PCR方法扩增种属特异性片段检测猪源成分
生物检测技术PCR及其在兽医微生物检测中的应用
生物检测技术PCR及其在兽医微生物检测中的应用朱善元(江苏省畜牧兽医学校,江苏泰州225300)关键词:PCR;引物;DNA聚合酶;微生物检测摘 要:简述生物检测新技术PCR的原理、特征,及其在兽医微生物检测中的应用。
归纳和小结了其在临床传染病诊断中的应用领域,对从事畜禽疾病诊断、防治的工作人员进一步掌握和运用PCR技术具有一定的指导意义。
中图分类号:S813.3 文献标识码:A 文章编号:1004-7034(1999)11-0021-02 PCR聚合酶链式反应(Polymerase chainreaction,PCR)也称无细胞分子克隆系统,是1985年由美国的K ary Mullis等人首创并由美国G etus公司开发的一项专利,应用该方法可使极微量的特定DNA片断在几小时内迅速扩增到百万倍。
具有特异性强,灵敏度高和快速准确的优点,因而发展迅速,应用范围越来越广泛,不仅可用于基因表达调控,基因克隆与测序,制备特异探针,特异基因筛选等基础研究,而且在医学、农业科学、食品科学、环境科学及考古学等领域得到了广泛的应用。
本文着重介绍其作为一项最新的生物检测技术并简述其在兽医微生物检测的应用。
1 PCR技术的基本原理根据已知的待扩增的DNA片段序列、人工合成与该DNA 两条链末端互补的两段寡核苷酸引物,在体外将待检DNA序列(模板)在酶促作用下进行扩增,这种方法也就是PCR技术。
PCR全过程可分为DNA模板变性、退火、延伸三个连续步骤,经若干个循环所组成。
首先高温作用使模板DNA变性解链,然后降低温度使人工合成的两个寡核苷酸引物与模板DNA 链3′端退火,在Taq DNA聚合酶作用下,有4种dN TP底物存在时,引物链将沿着5′～3′方向延伸与模板互补的新链,新链则可作为下一次反应的模板,由于每一循环的产物都可作为下一循环反应的模板,因此扩增产物的量以指数级方式增加。
通常单一拷贝的基因经25～30循环可扩增100万～200万拷贝。
种属鉴定pcr
种属鉴定pcr种属鉴定PCR引言：种属鉴定PCR是一种常用的分子生物学技术，通过特异性引物和DNA扩增酶，对不同种属的生物进行鉴定。
本文将介绍种属鉴定PCR的原理、应用以及优缺点。
一、种属鉴定PCR的原理种属鉴定PCR是基于DNA序列的差异进行的。
DNA是生物体内的遗传物质，不同物种的DNA序列存在着差异，这些差异可以用于种属鉴定。
种属鉴定PCR的基本原理是，利用特异性引物选择性地扩增目标DNA片段，然后通过凝胶电泳等方法对扩增产物进行分析，从而确定待鉴定生物的种属。
二、种属鉴定PCR的步骤种属鉴定PCR通常包括以下几个步骤：1. DNA提取：从待鉴定生物的组织或样品中提取DNA，常用的提取方法有酚-氯仿法、盐法等。
2. 引物设计：根据目标物种的DNA序列差异，设计特异性引物。
引物应具有高度特异性，只能与目标物种的DNA序列互补结合。
3. PCR反应：将DNA模板与引物、核酸酶、缓冲液和dNTPs等反应物混合，进行PCR扩增反应。
PCR反应通常包括退火、延伸和变性等步骤，反复循环进行。
4. 凝胶电泳：将PCR扩增产物经过凝胶电泳分离，根据目标DNA 片段的大小，观察是否与标准DNA条带相一致，从而确定待鉴定生物的种属。
三、种属鉴定PCR的应用种属鉴定PCR在生物学研究和实际应用中具有广泛的应用价值。
以下是几个典型的应用领域：1. 动植物种属鉴定：种属鉴定PCR可以快速准确地鉴定动植物的种属，对于生物多样性研究和环境保护具有重要意义。
2. 食品安全检测：通过种属鉴定PCR可以检测食品中是否存在非法添加物种，保障食品安全。
3. 法医学鉴定：种属鉴定PCR可以应用于法医学领域，帮助破案和解决争议。
