利用可视化膜芯片检测9种转基因玉米-2019年精选文档
转基因食品鉴别识
转基因食品鉴别识————————————————————————————————作者：————————————————————————————————日期：转基因食品鉴别知识资料来源：新浪博客一、转基因蔬菜一般具备的特征1、没有传统蔬菜参差不齐的外形，普遍个头均匀，型大体长，色泽光艳，质地鲜嫩，如黄瓜、茄子、丝瓜、洋葱等；2、非传统原始地道的味道，无论是烹调前或烹调后的气味还是滋味具备与传统蔬菜明显的区别，如甜椒等；3、非当地时令菜蔬，各类蔬菜的一大特性就是均具备很强的季节性和地域性，有部分非当地时令菜蔬并非依靠外地长时间保鲜和运输而来，而是靠转置耐寒或耐高温基因所得。
二、转基因食品鉴别知识1、看产地：尽量避开那些转基因比较“泛滥”的地区。
如东北地区转基因大豆种植面积比较大。
2、看外包装标识：看是否有转基因提示或标识。
这一点，在一些食用油产品上有相关标识，但在非食用油产品中，还比较少见。
3、看产品品种：如一种俗称为“先玉335”的玉米，就是一种典型的转基因玉米。
4、看检测报告：现在像大豆、玉米等产品，是否为转基因是能够通过检测来鉴定的。
尤其需要注意的是，现在市面上的某些产品，如玉米，即便声明为非转基因，也未必不含转基因成分，更不用说未说明是否含转基因的产品了。
如我们曾对一份所谓非转基因的玉米进行了转基因检测。
检测结果表明，该产品中含有CAMV35S启动子，转基因抗虫玉米MON810成分。
其检测结果为阳性(即含有转基因成分)。
选择有机食品：因为有机食品除了要求不打农药，不施化肥，无激素、抗生素等外，还有一个重要的条件，就是非转基因。
5、其他鉴别方法可以留意一下进口水果的标签。
一般来说，在标签的最下方一般印有出口国的名称，中间的英文字母标明水果的名称，最上方的英文字母标识的是出口企业的名称。
在每个标签的中间一般有4位阿拉伯数字：3字开头的表示是喷过农药。
4字开头的表示是转基因水果；5字开头的表示是杂交水果。
转基因植物及产品检测技术研究综述
Ｖｏ ４ Ｌ２ Ｎｎ ３
西
南
农
业
学
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１０ ２３
Ｓ ｕｈ ｅｔ ｈ ａＪｕ ｎ ｌ ｆ ｃ ｌ ｒｌ ｃ ｎ ｅ ｏ ｔｗ ｓ Ｃ ｉ ｏ ｒ ａ ｏ ｎ Ａ ｕｔ ａ Ｓ ｉ ｃｓ ｕ ｅ
文章 编号 ： ０ － ８９ ２ １ ）３—１０ ０ １ １ ４ ２ （０ １ ０ ０ ２３— ６
田间鉴评试 验 ；９ ５年完成 首 例转 基 因植 物产 品安 １９
ｌ 转 基 因植 物及 产 品的 概 念
１ １ 转 基 因植 物 ．
全性评价研究 ； ９ １ ６年转基 因植物产品进入商 品化 ９ 生产 ； ２ １ ， 球 已有 ２ 国家种植 转基 因植 到 ００年 全 ９个 物， 种植面积发展到 了 １４ 亿 ｈ 约 占全球农作 ．８ ｍ， 物种植面积 的 ２ ． ｌ％，５年间增 长了 ８ Ｏ０ １ ７倍… 。 全球 ２ 亿 以上人 口食用 了转基因产品。随着转基 Ｏ
１ ２ 转基 因作 物 ．
究的重要组成部分和转基因植物及产品安全性评价 中身份认定 的基本技 术一 转基 因植物 及产 品检 测技 术不断进步 ， 系统地了解这一技术的研究进展 ， 对转 基 因植 物育种 和安全 性评 价 、 管具有 重要意 义 。 监
转基 因 作 物 （ ｎｔａｙＭｏｉｅ ｒｐ Ｇ ； ｅ Ｇ ｅｉ ｌ ｄｆｄ Ｃｏ ， ＭＣ ｃｌ ｉ Ｔａｓｅｉ Ｃｏ ） 指用 于人工栽 培生 产特 定产 品的 ｒ ｇｎｅ ｒｐ 专 ｎ 转基 因植 物。 目前 ， 基 因植 物 的主 体是 转 基 因 作 转
（ ｕ ｎｎＡ ａ ｅ ｙｏ ｃｌ ｒｌ ｃｅｃｓＹ ｎａ ｕ ｍ ｎ ５ ２ １ Ｃ ｉａ Ｙ ｎａ ｃｄｍ ｆ Ａ ｕｔ ａ ｉ ｅ。 ｕ ｎｎＫ ｎ ｉｇ６ ０３ ， ｈｎ ） ｕ Ｓ ｎ
实时荧光定量PCR技术在转基因检测中的应用_敖金霞
实时荧光定量PCR 技术在转基因检测中的应用收稿日期：2008-03-05基金项目：东北农业大学创新团队项目（CXT004-3-2）作者简介：敖金霞（1977-），女，黑龙江人，博士研究生，助研，主要从事转基因作物基因检测技术方面研究。
*通讯作者：教授，博士生导师，E-mail:gaoxj5390@敖金霞1，高学军1*，仇有文1，郭士成2（1．东北农业大学生命科学与生物技术研究中心，农业部转基因生物产品成分监督检测测试中心，哈尔滨150030；2．东北农业大学生命科学学院，哈尔滨150030）摘要：实时荧光定量PCR 技术是一种新型的核酸定性、定量检测、分析技术。
随着转基因产品大规模商业化，转基因生物的环境安全和食用安全性问题引起了全球范围内广泛的争论和关注。
