多维色谱概论
第2章 色谱基本理论
4. 不对称度（As）或拖尾因子(T) （tailing factor） As(不对称因子)=B/A（ x=0.10 h） T(拖尾因子)=（A+B）/2A（ x=0.05 h）
Asymmetry
A factor describing the shape of a chromatographic peak. Theory assumes a Gaussian shape peak that is symmetrical. The peak asymmetry factor is the ratio (at 10 percent of the peak height) of the distance between the peak apex and the back side of the chromatographic curve to the distance between the peak apex and the front side of the chromatographic curve. A value >1 is a tailing peak, while a value <1 is a fronting peak
分配容量是描述溶质在两相中分布的 简便形式。它将溶质在色谱系统中的分 布与其热力学性质联系起来，是选择控 制色谱条件的一个最重要的参数. k不仅 与固定相、流动相性质及温度有关，还 与色谱柱床的结构有关，但与流动相流 速及柱长无关。
分配系数是由组分和固定相的热力学性质决 定的，它是每一个溶质的特征值，与固定相和温 度有关。它与两相体积、柱管的特性以及所使用 的仪器无关。
第2节色谱学基础理论
• 色谱分析的目的是将样品中各组分彼此分离，组分要 达到完全分离，两峰间的距离必须足够远，两峰间的距 离是由组分在两相间的分配系数决定的，即与色谱过程 的热力学性质有关。 • 但是两峰间虽有一定距离，如果每个峰都很宽，以 致彼此重叠，还是不能分开。这些峰的宽或窄是由组分 在色谱柱中传质和扩散行为决定的，即与色谱过程的动 力学性质有关。因此，要从热力学和动力学两方面来研 究色谱行为。
第10章 色谱分析基本概念
c
c0 σ 2π
e
当色谱峰为非正态分布时，可按正态分布函数加指数衰 减函数构建关系式。
目 录
1-1 色谱法概述
1-1-1 色谱法的特点、分类和作用 1-1-2 色谱分离过程 1-1-3 色谱流出曲线与术语
1-2 色谱理论基础
1-2-1 塔板理论 1-2-2 速率理论 1-2-3 分离度 1-3 定性定量方法 1-3-1 色谱定性分析 1-3-2 色谱定量分析
色谱柱长：L， 虚拟的塔板间距离：H，
色谱柱的理论塔板数：n，
则三者的关系为： n=L/H
理论塔板数与色谱参数之间的关系为：
tR 2 tR 2 n 5.54( ) 16( ) Y1/ 2 Wb
保留时间包含死时间，在死时间内不参与分配!
2.有效塔板数和有效塔板高度
• 单位柱长的塔板数越多，表明柱效越高。
调整保留时间（tR＇）：tR＇= tR－tM
（2）用体积表示的保留值 保留体积（VR）： VR = tR×F0 F0为柱出口处的载气流量，
单位：m L / min。
死体积（VM）：
VM = tM ×F0
调整保留体积(VR＇)：
V R＇ = VR －VM
3. 相对保留值r21 组分2与组分1调整保留值之比： r21 = t´R2 / t´R1= V´R2 / V´R1 相对保留值只与柱温 和固定相性质有关，与其 他色谱操作条件无关，它 表示了固定相对这两种组 分的选择性。