4. 病原体检测：种属鉴定PCR可以用于病原体的快速检测，对于疾病的早期诊断和防控具有重要意义。
四、种属鉴定PCR的优缺点种属鉴定PCR具有以下优点：1. 高度特异性：种属鉴定PCR利用特异性引物，对目标DNA片段进行选择性扩增，结果准确可靠。
猪病诊断和防治中PCR技术的应用研究
猪病诊断和防治中PCR技术的应用研究近年来，随着生物技术的发展，PCR技术已经成为了现代生物学研究中一个不可或缺的工具。
在猪病诊断和防治中，PCR技术也得到了广泛的应用。
本文将从PCR技术的原理、优势以及在猪病诊断和防治中的应用等方面进行介绍。
一、PCR技术原理1.高效性：PCR技术只需微量的DNA样品就能扩增出足够的DNA数量进行PCR分析，大大节约实验时间和实验成本。
2.特异性：PCR技术基于引物和反应条件的匹配，可以精确扩增所需的DNA序列，并减少其他DNA的扩增。
3.检测灵敏度高：PCR技术可以扩增微量的DNA模板，还可以进行嵌套PCR、荧光PCR 等改良后的PCR技术，灵敏度可以达到10^-18。
4.全基因组与全转录组扩增：PCR技术可以在短时间内，扩增目标DNA的特定区域，开展全基因组或全转录组扩增，扩增速度快、操作方便，且可同时检测多个基因。
1. 常见猪病的PCR诊断：PCR技术可以检测出许多猪病的病原体，如ASFV（非洲猪瘟病毒）、PRV（猪瘟病毒）、PCV2（猪圆环病毒2）、PEV（猪拟肠杆菌），大幅提高疾病诊断的准确性。
2. 病原体检测：PCR技术可以检测毒病原体的存在，其检测灵敏度较高，能捕捉到低浓度的病原体。
3. 疫苗制备：PCR技术可以在短时间内为疫苗制备提供需要的病毒基因组，有效的提高了疫苗的制备水平。
4. 病原体载量监测：猪病防治中，及时监测病原体的载量和变化，有助于领导部门及时制定科学的防控策略和治疗方案，从而提高疫情防控效果。
5. 常见猪病的预防与控制：利用PCR技术对猪病病原体的检测，可为预防和控制常见猪病打下稳固的基础。
四、结论PCR技术的出现，极大地提高了猪病诊断和防治的水平。
猪病的早期诊断和病原体的迅速鉴定，极具重要性。
因此，相信在未来的进一步研究中，PCR技术必将得到广泛的应用，并成为猪病防治领域中的重要工具。
利用PCR法检测熟牛肉的肉源性
科技文苑May 2020 CHINA FOOD SAFETY 551 引言随着社会的发展，人们的生活水平不断提高，对肉制品的要求也越来越高。
但是，肉制品市场存在肉类掺假、以次充好等欺骗消费者的行为，不法商贩为了追求自身利益以“挂羊头卖狗肉”的方式用劣质肉冒充高质量的肉制品。
利用常规的检测方法只能从感官及形态上鉴别肉类，无法从溯源层面解决肉类掺假的问题，例如对于腌制加工的熟牛肉，消费者就很难通过肉眼辨别其是否为牛肉。
随着分子生物学的发展，以DNA 为基础的PCR 技术被广泛应用于动物源性成分的检测[1-4]，即聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）溯源是以DNA 遗传物质为基础鉴别肉及肉制品。
聚合酶链式反应是一种在体外特异性扩增DNA 序列的技术，其基本过程为3个阶段的多次循环——模板双链DNA 的变性、引物与模板DNA 的退火、在DNA 聚合酶引导下的链延伸反应，且每一次循环后的扩增产物均可作为下一轮循环的模板。
就理论而言，扩增产物量呈指数形式上升，即经过n 个循环后，产物量增加到2n 倍。
此方法在动物源性成分检测、肉类掺假鉴别等应用上已有多个报道[7，8]。
本研究针对菏泽市市场上销售的肉及肉制品进行抽样检测，利用实时荧光PCR 方法鉴别牛、猪、马源性成分，以期发现是否存在掺假的情况，旨在为肉制品掺假检测提供一定的参考依据。
2 材料和方法2.1 材料12份市售熟牛肉。