实时监测、定量准确、灵敏度高、反应速度快、重复性好及PCR 反应后不需电泳检测等优点，使RQ-PCR 逐步成为转基因检测的重要工具。
关键词：实时荧光定量PCR ；Taq Man 探针法；SYBR Green I 染料法；转基因检测中图分类号：TS207.3文献标识码：A随着有关转基因成分标签法的建立和对于转基因食品的重视程度及量化要求的提高，定性PCR 因其在转基因检测中的高敏感性差易造成假阳性现象，以及操作误差和一些反应抑制因素带来的假阴性现象，使其已经不能再满足人们的需要。
在这种基础之上实时荧光定量PCR（Real-time quantitative polymerase chain reaction ，RQ-PCR ）发展起来，RQ-PCR 技术不仅实现了对DNA 模板的定量，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点。
目前实时荧光定量PCR 已广泛应用于分子生物学、农业、医学等学科的应用和基础研究领域，并已经在转基因检测中发挥了不可替代的作用[1-2]。
1R Q -PC R 的基本原理实时荧光定量PCR 技术是指在PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监测整个PCR 进程，最后通过标准曲线，对待测样品中的未知模板进行定量分析的方法。
转基因筛选实验报告
竭诚为您提供优质文档/双击可除转基因筛选实验报告篇一：转基因小鼠鉴定实验转基因小鼠鉴定实验在刚出生产出的鼠仔中，属转基因小鼠者，约占全部仔小鼠的20％-30％。
因此，对转基因小鼠必须进行鉴定筛选。
1．转基因整合检测鉴定转基因小鼠最简单的方法是从小鼠尾尖提取基因组DnA，检测其基因型。
检测方法包括pcR和shouthern杂交。
（1）基因组DnA的提取：1）将离乳期小鼠（>4周龄）麻醉标记。
2）用一只手抓住小鼠，另一只手持消毒剪剪下约1cm 的鼠尾。
（2）pcR检测：转基因的初始筛选通常采用pcR检测技术。
该技术操作简便、快速、费用低而有效，适合大量标本的分析。
由于该技术特别敏感，可能产生假阳性结果。
因此，在操作过程中必须特别小心，避免质粒DnA或其它标本的基因组DnA的污染。
假阳性的产生对转基因小鼠的筛选工作将是致命的。
pcR实验应采用双复管，甚至三复管。
阳性结果最好用southern杂交技术进一步证实。
（3）southernblot分析：该技术虽然没有pcR技术那样敏感，且费力费时，但是避免了因污染导致假阳性结果的麻烦，可以得到目的基因整合后的基因组、整合位点数目、转基因拷贝数等的确切信息。
southernblot的实验操作参见第一章的第八节。
2．转基因表达检测转基因整合检测是确定目的基因是否整合到了小鼠的基因组中，同时可确定整合的位点和拷贝数，这在遗传学上是十分重要的。
而转基因表达检测是确定目的基因在转基因小鼠器官组织中表达的时空分布。
其检测包括RnA分析技术和蛋白质检测技术。
篇二：转基因技术综述动物转基因技术研究进展及其应用前景孙凤俊张佳谊韩广文（北京奶牛中心北京延庆102100）摘要：转基因技术作为生命科学的前沿技术之一，已经逐渐走入了人们的生活。
转基因技术可以认为是在一定程度上通过科学技术手段让其他生物、植物朝着对人类有利方向发展的技术。
本文介绍了转基因技术及其应用研究现状，并预测了未来发展前景，阐述了该技术的利弊关系，指出只有通过正确的引导和规范管理，才能很好地利用该技术，使它为人类服务。
Bt玉米中微量元素锂、硒、钼、铬含量测定
第２７卷，第８期２Ｏ０７年８月光谱学与光谱分析Ｓｐ∽￡ｒ。
ｓ∞ｐｙ矗工１ｄＳｐｅｃｔ豫ＩＡｍｌｙｓｉｓＶ０１．２７，Ｎ“８，ｐｐｌ６３８一１６３９恕１９ｕｓｔ，２００？Ｂｔ玉米中微量元素锂、硒、钼、铬含量测定郝彦玲１，芮玉奎“，郭晶１，罗云波１，黄昆仑“２，朱本忠１１．中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京ｌ。
００８３２农业部农产品质量安全监督检验测试中心，北京１０００８３摘要随着转基因食品的推广应用，人们越来越关心其食用安全性。
以转Ｂｔ基因玉米及其亲本为实验材料，借助于ｌｃＰ＿Ｍｓ对其中人体必需的微量元素锂、硒、镅和铬进行ｒ测定。
结果显示，外源基因的整合导致了锂、硒、钼和铬含量减少，这对玉米的营养价值非常不利；特别是转Ｂｔ基因玉米中硒和钼，成倍减少。
这些结果说明转基因技术如果控制不严可能会对玉米的食用安全性产生不良影响，转基因植物的推广应用应当严格审查。
转Ｂｔ基凼玉米吸收上述微量元素减少的原因尚需进一步研究。