式中为相比。 填充柱相比：6～35；毛细管柱的相比：50～1500。 容量因子越大，保留时间越长。 VM为流动相体积，即柱内固定相颗粒间的空隙体积； VS为固定相体积，对不同类型色谱柱， VS的含义不同； 气-液色谱柱： VS为固定液体积； 气-固色谱柱： VS为吸附剂表面容量；
色谱理论基础
无关。k值大小可直接从色谱图上测量。有关计算式如下：
k tr t0 Vr V0
t0
V0
恒流速 t0 的测定
基本保留方程 分离因子
tr = t0 (1＋k) Vr = F tr
Vr V0 (1 k) V0 KVs
t r2 K2 k2
t r1 K1 k1
色谱分离的特征之一是组分在色谱柱上有不同程度上 的滞留。由于色谱固定相面积很大、液膜很薄, 组分通 过色谱柱时, 它们在两相间的分配被认为是达到平衡的。 优先分配在固定相的组分在柱上的保留时间最长, 而分 配系数小的组分保留时间短。换句话说，溶质的保留行 为是其平衡分配性质的函数。组分之间平衡分配性质的 差异给色谱分离提供了可能性。
G为负值, 则柱温与分配系数成反比。一般温度上升,
K值下降, 这导致组分移动速度增加, 保留值下降。
对任何色谱过程, 分配系数对温度的变化率为：
d ln K H
dTc RTc
在气相色谱中, 组分从气相转移到液相, 其H值大,
常用控制柱温来调节分离；而在液相色谱中, 组分从
液相转移另一液相（固定相）, 其H值要小得多。所
以液相色谱对温度变化不太敏感, 一般在室温下操作。
对于气相色谱分析, 柱温上升20℃，K下降一半，
低温有利于分离，高温有利于分析速度。 同样，柱温的稳定性严重影响GC的保留值，商品
仪器的柱温控制精度为±0.2℃。
问题：在色谱分析中，温度除了对分离结果 有影响外，还有其它影响吗？
补充材料
GC中的温度控制
中, uX = u，即X谱带的迁移速度与流动相分子通过色 谱柱的速度一样。
二维色谱简介
最后，二维色潜能和单一色谱一样，也可 以继续与有机物的结构鉴定仪器如质谱、 红外和核磁共振等联用。正如气相色谱技 术的一样，二维色谱的GC/GC技术非常成 术的一样，二维色谱的GC/GC技术非常成 熟，经30年的商品化技术开发，目前 熟，经30年的商品化技术开发，目前 GC/GC二维色谱联用仪器有很好的商品出 GC/GC二维色谱联用仪器有很好的商品出 售。
但二维色谱也是有区别的。若两种色谱的联用仅 是通过接口将前一级色谱的某一组分简单地传递 到后一级色谱中继续分离，这是普通的二维色谱 (two(two-dimensional chromatography)，一般 chromatography)，一般 用C+C表示。但当两种色谱联用，接口不仅承担 C+C表示。但当两种色谱联用，接口不仅承担 将前一级色谱的组分传递到后一级色谱中，而且 还承担前一级色谱的某些组分( 还承担前一级色谱的某些组分(如高浓度和损害下 级色谱的组分等) 级色谱的组分等)的收集式聚集作用，这种二维色 谱称做全二维色谱（comprehensive two谱称做全二维色谱（comprehensive twodimensional chromatography），.一般用 chromatography），. C×C表示。C+C或C×C两种二维色谱可以是相 表示。C+C或 同的分离模式和类型，也可以是不同的分离模式 和类型。
二维色谱二维色谱二维色谱简介二维色谱简介色谱色谱色谱联用技术是采用匹配的接口将不同的色色谱联用技术是采用匹配的接口将不同的色谱连接起来第一级色谱中未分离开的组分由接谱连接起来第一级色谱中未分离开的组分由接口转移到第二级色谱中第二级色谱仍有未分开口转移到第二级色谱中第二级色谱仍有未分开的组分也可以继续通过接口转移到第三级色谱的组分也可以继续通过接口转移到第三级色谱中