2.2 仪器绞肉机，小熊电器股份有限公司；金属浴，杭州奥盛仪器有限公司；Rotor Gene Q 荧光定量PCR 仪，德国凯杰。
利用PCR 法检测熟牛肉的肉源性□ 贾南南 李建平 范美霞 菏泽市食品药品检验检测研究院摘 要：本文旨在建立实时荧光PCR 检测熟牛肉中牛、猪、马等动物源性成分的方法。
通过对菏泽市市售熟牛肉进行采样检测，提取熟牛肉中总DNA 后进行实时荧光PCR 检测，确定Ct 值，分析样品熟牛肉中牛、猪、马源性成分。
利用PCR法检测熟牛肉的肉源性
利用PCR法检测熟牛肉的肉源性PCR法是一种常用的分子生物学技术，可以用来检测熟牛肉的肉源性。
它可以快速、准确地鉴定熟牛肉来自于何种动物，比如牛、猪、羊等。
本文将详细介绍PCR法在检测熟牛肉肉源性方面的应用。
PCR法是一种体外扩增DNA的技术，通过PCR反应可以放大特定DNA片段，从而实现对目标DNA的检测和鉴定。
PCR反应通常包括三个步骤：变性、退火和延伸。
变性将DNA双链解开，使其成为单链DNA；退火将引物与目标DNA序列特异性结合；延伸则是通过DNA聚合酶的作用，在引物的引导下合成新的DNA链。
经过多轮PCR反应，可以在短时间内扩增出数百万份目标DNA片段。
在熟牛肉肉源性的检测中，首先需要从熟牛肉样品中提取DNA。
熟牛肉是经过烹饪加热处理的，其中的DNA可能已经部分降解。
提取熟牛肉DNA的方法需要选择合适的试剂盒，以确保从样品中高效提取出DNA。
提取到的DNA可以通过PCR法进行扩增。
通常会选择特定的引物，以扩增与目标物种有关的基因片段。
对于牛肉，可以选择扩增牛科动物特有的基因片段。
引物的设计需要特异性较高，以确保只扩增目标物种的DNA。
还可以设计内参基因引物，用于检测实验条件的准确性和质量控制。
PCR反应的最终产物可以通过凝胶电泳进行分析。
将PCR反应混合液注入琼脂糖凝胶槽中，通入电流后，DNA片段会在凝胶上形成带状图案。
通过与分子量标记品进行比较，可以确定PCR反应产物的大小。
为了提高PCR法检测熟牛肉肉源性的准确性和可靠性，还可以进行内部质量控制。
内部质量控制可以确保PCR反应条件正确，避免假阳性或假阴性结果的产生。
如前所述，可以设计引物扩增内参基因，用于评估实验条件的准确性。
PCR法还可以与其他分子生物学技术相结合，如测序技术和比较序列分析。
通过测序可以确定PCR反应产物中DNA序列的准确性；而比较序列分析可以将PCR反应产物与数据库中的已知序列进行比对，从而进一步鉴定熟牛肉的肉源性。
猪附红细胞体pcr检测方法的建立和初步应用
猪附红细胞体pcr检测方法的建立和初步应用文章标题：猪附红细胞体PCR检测方法的建立与初步应用在农业领域，猪附红细胞体PCR检测方法的建立和初步应用备受关注。
本文将从建立方法的过程、应用范围和未来发展等方面进行深入探讨，帮助读者全面了解这一重要的技术。
一、建立方法的过程1.1 猪附红细胞体PCR检测方法的原理猪附红细胞体PCR检测方法是一种基于多重PCR的检测技术，主要用于检测猪体内的特定病原体。
1.2 关键步骤和技术要点建立这一检测方法需要充分理解猪体内病原体的生物学特征，同时需要在PCR技术上进行优化，确保灵敏度和特异性。
1.3 方法的验证和实验数据经过大量实验和数据对比，可以确定该方法在猪体内病原体检测方面具有可靠性和准确性。
二、初步应用2.1 在疾病防控中的应用猪附红细胞体PCR检测方法可以用于疾病的早期诊断和监测，为疾病的控制和防治提供重要支持。
2.2 在饲养管理中的作用通过该方法的应用，可以及时检测病原体，避免疾病的传播，保障猪的生长和健康。
2.3 对农业生产的意义猪附红细胞体PCR检测方法的建立和应用，对农业生产具有重要意义，可以提高疾病检测的精准度，保障畜禽健康生产。
三、未来展望3.1 技术的改进和完善在未来，需要不断改进和完善猪附红细胞体PCR检测方法，提高其在现实应用中的效率和稳定性。