关键词转基因食品安全；ＩｃＰ＿Ｍｓ；微量元素中图分类号：０６５７．３文献标识码：Ａ文章编号：１０００一０５９３（２００７）０８—１６３８０２引言转基因植物的商业化发展速度加快，在带来提高农作物的产量和品质、增强农作物的抗逆性和抗虫等方面好处的同时，也由于转基因食品安全性及生态安全等方而的原因，引起了消费者和科研工作者的担心和兴趣，各国政府相继制定了新的法规，些相关的检测手段也在不断地完善中ｊ］，然而法律法规的建立必须建立在严格的安全性审查基础上。
转基因植物的食用和牛态安全性审查除Ｊ，对外源基因和外源蛋白危害的研究以外，还包括毒素的累积和营养元素的含量洌ｊ定。
人体必需的微量和超微量元素是维持生命所必需的，缺乏时会导致死亡或严重功能不良。
它们具有重要的生物学功能，共有ｆ。
几种元素，Ｌｉ，Ｆｅ，Ｉ，ｃｕ，Ｍｎ，ｚｎ，ｃｏ，Ｍｏ，Ｓｅ，ｃｒ．Ｓｎ，Ｖ，Ｆ，ｓｉ和Ｎｉ等，他们具有重要的生物学功能，（１）输送宏量元素；（２）生物催化作用；（３）参与激素和维生素的作用；ｆ４）影响核酸代谢等。
利用可视化蛋白芯片快速检测黄瓜绿斑驳花叶病毒
利用可视化蛋白芯片快速检测黄瓜绿斑驳花叶病毒胡娟;周小平;韩舜愈;朝慧;王军平【摘要】黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)是瓜类作物上重要的病原病,需建立快捷、准确的检测方法.以硝酸纤维素膜为固相载体,采用 ELISA双抗夹心法建立了对CGMMV的可视化蛋白芯片检测方法,并对捕获抗体稀释倍数、样品孵育时间、酶标抗体孵育时间、显色温度等进行优化.结果表明,最佳检测条件为：捕获抗体稀释倍数1∶5,样品20℃孵育1 h,酶标抗体20℃孵育1 h,20℃ 15 min显色.以50批葫芦科种子为样品,对可视化蛋白芯片检测与DAS-ELISA检测进行了比较,其检测结果吻合率达98.0%；经 PCR检验,检测结果一致性良好.说明该方法能对植物病毒做出快速、准确的检测.%Cucumber green mottle mosaic virus (CGMMV)is one of the most important viruses in cu-curbit crops.Development and application of accurate and easy methods of CGMMV detection is essential for the prevention and control of associated diseases.An antibody macroarray procedure was developed and its usefulness for the detectionof CGMMV was demonstrated in this study.The macroarray assay was based on a ‘sandwich’ELISA format,using a chromogenic dye,and consists of viral antibodies dotted di-rectly on nitrocellulose membrane (NCM).Using the conventional immunoassay ELISA technique as a benchmark,the optimized procedure was used to detect CGMMV.The results indicated that good reaction signals were based on coating antibody dilution factor 1∶5,sample incubated 1 h at 20 ℃,enzyme-linked an-tibody incubated 1 h at 20 ℃,substrate chromogenic reacted 15 min at 20 ℃.This method was further vali-dated by testing 50 lots of melonseeds,the coincidence rate was 98.0% between the results of antibody macroarray and that of ELISA.The results indicate that the developed antibody macroarray is sensitive and easy to use for diagnosis.