色谱分析法_02色谱基本理论
, R , R
理论塔板数n
neff
有效理论塔板数neff 理论塔板高度H H=L/n
第二节
一气体 H2 N2 Air 也可用CO2 Ne Ar
气路系统
纯度要求大于99.99 %
气体控制系统
气体的纯化
检测器 TCD ；FID TCD ；FID FID ；ECD FID ；ECD 常用净化剂 变色硅胶： 分子筛 ： 活性碳： 脱氧剂 ： 作用 除H2O 除H2O 除有机物 除O2
1．从塔板理论方程式的形式看它描述的色谱 信号轨迹应该是正态分布函数，与实际记录 的色谱流出曲线相符合，说明此方程是准确 的，且对色谱分配系统有理论指导意义。 2．由塔板理论据导出来计算往效率的理论塔 板数(N)公式，是行之有效的。长期以来用N 值的大小评价色谱柱柱效是成功的，是色谱 工作者不可缺少的计算公式。
纵向分子扩散是由浓度梯度造成的。组分 从柱入口加入，其浓度分布的构型呈“塞子” 状。它随着流动相向前推进，由于存在浓度 梯度，“塞子”必然自发的向前和向后扩散， 造成谱带展宽。分子扩散项系数为 K0为阻滞常数即弯曲因子，它反映了固定 相颗粒的几何形状对自由分子扩散的阻碍情 况。 Dg为组分在流动相中扩散系数(cm2.s-1)
van Deemter方程的数学式为 H=A+B/U+CU 或H=A+B/U+CsU+CmU
A、B、C、为常数，分别代表涡流 扩散系数、分子扩散项系数、传 质阻力项系数。
速率理论讨论
1、涡流扩散项A=2λ dγ λ 为反应柱填充状态的常数 dp为填料垃径
2、 分子扩散项 B / u （纵向扩散项） B = 2K0 Dg
色谱文献综述
第1章文献综述1.1.引言高效液相色谱（HPLC）作为分析化学中复杂体系分离分析的重要手段之一，在许多领域都有着广泛的应用。
蛋白质组学[1-4]、中药[1-3]、聚合物[4-6]、环境[7]和药物[8]等复杂体系的分离分析为各种色谱技术的发展带来了机遇和挑战。
蛋白质组学和中药等研究中样品体系极其复杂，采用传统的一维分离模式所能提供的分辨率和峰容量难以满足高效分离与高灵敏检测的要求[9, 10]。
Gidding等[11]指出，当样品中的组份数超过系统峰容量的时，样品在系统中便得不到良好的分离。
对于随机分布的样品，完全分离其中98%的组份，系统的峰容量需要是样品中组份数的100倍以上[12]，采用一维液相色谱进行分离时，分离500个峰需200万理论塔板/m（分离度1.5）的柱效[13]。
显然，我们不能寄希望于一维色谱分离能力能提高几个数量级[14]，因此，只能采取其他方法，如多维色谱分离系统。
多维色谱技术的历史可以追溯到1944年，Martin和同事利用纸色谱法[15]，在两次分析中，将流动相以直角的方式洗脱样品，第一次实现了二维的高效分离。
近年来，色谱工作者把主要的精力放在使用现代柱色谱技术代替薄层技术上。
柱色谱技术的优点包括重现性、速度、选择性和易用性，重要的是，柱色谱易于与其他检测技术相连，如质谱。
1978年，Erni和Frei[16]设计出了阀切换系统，构建了GPC/RPLC模式的二维色谱。
由于采样不足（切阀时间长达75 min），分离度有限，同时没有自动化的阀配置和数据转换过程，没有给出二维色谱图，因此并没有引起重视。
1987年，J. W. Jorgenson受J. C. Giddings的启发，开始研究复杂样品分析实用的多维色谱方法。
1990年[17]，Bushey和Jorgenson改进了Erni 和Frei的装置，构建了IEX/SEC二维系统，通过降低采样时间到6 min，以及协调两维间的流动相梯度和流量，实现了较高的正交性分离，并第一次以3D图的方式展现出来，实现了蛋白质的全二维分析，第一次展现了多维色谱的巨大优势。