3.2 拓展应用领域除了用于猪体内病原体的检测，该技术还可以在其他动物的病原体检测中得到拓展，具有广阔的应用前景。
3.3 国内外研究现状与竞争优势通过了解国内外研究现状，可以为我们提供更多的启发和借鉴，提高我们的研究水平和竞争力。
个人观点和总结通过对猪附红细胞体PCR检测方法的建立和初步应用的深入探讨，我认为这一技术具有巨大的潜力和应用前景。
在未来，随着技术的不断改进和完善，相信它将在农业生产和疾病防控领域发挥更大的作用。
在撰写本文的过程中，我深刻理解了猪附红细胞体PCR检测方法的重要性和价值所在。
猪病诊断和防治中PCR技术的应用研究
猪病诊断和防治中PCR技术的应用研究猪是我国畜牧业中重要的经济动物之一，猪病种类繁多，给生产带来了很大的压力。
传统的猪病诊断和防治方法往往需要耗费大量时间和人力物力，而且准确率也有一定的局限性。
因此，为了提高诊断的准确率和效率，现代分子生物学技术应用于猪病诊断和防治中已成为时代的发展趋势之一。
其中，聚合酶链反应（PCR）技术因其高灵敏度、高特异性和高效性，已成为一种广泛应用于猪病诊断和防治的技术手段。
猪病中常见的病原体包括病毒、细菌、真菌和寄生虫。
其中，病毒感染是影响猪的健康和生产的主要因素。
而PCR技术的应用在病毒和细菌的检测中具有很高的优势。
在猪病诊断中，PCR技术具有以下优势：1.高灵敏度：PCR技术的灵敏度比传统的检测方法高出10倍以上，可以检测到病原体中极少量的核酸。
采用PCR技术可以在疾病的早期快速检测到病因，提高了诊断的准确性和正确性。
2.高特异性：PCR技术可以特异性地检测出目标病原体的DNA或RNA，同时对其他的无关物质不产生干扰，从而消除了假阳性的可能性。
3.高效性：PCR技术可以同时检测多种病原体，有效地提高了检测的效率和准确性，缩短了检测时间。
在猪病防治中，PCR技术的应用主要体现在以下两个方面：1.基因工程疫苗的研发：PCR技术可以快速地克隆、分离与定量病原体的基因，便于对病原体进行进一步的研究和分析，为基因工程疫苗的研发提供了基础。
2.免疫学研究：PCR技术可以准确、快速地检测病原体的存在和数量，为免疫学研究提供了有效的手段和参考基础。
近年来，随着PCR技术的不断发展和完善，荧光定量PCR（qPCR）技术已成为PCR技术的一个重要分支。
相比传统PCR技术，qPCR技术更加准确、可靠和高效。
其操作简便，只需少量病原体DNA或RNA即可检测，能够准确地测定样品中病原体的数量，并且不受污染的干扰。
因此，荧光定量PCR技术在猪病诊断和防治中应用将会更加广泛。
总之，PCR技术已经成为现代分子生物学技术中一种重要的检测手段，在猪病诊断和防治中具有重要的应用前景。
实验四PCR扩增基因特异片段（合集五篇）
实验四PCR扩增基因特异片段（合集五篇）第一篇：实验四 PCR扩增基因特异片段实验四PCR扩增基因特异片段一、实验目的1、学会PCR仪的使用方法。
2、掌握PCR反应的实验技术。
二、实验原理聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）简称PCR。
聚合酶链式反应（PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。
它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病的诊断或任何有DNA,RNA的地方．聚合酶链式反应又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。
GLBI蛋白是玉米胚中含量最丰富的蛋白质之一，其编码基因glb1位于第一染色体长臂，基因表达仅限于种子组织。
该蛋白对于幼苗生长与存活并非必需。