【期刊名称】《甘肃农业大学学报》【年(卷),期】2014(000)005【总页数】7页(P116-122)【关键词】可视化蛋白芯片;黄瓜绿斑驳花叶病毒;ELISA检测【作者】胡娟;周小平;韩舜愈;朝慧;王军平【作者单位】甘肃农业大学草业学院，甘肃兰州 730070;甘肃省出入境检验检疫局，甘肃兰州 730020;甘肃农业大学草业学院，甘肃兰州 730070;甘肃省出入境检验检疫局，甘肃兰州 730020;甘肃省出入境检验检疫局，甘肃兰州 730020【正文语种】中文【中图分类】S436.421.1黄瓜绿斑驳花叶病毒（Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV）是瓜类作物上重要的病原病毒，是寄主最多、分布最广、对农作物危害最为严重的植物病毒之一，主要危害黄瓜、南瓜、西瓜等葫芦科作物，引起斑驳、花叶、畸形、果实腐烂、植株矮化等症状，造成严重产量损失，对葫芦科作物的安全生产构成了巨大威胁［1－4］，为我国进境植物检疫性有害生物.因此，准确及时地进行病原体检测，对研究黄瓜绿斑驳花叶毒病的发生发展规律、预测预报以及制定防治措施等具有重要意义.目前酶联免疫法（ELISA）是检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的主要检测方法，但一次反应只能检测一种病原体，耗时24 h至数天不等，操作复杂，灵敏度和检测效率不高，且难以判断其检测特异性.而同样基于分子生物学的蛋白芯片检测法，以硝酸纤维素膜（nitrocellulose membrane）为载体，结合较聚苯乙烯更加有效，提高了对蛋白质的亲和力，给蛋白提供了较大的结合表面，从而提高了检测的灵敏度［5］.该方法还具有样点较大，集成度较低，适合目视化检测［6］的诸多优点.硝酸纤维素膜检测限可达到或超过微孔板ELISA，已用于多种植物病原的检测［7－12］.因此，为了摸索一种简便、实用的CGMMV检测方法，本研究建立了基于酶联免疫法的CGMMV可视化蛋白芯片检测法，并对包被稀释倍数、样品孵育时间、酶标抗体孵育时间、显色温度进行了比较和优化，并对CGMMV特异性进行了检测.同时利用该法对50批葫芦科种子样品进行检测，以评估可视化蛋白芯片检测的敏感度和特异性及其实际应用前景.1.1 材料与试剂硝酸纤维素膜（孔径0.22μm，美国Millipore公司）；黄瓜绿斑驳花叶病毒、烟草环斑病毒（tobacco ring spot virus，TRSV）、南瓜花叶病毒（squash mosaic virus，Sq MV）、番木瓜环斑病毒（papaya ring spot virus，PRSV）、马铃薯Y病毒（potato virus Y，PVY）阳性对照物（美国Agdia公司）；碱性磷酸酶标记的驴抗山羊Ig G（碧云天生物技术研究所）；显色底物5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐／四唑硝基蓝（BCIP／NBT，天津TIANGEN）；脱脂奶粉（内蒙古伊利实业集团股份有限公司）.1.2 可视化蛋白芯片检测的基本步骤裁剪硝酸纤维素膜（1.2 cm×1.6 cm），经过压迹（点间距0.3～0.5 cm），用去离子水浸泡20 min，37℃干燥20 min.将包被缓冲液（Na2CO31.59 g，Na HCO32.93 g，Na N30.2 g，dd H2O 1 000 m L，p H 9.6）稀释的捕获抗体、阳性对照（碱性磷酸酶标记的驴抗山羊Ig G）与阴性对照（点样缓冲液）分别依次点样在硝酸纤维素膜上，组成阵列（图1-A）.37℃固定10 min，用含5%脱脂奶粉、5 mmol／LEDTA的PBST缓冲液（PBS＋0.05%Tween-20，p H7.4）经65℃水浴10 min做封闭液，37℃封闭30 min.PBST洗涤1 min，重复3次.制备好的芯片在4℃条件下保存备用.加检测样品（每芯片300μL）与芯片室温振荡（60 r／m）充分反应→PBST洗涤1 min，重复3次→用含1.2%脱脂奶粉的PBST按200∶1稀释CGMMV酶标记检测抗体加至芯片表面→PBST洗涤1 min，重复3次→用NBT／BCIP显色底物充分显色→用去离子水终止反应，晾干保存结果→目视直接观测或以扫描仪获取结果.1.3 捕获抗体稀释倍数的优化试验步骤同1.2.用点样缓冲液（Na2CO31.59 g，Na HCO32.93 g，NaN30.2 g，dd H2O 1 000 m L，p H 9.6）分别以1∶2.5、1∶5、1∶10、1∶20、1∶40、1∶60倍数稀释捕获抗体，依照图1-A点样，每点0.3μL.对比不同浓度对检测结果的影响.1.4 检测样品孵育时间的优化试验步骤同1.2.以5倍提取缓冲液（聚乙烯吡咯烷酮MW24000～40000 20.0g，Na2SO31.3 g，NaN30.2 g，卵清蛋白2.0 g，Tween-20 20.0 g，PBST定容到1 000 mL，p H7.4）稀释的CGMMV阳性对照液为检测样品，分别与可视化蛋白芯片室温振荡（60 r／m）充分反应，反应时间分别设为1、2、3、4、5 h.