海洋生物技术

绪论

一．海洋生物技术定义：运用海洋生物学与工程学的原理和方法，利用海洋生物或生物的代谢过程生产有用物质或定向改良海洋生物遗传特性的综合科学技术。

二．重点发展领域：

1.发育与生殖生物学基础

2.基因组学与基因转移

3.病原生物学与免疫

4.生物活性及其产物

5.海洋环境生物技术

三．最新研究进展：

动物细胞培养

一、细胞培养：从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞（使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶）然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖，并维持其结构和功能的一种培养技术。

二、细胞培养基本过程：取动物胚胎或幼龄动物器官、组织。将材料剪碎，并用胰蛋白酶（或用胶原蛋白酶）处理（消化），形成分散的单个细胞，将处理后的细胞移入培养基中配成一定浓度的细胞悬浮液。悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，成为细胞贴壁。当贴壁细胞分裂生长到互相接触时，细胞就会停止分裂增殖，出现接触抑制。此时需要将出现接触抑制的细胞重新使用胰蛋白酶处理。再配成一定浓度的细胞悬浮液。另外，原代培养就是从机体取出后立即进行的细胞、组织培养。当细胞从动植物中生长迁移出来，形成生长晕并增大以后，科学家接着进行传代培养，即将原代培养细胞分成若干份，接种到若干份培养基中，使其继续生长、增殖。通过一定的选择或纯化方法，从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质的细胞称为细胞株。当培养超过50代时，大多数的细胞已经衰老死亡，但仍有部分细胞发生了遗传物质的改变出现了无限传代的特性，即癌变。此时的细胞被称为细胞系。

三、原代培养：从供体取得组织细胞后在体外进行首次培养

四、传代培养：即将原代培养细胞分成若干份，接种到若干份培养基中，使其继续生长、增殖

五、细胞株：通过一定的选择或纯化方法，从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质的细胞

六、细胞系：原代培养的细胞顺利传至40--50代，并保持原来染色体的二倍体数量及接触抑制的行为，这种传代细胞成为细胞系

动物细胞融合技术

1.细胞融合：是在自发或人工诱导下，两个不同基因型的细胞或原生质体融合形成一个杂种细胞。基本过程包括细胞融合形成异核体(heterokaryon)、异核体通过细胞有丝分裂进行核融合、最终形成单核的杂种细胞。

2.融合方法包括：生物法用灭活的仙台病毒(Sendai virus），化学法如用聚乙二醇(Polyethyleneglycol，PEG）和物理法如电脉冲，振动、离心、电激等。

3.主要用途：制造单克隆抗体

4.意义：突破有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能

5.选择方法: 荧光标记；选择性培养基；遗传标记

6单克隆抗体的制备

抗白斑症病毒囊膜蛋白单克隆抗体制备

答：先提取病毒粒子---分离出囊膜蛋白----作抗原免疫小鼠---与骨髓瘤细胞杂交---细胞融合---螯虾动物模型筛选

细胞核移植技术

一.概念：通过显微操作,将供体细胞核移入除去核的卵母细胞中，使后者不经过精子穿透等有性过程即无性繁殖即可被激活、分裂并发育成新个体，使得核供体的基因得到完全复制。以供体核的来源不同可分为胚细胞核移植与体细胞核移植两种

二.受体细胞为什么选用卵母细胞？

答：卵细胞体积大易操作，而且决定细胞向某一方向进化的初始信息存在于卵细胞中

三为什么有时在进行核移植时不是取供体细胞核进行核移植，而是将整个供体细胞全部注入受体细胞中?

答：保证供体核不被破坏，使遗传物质不被破坏

.四、在体细胞的细胞核移植到手提卵母细胞之前，为什么必须先去掉受体卵母细胞的核？

答：为使核移植的胚胎或动物的遗传物质全部来自有重要利用价值的动物提供的体细

胞。在供体细胞的细胞核至受体细胞前，必须将受体细胞的遗传物质去掉或将其破坏。

五、提供细胞核为供体——常为鱼的囊胚或体细胞

去核的卵子为受体——鱼的成熟卵细胞

六、卵子在接受供体核之前，先要被激活以获得发育能力（鱼卵挤入水中即被激活）

受体成熟卵刚产出时，供体受精卵刚好发育到囊胚期。

供受体配合方法：可用超低温保存供体囊胚细胞，用温度控制供体受精卵的发育速度。

七、卵和早起胚胎的细胞操作的前处理。

答：卵膜的去除：不管是未受精卵还是受精卵，一接触水即吸水，卵膜和卵的表面分离，很

容易用镊子剥去，也可以用蛋白酶消去。

无卵膜的培养：除去卵膜的卵抵抗物理冲击能力很弱，所以应尽可能不要去移动它。

八、鱼类核移植的应用？

答：

1.培养新品种——核杂种

2.冲破远缘杂交难以进行和杂交后代不育的屏障

3.保持并复制优良个体的基因型

4.产生雄核纯合二倍体

5.基础研究

海洋动物染色体工程

一．鱼类染色体标本的制备：选择合适的鱼细胞，用适量的秋水仙素处理，低渗处理，离心，用现配的固定液固定，然后吸取细胞培养液向预冷的载玻片悬滴，盖上盖玻片，观察。

二．多倍体鱼的特点：1.巨型性2.速生性 3.增强抗逆性4.生理生化方面变化明显

三．诱导多倍体的方法：

1.生物方法：远缘杂交核移植细胞融合

2.物理方法：温度休克法（热休克，冷休克）静水压法

3.化学方法：利用秋水仙素，细胞松弛素

四．多倍体在水产养殖上的应用：

1. 控制过度繁殖

2.提高生长速度

3.延长鱼类寿命

五．甲壳动物多倍体育种的困难：

1.处理时间难确定

2.抱卵特性对诱导和发育有不利影响

五、转基因技术 就是利用实验手段, 将特定外源基因导入早期胚胎的细胞内, 由此整合到

染色体上, 并通过生殖细胞亲代传递给子代的动物, 这类被整合了外源基因的新动物被称为转基因动物。

1.1 受精卵原核显微注射法

受精卵原核显微注射法以单细胞期受精卵为靶细胞，借助显微操作仪，将构建的载体DNA直接注入到受精卵的原核中，并将受注射的受精卵移入假孕母体输卵管继续发育。通过DNA在复制或修复过程中造成的缺口，把外源DNA整合到胚胎基因组中，获得转基因动物个体。1982 年，Palmiter成功的将大鼠生长激素基因与小鼠金属硫蛋白I 基因启动子相连接，然后将融合基因注入小鼠雄原核，成功研制出了著名的

“超级小鼠”( super mouse)[4]。按照转基因小鼠的思路，转基因兔、转基因绵羊、转基因猪、转基因山羊都相继成功。受精卵原核显微注射法是哺乳动物最常见的转基因方法,效果稳定,导入时对外源基因的长度限制小，可向动物原核内导入250kb左右的DNA片段，而且不经嵌合体途径便可直接获得纯系。但该方法操作复杂，转基因效率低，导入外源基因的拷贝数无法控制，转基因为单复本或由几千复本首尾串联成多联体，而且外源基因随机整合到基因组中，导致宿主DNA中的染色体序列丢失、重排、插入突变，有的造成严重的生理缺陷。

1.2 反转录病毒感染法