本实验扩增glb1基因部分序列，全长1200bp左右。
真核生物基因组中编码核糖体的基因包括28S rDNA、5S rDNA、18S rDNA和5.8S rDNA 4 种,它们在染色体上头尾相连、串联排列,相互之间由间隔区分隔。
其中18S、5.8S和28S rDNA基因组成一个转录单元，三者高度保守,适合于较高等级水平的生物群体间的系统分析, 其间的间隔区为内转录间隔区(Internal Transcribed Spacer, ITS)，本实验扩增榨菜黑斑病ITS序列，序列全长500kb左右。
三、实验仪器及药品耗材1、主要仪器：移液器、振荡器、PCR仪、电子天平、量筒、微波炉、电泳仪、水平电泳槽和凝胶成像系统等。
2、主要药品及耗材：一次性手套、PCR板、移液器吸头、无菌水、2×PCR 混合酶（T aq DNA Polymerase、PCR Buffer、Mg2+、dNTPs及PCR稳定剂和增强剂组成的混合液）、液体石蜡、琼脂糖、0.5×TBE缓冲液、Goldview染料、DNA Marker 2000和溴酚蓝等。
猪食道口线虫核糖体18S部分序列的PCR扩增及分析
ｄ ｅ ｎｔ ａ ｔ ｕｍ ） 和 四 棘 食 道 口 线 虫 （Ｏ ｅ ｓ ｏ Ｐ ｈ ａ ｇ Ｏ Ｓ ｔ Ｏ ｍｕ ｍ ２ ． １ １ ８ Ｓ ｒ Ｄ ＮＡ片 段 的 Ｐ Ｃ Ｒ扩 增 ｑ ｕ ａ ｄ ｒ ｉ ｓ ｐ ｉ ｎ ｕ ｌ ａ ｔ ｕ ｍ）是感染猪的两个常见种 ，因常寄生于猪的肠壁 特异Ｐ Ｃ Ｒ 分子鉴定表明湖南怀化样品０ ｓ ｐ Ｈ Ｎ １ 、Ｏ ｓ ｐ Ｈ Ｎ ２ 和广东阳 形 成 结 节 状 的 病 变 ，故 有 “ 结 节虫 ”之 称…。利 用 现 代 分 子生 物 江Ｏ ｓ ｐ Ｙ Ｊ １ 为有齿食道 口线虫，湖南怀化样品Ｏ ｓ ｐ Ｈ Ｎ ３ 、重庆渝北样
录间 隔 区Ｄ Ｎ Ａ、外 转 录间 隔 区Ｄ Ｎ Ａ 、１ ８ Ｓ ｒ Ｒ Ｎ Ａ 基 因 、两 侧 具有 内 转 录 间 隔区 （ Ｉ Ｔ Ｓ ）Ｄ Ｎ Ａ的５ ． ８ Ｓ ｒ Ｄ Ｎ Ａ 基 因和２ ８ Ｓ ｒ Ｒ Ｎ Ａ 基 因的 重复 基 因单 位 ｌ 。核 糖 体 各 部 分序 列 均 有 应 用 于寄 生 虫 的 分 子分 类 学 和
分子遗传学研究 中，但 目前猪食道 口线虫 １ ８ Ｓ 序列的分析未见报 道 。有 鉴于 此 ，本 研 究 以我 国 不 同地 区猪 的食 道 口线 虫 作 为研 究 对象 ，Ｐ Ｃ Ｒ 扩增其１ ８ Ｓ ｒ Ｄ Ｎ Ａ 基 因部分序列 ，并进行序列测定和分 析 ，为 食道 口线虫 的分 子 生物学 的进一 步研 究奠 定 了基 础 。
《利用荧光定量PCR检测PCV2的方法建立及应用》
《利用荧光定量PCR检测PCV2的方法建立及应用》一、引言猪圆环病毒2型（PCV2）是一种常见的猪病病原体，能够引起猪只发生一系列的疾病症状，给养殖业带来严重的经济损失。
为了更准确地检测PCV2，本研究利用荧光定量PCR技术建立了一种新的检测方法，并通过实验验证了其可靠性和实用性。
二、材料与方法1. 材料实验所用样本为疑似感染PCV2的猪只血清样本。
荧光定量PCR试剂盒、引物和探针等均为市售产品。
2. 方法（1）DNA提取：将血清样本中的DNA提取出来，作为PCR反应的模板。
（2）引物和探针设计：根据PCV2基因序列设计特异性引物和荧光探针。
（3）荧光定量PCR反应：将提取的DNA与引物、探针等反应体系混合，进行PCR扩增反应，并实时监测荧光信号。
（4）结果分析：根据荧光信号的强度和变化情况，判断样本中PCV2的含量。
三、实验结果1. 特异性检测利用建立的荧光定量PCR方法对PCV2和其他常见病毒进行特异性检测，结果显示该方法对PCV2具有较高的特异性，对其他病毒的交叉反应较低。