观察不同样品反应时间对检测结果的影响.1.5 酶标抗体孵育时间的优化试验步骤同1.2.用PBST（含1.2%脱脂奶粉）按200∶1稀释CGMMV酶标记检测抗体，分别取300μL加至芯片表面，反应时间分别为1 h（20℃）、3 h （20℃）、过夜（4℃，超过12 h）.观察相同反应条件下，酶标抗体反应时间对检测结果的影响.1.6 显色温度的优化试验步骤同1.2.酶标抗体反应后，洗涤.取碱性磷酸酶稀释缓冲液、BCIP、NBT，按20∶1∶1的比例配制的相应显色底物混合液，加于芯片表面分别以20℃避光孵育和4℃避光孵育15 min，观察不同显色温度对检测结果的影响.1.7 可视化蛋白芯片的反应与检测特异性测试：以5种病毒抗体包被（TRSV，PRSV，WMV，CGMMV，PVY）的可视化蛋白芯片分别检测4批种子样品.用ELISA已检测其中2批种子带有CGMMV阳性，另2批为无病毒的健康种子.每种样品称取2克，分别在灭菌研钵中研碎.粉末与提取缓冲液按1∶5（2 g种子粉末：10 m L提取缓冲液）配制种子样品液.取带CGMMV的种子样品和健康种子的样品液各300μL，与可视化蛋白芯片室温振荡（60 r／m）充分反应1 h.PBST洗涤1 min，重复3次.用PBST（含1.2%脱脂奶粉）按200∶1稀释TRSV，PRSV，WMV，CGMMV，PVY5种酶标抗体，配成检测混合液，分别取300μL混合液加至各芯片表面，室温振荡（60 r／m）孵育1 h洗涤.将配制好的相应显色底物混合液加于芯片表面20℃避光孵育15 min显色，dd H2O洗涤终止反应，晾干保存结果.目视直接观测或以扫描仪获取结果，用Quantity One软件分析灰度.灵敏度测试：用提取缓冲液梯度稀释，把CGMMV阳性对照液分别稀释成21，22，23，24，25，26，27，28，29，210，各取300μL与可视化蛋白芯片反应，设计如图1-C所示.另参照CGMMV DAS-ELISA检测试剂盒推荐流程，同步检测梯度稀释的病毒阳性液.重复性验证：以同浓度的稀释液与芯片反应，2次重复试验，以验证检测稳定性. 1.8 葫芦科种子样品的检测以可视化蛋白芯片检测50批葫芦科植物种子样品（西瓜、甜瓜、南瓜、西葫芦），配制种子样品液.分别用DAS-ELISA法和可视化蛋白芯片检测50批种子样品抽提液是否含有CGMMV.对检出的阳性，以PCR法复检，对比检测结果，评估其对实际样品的检测能力.2.1 包被抗体稀释倍数的选择如图2所示，斑点颜色呈蓝紫色为阳性，固定被检测的病毒阳性液浓度，结合点样示意图观测到在不同的试验条件下，检测信号都是随包被抗体浓度的增加而加深.当抗体捕获抗体稀释倍数为1∶2.5和1∶5时，检测点都清晰可见，考虑到抗体的成本，建议在实际检测中以1∶5倍数稀释.2.2 检测样品孵育时间的优化图3-A为反应条件相同（酶标抗体20℃孵育时间3 h，4℃显色），3个芯片样品孵育时间分别为1、3、5 h的显色结果；图3-B反应条件相同（酶标抗体4℃过夜孵育，4℃显色），样品孵育时间分别为3、4、5 h的3个芯片的显色结果.可知，在酶标抗体等孵育条件相同，随着孵育时间的增加，样品和阳性对照的显色信号强度都得到了增强.样品孵育时间越长，显色越明显.因为反应时间的延长有利于反应充分进行，提高了杂交信号，但考虑到芯片检测的时效性，以得到肉眼可见的显色信号为目的，建议样品孵育时间为1 h即可.2.3 酶标抗体孵育时间的优化由图4所示，在相同的样品孵育时间和相同的包被浓度条件下，随着酶标抗体孵育时间增加，最终显色信号强弱差别不大.以样品孵育3 h为例，2抗孵育时间分别为1 h和过夜（超过12 h），对较高的包被抗体浓度（稀释比例为1∶2.5，1∶5，1∶10）的最终显色影响并不大，而较低浓度的包被抗体（稀释比例为1∶20，1∶40）在酶标抗体反应1 h并无显色，但在过夜后最终能有略微显色.在基层检测中，建议酶标抗体孵育时间为1 h，室温即可.2.4 显色温度的优化按厂家的说明书NBT／BCIP显色液配比比例为1∶1∶20的条件下，4℃和20℃显色15 min后信号强弱基本无差别，但在20℃室温条件下显色时间越长，显色液越容易变浑浊，也会污染芯片，但4℃显色在30 min时显色液并无浑浊（图5-A）.本试验采用的显色时间为15 min.若作为普通工作站检疫，室温显色即可（图5-B）.2.5 特异性测试如图6所示，可视化蛋白芯片对2种带CGM MV病毒的植物种子检测结果均显示较强阳性；同时芯片上其他病毒（TRSV，PRSV，WMV，PVY）的样点均无显色.结果表明，显示可视化蛋白芯片对CGMMV具有良好的检测特异性.2.6 灵敏度测试随着CGMMV阳性病毒液稀释倍数的增加，测试信号的强度逐渐减小（图7）.