mtt 法
mtt 法MTT法是一种常用的蛋白质组学技术，全称为多维液相色谱-串联质谱法（Multidimensional Protein Identification Technology）。
该技术利用多维液相色谱分离样品中的蛋白质，并通过串联质谱鉴定和定量这些蛋白质，从而实现对复杂混合物中蛋白质的高通量分析。
一、MTT法的原理MTT法主要包括两个步骤：样品前处理和多维液相色谱-串联质谱分析。
在样品前处理过程中，需要对样品进行裂解、消化和标记等处理，以便于后续的分离和鉴定。
在多维液相色谱-串联质谱分析过程中，则需要将裂解后的样品通过多次柱子分离，最终将样品中的蛋白质逐一鉴定并定量。
二、MTT法的优点1. 高通量：MTT法可以同时鉴定数千种不同的蛋白质，并且可以进行高通量筛选。
2. 灵敏度高：MTT法可以检测到低至femtomole级别的蛋白质。
3. 准确性高：MTT法可以精确鉴定样品中的蛋白质，并且可以进行定量分析。
4. 可重复性好：MTT法可以进行高度重复的实验，从而保证实验结果的可靠性。
5. 适用范围广：MTT法可以应用于多种生物样品，包括细胞、组织、血清等。
三、MTT法的应用1. 生物标记物发现：MTT法可以鉴定和筛选潜在的生物标记物，从而帮助诊断和治疗疾病。
2. 蛋白质互作研究：MTT法可以鉴定蛋白质之间的相互作用关系，从而揭示蛋白质网络中的关键节点。
3. 药效学研究：MTT法可以帮助评估药物对蛋白质组的影响，从而更好地理解药物作用机制。
4. 基因表达调控研究：MTT法可以帮助揭示基因表达调控网络中涉及到的蛋白质，并且可以评估不同条件下基因表达水平的变化情况。
四、MTT法存在的问题1. 样品前处理过程中存在的误差：由于样品前处理过程中存在很多环节，如裂解、消化和标记等，因此可能会引入一些误差。
2. 数据分析难度大：MTT法产生的数据量较大，数据分析难度较高。
3. 成本较高：MTT法需要使用复杂的仪器设备和试剂，因此成本较高。
色谱基本理论
2-1
2-2 色谱流出曲线及有关色谱术语
2.2.1 流出曲线和色谱峰
2-1
试样中各组分经色谱柱分离后，以此流出色 谱柱，经检测器转换为电信号，然后用数据 记录装臵将各组分的浓度变化记录下来，即 得色谱图。 色谱图是以组分的浓度变化引起的的电信号 作为纵坐标，流出时间作为横坐标的，这种 曲线称为色谱流出曲线。
（5） 保留体积 VR
从进样开始到被测组份在柱后出现浓度极大 点时所通过的流动相体积。保留体积与保留时间 t。 的关系如下： VR = tR· F0
（6） 调整保留体积VR′
某组份的保留体积扣除死体积后，称该组份 的调整保留体积，即 VR′ = VR- VM
（7）相对保留值γ2.1
某组份 2 的调整保留值与组份 1 的调整保留值之比， 称为相对保留值：
2-3 色谱法分析的基本原理
色谱分析根本目的：将样品中各组分彼
此分离，组分要达到完全分离，两峰间的距 离必须足够远.
两峰间的距离是由组分在两相 间的分配系数决定的，即与色 谱过程的热力学性质有关。但 是两峰间虽有一定距离，如果 每个峰都很宽，以致彼此重叠， 还是不能分开。这些峰的宽或 窄是由组分在色谱柱中传质和 扩散行为决定的，即与色谱过 程的动力学性质有关。 因此，要从热力学和动力学两 方面来研究色谱行为。
γ 2.1 t R2 t R1 VR1 VR2
由于相对保留值只与柱温及固定相的性质有关，而 与柱径、柱长、填充情况及流动相流速无关，因此， 它是色谱法中，特别是气相色谱法中，广泛使用的定 性数据． 必须注意，相对保留值绝对不是两个组份保留时间或 保留体积之比 .