2. 灵敏度检测通过逐步稀释PCV2阳性样本，检测荧光定量PCR方法的灵敏度。
结果显示，该方法能够检测到较低浓度的PCV2，具有较高的灵敏度。
3. 实际应用将建立的荧光定量PCR方法应用于实际检测中，对疑似感染PCV2的猪只血清样本进行检测。
结果显示，该方法能够快速、准确地检测出PCV2，为猪病诊断提供了可靠的依据。
四、讨论本研究利用荧光定量PCR技术建立了检测PCV2的方法，具有较高的特异性和灵敏度。
与传统的PCR方法相比，荧光定量PCR能够实时监测反应过程，提高检测的准确性和可靠性。
此外，该方法还能够快速、简便地检测出PCV2，为猪病诊断提供了新的手段。
在实际应用中，该方法有望为猪病防控和疫情监测提供有力的支持。
五、结论本研究建立了利用荧光定量PCR检测PCV2的方法，并经过实验验证了其可靠性和实用性。
该方法具有较高的特异性和灵敏度，能够快速、准确地检测出PCV2，为猪病诊断提供了新的手段。
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中国动物检疫2008年第25卷第8期PCR方法扩增种属特异性片段检测猪源成分毕道荣1,高宏伟2,孙敏2,梁君妮2（1.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛266032;2.山东出入境检验检疫局，山东青岛266001）摘要：针对猪线粒体基因的保守序列，设计特异性引物，优化反应条件和反应参数，建立了食品和饲料中猪源性成分的PCR检测方法。
该方法灵敏、特异，检测低限达0.01%。
其推广使用，对于加强食品、饲料的质量控制和监督监管，具有参考价值。
关键词：PCR；猪；检测中图分类号：S851.347.1，TS251.5+1文献标识码：A文章编号：1005－944X（2008）08－0034－03我国每年需从国外进口大量肉骨粉类饲料，为了防范疯牛病、痒病发生风险，我国相关部门先后颁布了《关于严防牛海绵状脑病传入中国的通知》、《关于禁止用反刍动物源性饲料饲喂反刍动物的通知》、《关于加强肉骨粉等动物性饲料产品管理的通知》和《动物源性饲料产品安全卫生管理办法》。
上述文件明确提出，禁止在反刍动物饲料中使用、添加以哺乳类动物为原料的动物性饲料产品，各出入境检验检疫部门要依法严格对允许进口的动物饲料产品实施检验检疫。
为有效防止动物疫病通过进入食物链发生传播，同时减少因食用含有猪成分的食品而引发的宗教、食物过敏等问题，建立食品和饲料中猪源性成分的快速检测方法很有必要。
笔者参考文献，建立了猪源性成分的PCR检测方法，并对方法的灵敏性和特异性进行了分析，探讨了其用于食品和饲料中猪成分检测的可行性。
1材料与方法1.1样品用于做引物特异性实验和PCR 灵敏度实验的样品及其来源见表1。
其中各种动物血液用于猪引物特异性实验，猪肉和鸡肉用于猪成分PCR鉴定的灵敏性实验，与肉骨粉、血粉和羽毛粉的混合样品用于验证在实际饲料中的灵敏性和特异性。
1.2仪器台式离心机（Eppendorf5810R,Germany），基因扩增仪（EppendorfMastercycler gradient，Germany），电泳仪（EPS301，Amersham PhamaciaBiotech），核酸蛋白分析仪（BeckmanDU640，Germany），恒温干燥箱（SANYO mov-212F，Japan）。
1.3模板DNA提取按Tartaglia等人的方法分别抽提阳性和阴性对照DNA[1]。
对于动物血液样品，直接取300μL全血提取DNA。
用于灵敏性实验的的猪肉和鸡肉，133℃烘烤30min后，加液氮研磨成粉状，称取100mg用于DNA提取。
将猪肉粉和鸡肉粉的DNA抽提缓冲液进行混合以得到系列百分比（100%，10%，1%，0.5%，0.1%，0.05%，0.01%，0.005%，0%）的猪肉DNA。