可视化蛋白芯片在CGMMV阳性病毒液27倍稀释，仍能从芯片观测出显色斑点.以扫描仪获取芯片结果，Quantity One软件分析灰度，利用阳性对照点灰度值对比得出各芯片检测点灰度值，归一化处理后，将各片9个点的灰度值相加再得出平均值作为此芯片的灰度值，绘制阳性对照物病毒浓度与检测灰度值的关系曲线，拟合曲线R2＝0.954 5，表明阳性对照物病毒浓度与灰度值间有一定的线性相关性.随着阳性对照物病毒液的梯度稀释，检测点灰度值也呈现递减的趋势.在对CGMMV阳性种子抽提液的检测中，ELISA法的检测灵敏度为26（以D405＝2.0为标准），并随着浓度变化呈现与芯片相同的线性递减趋势.2.7 重复性测试以同浓度的阳性对照液与芯片反应，2次重复试验结果，显示可视化蛋白芯片具良好的检测稳定性.2.8 种子样品的检测以可视化蛋白芯片检测50批葫芦科种子样品，对比ELISA结果（表1），评估可视化蛋白芯片实用前景.微孔板ELISA法检测50批样品，阳性率为4.0%（2／50），可视化蛋白芯片检测阳性率也为4.0%（2／50），显示其对种子样品具有与ELISA法同等的检测能力.2.9 检测灵敏度验证以PCR法对检出的阳性种子样品进行扩增，与可视化蛋白芯片对比灵敏度.图4显示直接PCR法对同批样品的检测结果与可视化蛋白芯片检测结果一致.说明可视化蛋白芯片的检测灵敏度与PCR等同.1） CGMMV可视化蛋白芯片检测法的得到最佳检测结果的条件为捕获抗体稀释倍数1∶5，样品20℃孵育1 h，酶标抗体20℃孵育1 h，20℃、15 min显色. 2）可视化蛋白芯片检测与DAS-ELISA检测结果吻合率达到98.0%，经PCR检验后，与ELISA检测结果一致性良好.芯片表面同时包含阳性对照点、阴性对照点和检测点，不需另外设计对照试验，可有效简化试验操作.检测结果以肉眼判断，实现对CGMMV的快速检测，提高了检测效率，说明该方法优于传统的DAS-ELISA法.3） CGMMV可视化蛋白芯片检测方法可快速检测目标病原，对设备依赖度低，操作简易，适用于检测实验室和基层实验室，适合在生产中广泛的推广应用.随着国际贸易的快速发展，这种可视化、高效的芯片检测技术为口岸植物病毒检疫提供了新的技术手段，展现出较好的应用前景［14－15］.参考文献［1］陈红运，赵文军，程毅，等.辽中地区西瓜花叶病病原的分子鉴定［J］.植物病理学报，2006，36（4）：306-309［2］周玲玲，吴元华，赵秀香，等.黄瓜绿斑驳花叶病毒生物学特性及对西瓜生长的影响Ⅲ［J］.沈阳农业大学学报，2008，39（4）：417-422［3］Lee K Y，Lee B C，Park H C.Occurrence of cucumber green mottle mosaic virus disease of watermelon in Korea［J］.Korea J Plant Pathol，1990（6）：250-255［4］Park J W，Cheon J U，Choi H S.Occurence and control of seed-borne plant viruses in Korea［C］∥Crop Prot Res Rural Development Administration，2001：194-218［5］Zhang N，McCarthy M L，Smart C D.A macroarray system for the detection of fungal and oomycete pathogens of Solanaceous crops ［J］.Plant Disease，2008，92（6）：953-960［6］梁巧兰，魏列新，徐秉良.侵染观赏百合的黄瓜花叶病毒血清学检测方法研究［J］.甘肃农业大学学报，2009，44（3）：97-101［7］Yatsushiro S，Yamamura S，Yamaguchi Y，et al.Rapid and highly sensitive detection of malaria infected erythrocytes using a cell microarray chip［J］.PLOS 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玉米品种联创9号
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影 响
ห้องสมุดไป่ตู้
参考文献 ：
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１９ ２ （ ）９ — ６ ９ ８，２ ２ ： ４ ９ ．