*选择因子
在定性分析中，通常固定一个色谱峰作为标 准（s），然后再求其它峰（i）对这个峰的相对 保留值．在多元混合物分析中，通常选择一对最 难分离的物质对，将它们的相对保留值作为重要 参数．在这种特殊情况下，可用符号α表示：
色谱图概述——精选推荐
第一章色谱图概述第一节色谱图的获得色谱法（!"#$%&’$(#&)"*）是一种目前使用最广泛的和有效的分离、分析方法。
色谱（!"#$%&’$(#&%）这一概念最早是由俄国植物学家+,-.’’提出，/012年他在一根细长的玻璃管中装入碳酸钙粉末，然后把植物绿叶的石油醚的萃取液倒入管中的碳酸钙上，萃取液的色素就被吸附在管上部的碳酸钙上，再用纯净的石油醚洗脱这些被吸附的色素，于是在碳酸钙上形成了一圈一圈的色带（图34/4/），这些色带被称为色谱，这就是世界上得到的最早的色谱图。
柱中的碳酸钙被称为固定相（,’&’5$6&#*)"&,.），而用作洗脱液的石油醚则被称为流动相（%$758.)"&,.），流动相可以是气体、液体和超临界流体。
将欲被分离的混合物放在固定相上，然后用流动相去洗脱放在固定相上的混合物，这一过程称为洗脱（.89’5$6）。
在洗脱过程中混合物中的不同组分得到分离，陆续从固定相中洗脱下来。
记录这一分离和洗脱过程的图谱就是色谱图34/4/+,-.’’色谱分离示意图（&）刚刚加入萃取液；（7）已加入部分溶剂淋洗图（!"#$%&’$(#&%）。
色谱方法种类很多，分类的方法也很多。
根据流动相是气体还是液体，色谱可分为气相色谱（(&,!"#$%&’$(#&)"*）和液相色谱（85:95;!"#$%&’$(#&)"*）。
当流动相是在接近它的临界温度和压力下工作的液体，而这种液体在常温和常压下是气体时，这种流动相就不能简单地说是气体或液体了，这种色谱就称为超临界流体色谱（,9).#!#5’5!&8<895;!"#$%&’$(#&)"*）。
色谱理论基础知识
气相色谱实验技术
气相色谱仪
载气系统
分离系统
检测和 记录系统
进样系统
温控系统
（一）载气系统
载气系统
{
气源 净化干燥管 载气流速控制装臵 检测器
常用载气：氮气、氦气、氢气及氩气 载气选择依据
固体吸附剂应用
吸附剂 活性碳 石墨化炭 黑 硅胶 氧化铝 分子筛 主要成 分 C C Tmax 性质 度 300 500 非极性 非极性 氢键型 弱极性 极性 分离对象 永久气体，非极性烃 永久气体，高沸点化合 物 永久气体，非极性烃， 气体硫化物 烃，有机异构体 永久气体，惰性气体
SiO2· 2 400 XH O Al2O3 硅铝酸 盐 400 400
毛细管柱
毛细管柱又叫空心柱：
涂壁空心柱：将固定液均匀地涂在内径0.10.5毫米的毛细管内壁而成。 多孔层空心柱（PLOT）：在管壁涂渍一层多 孔吸附剂颗粒，不涂固定液，实际上毛细 管气固色谱柱。
毛细管柱的优点：
毛细管内没有固体填料，气阻比填充柱小的多， 可以采用较长的柱管和较小的内径，以及较高的 载气流速，既没有涡流扩散，又减小了纵向扩散 造成的谱带展宽。较薄的液膜又在一定程度上抵 消了由于载气流速增大引起的传质阻力增大。
液相传质阻力
固定液粘度及液膜厚度越小 液相传质阻力越小
4) 流动相线速度对板高的影响
四 分离度
定义：
tr2, tr1: 组分2和组分1的保留时间 W2, W1: 组分2和组分1的峰底宽度
R=1.5 完全分离
五 基本色谱分离方程式
对于难分离相邻两组分：