饲料混和样品的制备分别以不含猪成分的肉骨粉、血粉、羽毛粉为基质，按表2分别制备样品的不同质量百分比梯度的混样。
1.4引物参考文献[2]，确定猪的种属特异性引物，委托上海生工生物有限公司合成。
引物序列为：por F5'-GCC TAA ATCTCC CCT CAA TGC TA-3'por R5'-ATG AAA GAGGCA AAT AGA TTT TCG-3'该引物针对的是猪线粒体基因的保守区序列，产物长度为212bp。
1.5PCR反应采用25μl反应体系，反应液包括：水（PCR级）15.2μl、10×buffer(Promega,Wisconsin USA)2.5μl、MgCl2（25mM）2μl、dNTP(2.5mM each)2μl、Taq DNA聚合酶(5U/μl，Promega,Wisconsin USA)0.3μl、引物por F和por R(10μM)各1μl、DNA模板1μl。
PCR反应条件随不同仪器略有改变，一般反应程序为：94℃预变性3min。
94℃变性45s，59℃退火45s，72℃延伸45s，35个循环。
72℃延伸5min。
4℃保存。
1.6电泳检测取PCR产物8μl，使用2%的琼脂糖凝胶在0.5×TBE（0.045M Tris-硼酸、0.001M EDTA）电泳缓冲液中80V恒压电泳10-20min。
根据DNAMarker(DL2000,TaKaRa)、阴性对照、阳性对照判定结果。
使用凝胶成像系统拍照记录。
1.7限制性酶切反应体系使用限制性内切酶MnlⅠ酶对扩增产物进行酶切鉴定。
采用50μl反应体系：MnlⅠ酶1μl（10u/μl），10×buffer5μl，DNA扩增产物20μl，H2O24μl。
1.8PCR产物序列测定PCR扩增产物经柱纯化（根据博大生物技术有限公司DNA纯化试剂盒说明书）后，委托上海生工生物工程有限公司进行双向测序。
2结果2.1PCR反应的特异性用1.4，1.5，1.6的引物和实验方法，对猪、牛、羊、鸡、鱼、驴、鹿、兔、马、狗的血液DNA样本进行PCR扩增，结果表明：使用猪种属特异性引物，猪血样本和驴血样本可产生清晰的扩增条带，其他动物种属无扩增。
猪血样本的扩增条带在212bp处，与预期相符。
驴血样本的扩增条带大于250bp，为非特异条带（见图1）。
2.2PCR反应的灵敏性本栏目主持人：庞素芬sufen40@防检技术－34－中国动物检疫2008年第25卷第8期按1.3中的方法混合样品，制备不同猪肉含量的DNA溶液，进行PCR检测，确定方法灵敏度。
结果显示：猪DNA含量为100%，10%，1%，0.5%，0.1%，0.05%，0.01%的DNA样本都可以扩出212bp的目的条带，表明该方法检测限可达0.01%（见图2、图3）。
2.3限制性酶切使用限制性内切酶MnlⅠ对扩增片段进行酶切。
酶切片段大小为196bp和16bp。
实验结果与文献报道相符，证明PCR扩增的特异性和准确性(见图4)。
2.4扩增产物测序对阳性猪成分的PCR扩增产物进行直接测序，验证PCR扩增的特异性和准确性。
测序结果与文献报道吻合，序列如下。
测序图谱（见图5）。
3讨论PCR扩增产物是由特异引物决定的，因此，引物的设计对PCR的成功起着决定性的作用。
根据文献报道，本研究共筛选了3对引物（171F防检技术－35－中国动物检疫2008年第25卷第8期5'GGA TCC GGC ATT GCC GTT AG3'，171R5'GTC TTT TTT TGC CAT TTC TTG G3'[3]；pig F5'AAC CCT ATG TAC GTC GTG CAT3'，pig R5'ACC ATT GAC TGA ATA GCA CCT3'[4]；por F5'-GCC TAA ATC TCC CCT CAA TGC TA-3', por R5'-ATG AAA GAG GCA AAT AGA TTT TCG-3'[2]，特异性地检测样品中的猪源性成分。