肾脏 是 氟 的主要 排泄 器 官 ． 过 肾 小球 的过 滤 通 与 肾小 管 的重 吸收 来完 成 ． 若摄 氟量 超 过机 体 的正 常 排泄 承受 能力 时 ． 排氟 能力 并 不随 摄氟 量 的增 其
主要农作物种子转基因检测方法及应用
主要农作物种子转基因检测方法及应用甄 贞1，2 高学军1，2 张明辉1，2（1东北农业大学生命科学学院，哈尔滨150030；2农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心，哈尔滨150030）摘要：每年我国进口大量的转基因大豆、玉米等农产品，目前也正在研发多种转基因农作物新品种。
按照我国和国际有关法律法规，需对农作物的种子和加工制品进行转基因成分检测，确定为非转基因产品或将转基因成分标识后才可以进入市场流通，对于正在研发的转基因新品种也需通过检测进行监管。
对我国主要农作物种子转基因检测方法的实际应用进行了综述，包括种子产品抽样、核酸定性、定量检测（通用元件检测、品系特异性检测等）、蛋白定性检测（试纸条快速检测）等方法。
旨在为有关农作物种子生产、经营、产品加工和管理及研发工作者提供相关技术信息。
关键词：转基因；农作物；定性检测；定量检测；试纸条转基因生物（GMO，genetically modified organism）是利用基因重组技术引入其他生物或物种的基因而培育出来的生物新品种。
转基因技术使农作物获得自身不具有的抗病、抗虫、耐除草剂、抗逆境和高产优质等特性。
转基因农作物自1996年商品化以来，种植面积不断扩大，目前全球转基因作物的种植面积已达到2亿多hm2，主要品种为大豆、玉米、棉花、油菜等[1-2]。
1996-2016年全球共有30多个国家种植转基因作物，目前我国获批商品化种植的转基因作物只有抗虫棉花、抗病番木瓜，种植面积为2.8亿hm2，其他转基因作物尚未实现商品化种植[3-4]。
转基因作物在商品化种植前均经过安全评价，尚未发现转基因农作物存在安全风险。
欧盟委员会历时25年，通过130多项研究得出的结论是：生物技术，特别是转基因技术，并不比传统育种技术危险。
世界卫生组织认为，目前尚未显示广大民众使用转基因食品后对人体健康产生了任何影响。
但由于食用安全评估的长期性和复杂性，目前也无法定论转基因食品的安全问题，始终争议较大。
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利用可视化膜芯片检测9种转基因玉米
DOI：10.14088/jki.issn0439-8114.2016.11.055
转基因作物进入食品领域后，有关转基因食品安全性的问题备受关注。
为保护消费者的知情权，中国、日本、韩国及一些欧盟成员国均颁布了食品标签相关法律法规，要求对食品中成分进行明确标识（包括是否包含转基因成分），这就需要建立简便、快速、准确的方法来满足日常检测的需求。
目前，现有技术主要是基于PCR[1，2]或多重PCR结合电泳检测的方法[3]、实时荧光定量PCR[4]及基于免疫学的ELISA[5]。
由于DNA容易在各种生物样本中获得高度的稳定性，基于PCR的方法更有优势。
然而，传统PCR方法只能针对单一基因进行检测。
多重PCR虽可同时扩增多重靶标，但很难在后续电泳检测中区分大小相近的片段。
同时，基于PCR的方法还存在检测通量低的局限。
基因芯片具有高通量、微型化、自动化的技术优势。
近些年，有研究报道了应用基因芯片结合多重PCR技术检测转基因事件[6，7]，但现有基因芯片技术主要以荧光为检测手段，分析仪器昂贵，并对操作人员具有较高的技术要求。
本研究拟建立一种基于膜芯片的可视化基因芯片检测方法，该方法将碱性磷酸酶与底物之间的酶学显色反应引入检测体系，使阳性结果在芯片表面形成裸眼可见的点，检测结果可裸眼观察，同时也可配套灰度扫描仪进行定量分析。
1 材料与方法
1.1 试验材料
转基因材料主要为种子和玉米粉，包括转基因玉米（Bt176、Bt11、MON810、GA21、T25、TC1507、DAS-59122、NK603、MIR604）、转基因棉花（MON1445、MON15985）、转基因大豆（GTS40-3-2）及非转基因材料。
1.2 试剂及仪器
植物基因组DNA提取试剂盒（DNeasy Plant Mini Kit）、多重PCR试剂盒（Multiplex PCR kit）均为Qiagen公司产品；核酸杂交试剂（DR. Chip DIY KitTM）为台湾晶宇生物科技公司产品；点样仪（晶芯SmartArrayer TM-16型）为北京博奥生物芯片XX公司产品；杂交尼龙膜为美国Pall公司产品；PCR仪（Bio-rad）、紫外交联仪（Scientz03-Ⅱ型）为宁波新芝科技XX公司产品。
1.3 引物及探针设计
