扶桑绵粉蚧虫生真菌的分离及分子鉴定

扶桑绵粉蚧虫生真菌的分离及分子鉴定作者：王震杰等来源：《安徽农业科学》2014年第10期摘要[目的] 探索病原真菌防治扶桑绵粉蚧的可行性，[方法]分离培养并鉴定了扶桑绵粉蚧的5种虫生真菌，分析了粉蚧感染真菌的状况，基于26S rRNA构建了系统进化树。

[结果]一种子囊菌（Ascomycota.sp）在扶桑绵粉蚧中的侵染率最高，达66.7%。

粉蚧趋于感染多种真菌。

系统进化分析表明，分离培养出的5种真菌中，4种隶属于子囊菌门（Ascomycota），而另一种为担子菌门（Basidiomycota）真菌。

关键词扶桑绵粉蚧；真菌；26S rRNA；子囊菌；担子菌中图分类号S433.3文献标识码A文章编号0517-6611（2014）10-02966-03Abstract[Objective] To detect the feasibility in control the mealybug by pathogenic fungi in the pest.[Method] Five kinds of fungus were isolated and identified by Shashi medium from the mealybug Phenacoccus solenopsis （Tinsley） which cultured in laboratory.The affection rate of every kind of fungi which existed in mealybug was calculated and the multiple affection rate was also analyzed.Meanwhile，the phylogenetic tree was constructed depending on the 26S rRNA.[Result] A kind of Ascomycota presents the highest affection rate in mealybug with the affection rate up to66.67%.The multiple infection analysis shows that this pest tends to harbor several kinds of fungus at the same time.Also，the phylogenetic tree indicates that four of the five identified fungus are belong to the phylum of Ascomycota，and the other comes from Basidiomycota.Key wordsPhenacoccus solenopsis Tinsley； Fungi； 26S rRNA； Ascomycota；Basidiomycota扶桑绵粉蚧（Phenacoccus solenopsis Tinsley）隶属于半翅目（Hemiptera）蚧总科（Coccoidea）粉蚧科（Pseudococcidae）绵粉蚧亚科（Phenacoccinae）绵粉蚧属（Phenacoccus）。

该粉蚧于1898年在美国被首次报道[1]，近百年来一直被认为是次要害虫[2]。

自2008年扶桑绵粉蚧相继入侵印度、巴基斯坦和中国之后，对棉花造成了严重的经济损失[3-6]。

目前，多采用化学防治措施，但易造成环境污染、生物多样性破坏和抗药性增强等问题。

因此，生物防治得到了研究者的普遍重视。

昆虫病原真菌作为一种环境友好的生物防治方法，越来越多地应用于害虫综合治理。

为了探索病原真菌防治扶桑绵粉蚧的可行性，笔者分离培养了扶桑绵粉蚧成虫的虫生真菌，并将培养得到的真菌进行26S rRNA序列分析及鉴定，以期为进一步利用虫生真菌有效防控扶桑绵粉蚧奠定基础。

1材料与方法1.1供试昆虫及寄主植物扶桑绵粉蚧采自浙江省金华市木槿上，在人工气候箱中用棉花作为寄主植物连续饲养15世代以上（培养条件为：温度22～26 ℃，光照昼夜比16∶8，相对湿度40%～60%）。

取单头大龄若虫于棉叶上，置于培养皿中培养至成虫。

棉花品种为福棉2号（F1）。

棉花在人工气候箱内种植，生长期内不施用任何农药，待其长至6片真叶左右时用于试验。

1.2试剂和培养基微生物裂解试剂盒（Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR.Code No.9164）、真菌鉴定试剂盒（Fungi Identification PCR Kit.Code No.RR178），Takara pMD19T Vector载体试剂盒（Takara Code：D102A）均购自Takara公司，核酸染料 Gelred 购自Biotium 公司，其余试剂皆购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

固体沙氏培养基的配制方法：葡萄糖40.0 g，蛋白胨10.0 g，琼脂12.0～15.0 g，蒸馏水1 000 ml，混合后，加氯霉素200 mg摇匀，于121 ℃、0.15 Mp灭菌锅内灭菌，在超净工作台上倒入培养皿中，待冷却凝固后备用。

用于筛选阳性克隆的LB培养基参考《分子克隆实验指南》配制。

1.3真菌的分离培养扶桑绵粉蚧单头成虫于无水乙醇中漂洗后，置于帕拉膜上，滴加100 μl ddH2O研磨充分，将研磨液均匀涂布于含氯霉素的固体沙氏培养基上，共30次重复。