实验结果表明，por F和por R这一对引物的种属特异性最好，检测低限可达0.01%。
其扩增产物为212bp，片断相对较小，可以满足诸如食品和饲料等加工产品中猪源性成分的检测要求。
本研究建立了食品和饲料中猪源性成分的分子生物学检测方法。
该方法简单、快速、灵敏、特异，其推广使用，对于加强食品、饲料的质量控制和监督监管，具有参考价值。
参考文献[1]Tartaglia M,Saulle E,Pestalozza S,et al.Detection of bovine mitochondrialDNA in ruminant feeds:a molecular ap-proach to test for the presence ofbovine-derived materials[J].J.FoodProt,1998,61(5):513-518.[2]Lahiff S,Glennon M,O'Brien L,etal.Species-specific PCR for the identi-fication of ovine,porcine and chickenspecies in meat and bone meal(MBM)[J].Mol Cell Probes,2001,15:27-35.[3]Calvo J H,Zaragoza P,Osta R.Technical note:A quick and moremethod to identify pork in processedand unprocessed food by amplificationof a new specific DNA fragment[J].JAnim.Sci,2001,79:2108-2112.[4]J.F.Montiel-Sosa,E.Ruiz-Pesini,J.Montoya,et al.Direct and HighlySpecies-Specific Detectionof Pork Meatand Fat in Meat Products by PCR Am-plification of Mitochondrial DNA[J].JAgric Food Chem,2000,48:2829-2832.肝片吸虫是一种世界性的寄生虫病，尤其是牛、羊等反刍动物。
肝片吸虫的童虫在肝实质移行，诱发坏死性肝炎和绵羊黑疫[1-2]；成虫则寄生在肝胆管，引起急性和慢性肝炎或胆管炎，并伴发全身中毒和营养障碍[3-4]。
近几年，由于气候变暖和降雨量增多，青海湖周边地区藏羊的肝片吸虫病的流行呈上升趋势，2005年秋冬季的爆发引起大批藏羊死亡，给牧民群众带来了巨大的经济损失。
为此，有些牧民一年多次用各种药物进行驱虫，造成了浪费和环境、肉质的污染。
为了给防治工作提供依据，有必要对该病进行早期血清学诊断。
间接血凝试验（IHA）是一种操作简单，敏感性高，特异性强的流行病学和辅助诊断的常用方法[5]。
本试验用肝片吸虫成虫虫体进行抗原纯化，建立藏羊肝片吸虫间接血凝（IHA）诊断方法，用此方法检测了青海湖地区50只藏羊的血清，并与粪便检查法作平行试验。
1材料与方法1.1试验材料1.1.1高速离心机SIGMA3-18K德国Sartorius公司1.1.2蠕动泵RB-50北京宾达英创科技有限公司1.1.3紫外检测仪8823B北京宾达英创科技有限公司1.1.4自动馏分收集器FC-95北京宾达英创科技有限公司1.1.5紫外可见分光光度计UV-9200北京瑞利分析仪器公司1.1.6试验动物青海湖地区刚察县伊克乌兰乡海滩放牧的藏羊50只，每只羊采集粪便和血清。