学发光，光的强度与待测抗原的浓 度成正比。
1．鲁米诺及其衍生物 2．AMPPD
1．鲁米诺 鲁米诺发光原理
鲁米诺增强发光反应原理
2．AMPPD
〔3-(2‘-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3“-磷酰氧基)苯-1,2-二氧杂环丁烷〕〕
二、发光剂的标记技术
1. 碳二亚胺（EDC）缩合法
2. 过碘酸钠氧化法
3．重氮盐偶联法
4. N-羟基琥珀酰亚胺活化法
由集光器和光电倍增管接收、记录单位时间内所产生的 光子能，这部分光的积分与待测抗原的量成正比，可从标准 曲线上计算出待测抗原的含量。
直接化学发光的机理
--- 夹心法
+ + 磁微粒 抗体
被测抗原
带丫啶酯 标记物抗
体
（1） 加入H2O2 （pH<10）
冲洗后
（2） 加入碱 （pH>10）
发光
Baidu Nhomakorabea
磁微粒技术
磁微粒模式图
特点 – 抗原和抗体结合与未结 合部分的易分离
Y
二、化学发光酶免疫分析
化学发光酶免疫分析（chemiluminescence enzyme immunoassay，CLEIA）是用参与催化某一化学发光反应的酶 如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶(ALP)来标记抗原或抗 体，在与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反应后，形成固 相包被抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物，经洗涤后，加入底物 (发光剂)，酶催化和分解底物发光，由光量子阅读系统接收，光 电倍增管将光信号转变为电信号并加以放大，再把它们传送至 计算机数据处理系统，计算出测定物的浓度。