采用软件Prime premier 5.0设计引物，共10对。
为使PCR 适用于加工过的材料，引物按以下原则选取：①扩增产物长度在100～300 bp；②解链温度在55～60 ℃；③适合多重PCR。
引物5′端以生物素修饰。
探针共12组（包含杂交阳性及阴性质控探针），探针设计应用网络在线设计工具（http：
.tw/ups/）获得，同时，以玉米醇溶蛋白基因（Zein）作为内源参照基因设计探针，以EV71病毒基因特异性探针作为杂交阳性质控（生物素化EV71病毒基因PCR产物
由DR. Chip DIY KitTM试剂盒提供），poly（T）30作为杂交阴性质控，所有探针5′端以poly（T）15修饰。
引物及探针序列由生工生物工程（上海）XX公司合成。
引物及探针序列见表1。
1.4 膜芯片制备
应用芯片点样仪将合成探针按预设模式点样于尼龙膜上（图1），阴性、阳性杂交质控探针浓度为10 μmol/L，其他探针浓度为20 μmol/L。
探针点好后自然风干，于紫外交联仪中交联，波长254 nm， 3 min。
紫外交联后用0.01 mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）-0.05%Tween 20漂洗3次，再用去离子水漂洗3次，风干密封，4 ℃保存备用。
1.5 基因组DNA提取
所有测试样本基因组DNA用植物基因组DNA提取试剂盒（DNeasy Plant Mini Kit）提取，操作步骤参见试剂盒说明。
应用紫外分光光度计测定DNA的纯度和浓度。
1.6 多重PCR扩增
将样本DNA浓度稀释至50～100 ng/μL，于0.2 mL PCR反应管中依次加入PCR缓冲液、dNTP、DNA模板、引物、Hotstar Taq 酶，补充去离子水至30 μL，各组分浓度参照试剂盒说明书。
多重PCR条件如下：94 ℃变性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 10 min。
1.7 芯片杂交及结果判定
PCR产物于PCR仪中95 ℃变性5 min后立即置于冰上，3 min
后取5 μL与100 μL杂交缓冲液（杂交缓冲液含有杂交阳性质控探针互补片段）混匀，加样于芯片点样区，用盖玻片封闭，于45 ℃杂交40 min。
杂交完成后，用清洗液（DR. Chip DIY KitTM 试剂盒提供）清洗2次，再滴加100 μL 1∶1 000稀释的Streptavidin-AP孵育15 min，用清洗液清洗2次，加入50倍稀释的底物NBT/BCIP，避光室温反应5 min后弃掉显色液，用去离子水洗2次，吹干，裸眼观察杂交结果。
2 结果及分析
2.1 芯片检测的特异性
芯片检测特异性与探针特异性密切相关，本研究应用在线探针设计程序UPS设计了相关转基因玉米的探针[8-10]。
为了验证芯片检测的特异性，应用制备的膜芯片检测商业化的转基因材料（玉米、棉花、大豆）及非转基因材料。
为提高检测效率，首先对作物种类进行初筛。
选择玉米醇溶蛋白基因作为玉米的内源参照基因，同时为验证杂交过程的正常进行，以EV71相关序列设计了杂交阳性质控（其互补序列整合在试剂盒提供的杂交缓冲液中）。
图2为芯片检测的鉴定结果，对应探针位点、内源参照基因位点和阳性质控位点均有明显的信号响应。
转基因大豆、棉花及非转基因材料除杂交阳性对照点外，无任何信号反应。
同时，对芯片鉴定的样本也进行了PCR产物测序比对分析，与芯片鉴定结果一致。
结果表明，芯片具有良好的检测特异性。
为了进一步检验芯片多重靶标分析的能力，将不同转基因株系基因组DNA混
合进行多重PCR，然后进行芯片检测，结果如图3所示。
由图3可见，制备的检测芯片可以进行多靶标的同时检测。
芯片上不同点之间信号强度存在一定差异，这是由于在多重PCR 过程中不同引物对之间相互影响，导致不同的扩增效率，但并不影响对多重靶标的同时鉴定。
2.2 芯片检测的灵敏度
为了确定芯片检测的灵敏度，以Bt176为材料，将转基因玉米Bt176与非转基因玉米按不同比例混合（转基因玉米占总混合材料0.1%、0.5%、1.0%、2.0%、5.0%、10.0%），以此混合样品提取DNA后进行PCR扩增，应用检测芯片进行检测。
结果表明（图4），随着转基因成分含量逐渐减少，杂交信号逐渐减弱，0.5%的转基因Bt176就可以被检测出来。
2.3 芯片检测的重复性
为了测试芯片检测的重复性，利用同批次及不同批次制备的芯片对同一个转基因株系样本Bt176进行检测，批内及批间制备的芯片均成功鉴定，结果表明检测芯片具有良好的重复性。
3 小结
本研究建立的可视化膜芯片技术可同时检测9种转基因玉米，减少了对昂贵仪器的依赖及对操作人员的技术要求，具有快速、准确、廉价及简便易行的特点，在转基因作物检测领域具有潜在的应用价值。