培养皿置于28 ℃恒温培养箱中培养48～72 h。

检查并统计菌落生长情况和菌落类型。

挑取单菌落接种于培养基上培养48～72 h。

1.4真菌26S rRNA文库的构建挑取培养基上的单菌落，使用TaKaRa微生物裂解试剂盒直接裂解所分离的真菌。

裂解产物用TaKaRa 真菌鉴定试剂盒进行26S rRNA PCR扩增，使用引物为试剂盒自带的扩增26S rRNA D1/D2引物对。

反应体系：PCR Premix 12.5 μl，Forward Primer和Reverse Primer（20 pmol/μl）各0.5 μl，模板DNA（裂解液）1 μl， ddH2O补至25 μl。

PCR反应程序：96 ℃预变性5 min后进入循环，94 ℃变性1 min，53 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，共30个循环，最后72 ℃延伸5 min。

对获得的PCR产物，直接使用Takara pMD19T Vector载体试剂盒进行载体连接，反应为10 μl连接体系，含Solution I 5 μl，PCR产物1 μl，pMD19T Vector载体1 μl，16 ℃反应30 min。

连接产物和感受态细胞冰浴30 min后，在42 ℃热激90 s，转化大肠杆菌DH5α 感受态细胞JM109，160 r/min摇菌1 h后，3 000 r/min离心3 min，弃去上清液，吹打并吸取10 μl菌液，均匀涂布于LB培养基上，37 ℃恒温箱中培养12～18 h，即获得26S rRNA文库。

1.526S rRNA测序和序列分析对上述获得的单克隆进行检测，将阳性克隆扩培后，送交至上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

测序结果用VecScreen比对分析（http：///VecScreen/VecScreen.html），切除多余载体序列，对获得的5条26S rRNA序列在NCBI（The National Center for Biotechnology Information， http：///）数据库中采用BLASTN进行比对分析。

1.6系统发育分析获得的5条26S rRNA基因序列用ClustalX 1.83软件与引自NCBI数据库的另5条序列进行多重比对，将比对结果导入MEGA6.0建树软件，使用UPGMA法构建系统进化树，分支的bootstrap 重复次数为2 000次。

2结果与分析2.1序列分析将获得的5条扶桑绵粉蚧真菌26S rRNA序列在NCBI数据库中进行BLASTN 分析比对，结果显示5条序列分别与子囊菌（Ascomycota.sp）、苜蓿茎点霉菌（Phoma medicaginis）、枝孢菌（Cladosporium Cladosporioides）、浅黄隐球菌（Cryptococcus）和盘长孢状刺盘孢菌（Colletotrichum gloeosporioides）同源性较高，相似度分别为100%、98%、99%、99%和99%。

其中，Ascomycota、Phoma medicaginis、Cladosporium Cladosporioides、Colletotrichum gloeosporioides都隶属于子囊菌门，而Cryptococcus则属于担子菌门。

26S rRNA 序列已上传至NCBI数据库中，并分别以比对相似度最高的菌种名命名，株系编号后缀为Y ming R，系列分别为E、F、G、H和I，登记号分别为：KJ470707（608 bp）、KJ470708（614 bp）、KJ470709（608 bp）、KJ470710（638 bp）、KJ470711（608 bp）。

2.2真菌侵染率分析子囊菌门（Ascomycota）对粉蚧的侵染率最高，4类子囊菌中，以Ascomycota.sp strain EY ming R的侵染率最高，达到66.7%；其次是Cladosporium Cladosporioides strain GY ming R（26.7%）和Phoma medicaginis strain FY ming R（10%）；来自担子菌门（Basidiomycota）的Cryptococcus strain HY ming R侵染率为16.7%；而同样来自子囊菌门的Colletotrichum gloeosporioides strain IY ming R表现为低侵染率，只有3.3%。

在涂布培养的30只雌成虫培养基中，无真菌侵染的比例为20%。

只感染1种真菌的粉蚧有30%，感染2种真菌的为20%，感染3种真菌的粉蚧个体为16.7%，而同时感染4种真菌的为13.3%，无同时感染5种真菌的粉蚧个体（图1）。

该试验共分离培养并鉴定出5种真菌，测序结果表明，其中4种属于子囊菌门（Ascomycota），它们与扶桑绵粉蚧的关系可能为寄生或共生关系。

侵染率分析结果显示，Ascomycota.sp strain EY ming R对粉蚧的侵染率高达66.7%，可以初步判断其为该粉蚧的优势外生真菌。

从多重感染分布可以看出，感染多种真菌的粉蚧个体占50%，而感染单种真菌的个体仅为30%，这表明，粉蚧趋向于与多种真菌共生。