重组头孢菌素C酰化酶的固定化研究
酶的固定化
3.扩散限制效应
酶固定化使生物催化反应从均相转化为多相，于是产 生了扩散阻力：
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外扩散阻力是底物从宏观环境向酶颗粒表面传递过
程中的一种扩散限制效应，发生在固定化颗粒周围的液膜
层。它会使底物在固相酶周围形成浓度梯度，通过增加搅 拌速度和底物流速的方法可以减少外扩散效应。
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内扩散阻力是指底物分子达到固相酶表面后传递到
缺点：
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固定化时，酶活力有损失； 增加了生产的成本，工厂初始投资大； 只能用于可溶性底物，而且较适用于小分子底物， 与完整的菌体相比不适于多酶反应，特别是需要辅 胞内酶必须经过酶的分离手续。
对大分子底物不适宜；
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助因子的反应；
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三、影响固定化酶性质的因素
分配效应 空间障碍效应 扩散抑制效应
在具体选择时，一般应遵循以下几个原则：
（1）必须注意维持酶的构象, 特别是活性中心的构象。
（2）酶与载体必须有一定的结合程度。
（3）固定化应有利于自动化、机械化操作。 （4）固定化酶应有最小的空间位阻。 （5）固定化酶应有最大的稳定性。 （6）固定化酶的成本适中。
1.吸附法
吸附法（Adsorption） 是通过载体表面和酶分子 表面间的次级键相互作用 而达到固定目的，是固定 化中最简单的方法。只需 将酶液与具有活泼表面的 吸附剂接触，再经洗涤除 去未吸附的酶便能制得固 定化酶。
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1.分配效应
由于载体和底物的性质 差异引起了微环境和宏观 环境之间的性质不同。微 环境是在固定化酶附近的 局部环境，而将主体溶液 称为宏观环境。由这种不 同造成的底物、产物和各 种效应物在两个环境之间 的不同分配，被称为分配 效应。
2.空间障碍效应
酶固定化技术用载体材料的研究进展
酶固定化技术用载体材料的研究进展杨勇 李彦锋3 拜永孝 易柳香 夏春谷#(兰州大学化学化工学院功能有机分子化学国家重点实验室生物化工及环境技术研究所 兰州 730000;#中国科学院兰州化学物理研究所羰基合成与选择氧化国家重点实验室 兰州 730000)摘 要 酶的固定化是生物技术中最为活跃的研究领域之一。
作为固定化酶技术的重要组成部分,载体的结构及性能在很大程度上直接影响着所得固定化酶的催化活性及操作稳定性。
综合性能优良的载体材料的设计与制备是固定化酶技术领域的一个非常重要的研究内容。
通过对传统材料的改性和新型载体材料的研究开发,必将促进固定化酶在各个领域的广泛应用。
本文综述了近年来国内外有关固定化酶载体材料的研究现状和发展趋势。
关键词 固定化酶 载体材料Progress in C arrier Materials Employed in Immobilization of E nzymesY ang Y ong,Li Y an feng3,Bai Y ongxiao,Y i Liuxiang,X ia Chungu#(C ollege of Chemistry and Chemical Engineering,S tate K ey Laboratory of Applied Organic Chemistry,Institute of BiochemicalEngineering&Environmental T echnology,Lanzhou University,Lanzhou730000;#S tate K ey Laboratory for Ox o Synthesis and Selective Oxidation,Lanzhou Institute of Chemical Physics,Chinese Academy of Sciences,Lanzhou730000)Abstract Enzymes imm obilization is one of the m ost active research fields in biotechnology.As an im portant part of imm obilized enzymes,carrier materials affect the activity of catalysis and operation stability greatly.The design and preparation of carrier materials with excellent integration per formances will be one of the m ost significant researches for the development of imm obilized enzymes in the future.Im provement of traditional materials,designing and exploiting new carrier materials will prom ote the application of imm obilized enzymes in various fields.The recent research progress in carrier materials for imm obilized enzymes are reviewed in this paper.K ey w ords Imm obilized enzyme,Carrier materials酶作为一种特殊的生物催化剂,具有较高的选择性和催化效率、反应条件温和、催化活性可以调节控制等优点。
固定化酶法生产β-内酰胺类抗生素 ppt课件
微生物获取
细胞破碎
粗酶液制备
酶的分离纯 化
酶的固定化
酶存储
酶浓缩结晶
原料预处理
酶反应器
粗产品分离 提纯
产品
空气除菌
制备工艺
临床应用
好，同学们，下课了
酶的来源
青霉素酰化酶的产生微生物主要分为革兰氏阳性菌(G+)巨大芽孢杆菌、粘结杆 菌、醋酸杆菌等,及革兰氏阴性菌(G-):大肠杆菌、雷氏普罗威登斯菌、嗜柠檬 酸克鲁沃尔氏菌等,通常革兰氏阳性菌产生的青霉素酰化酶定位于胞外,而革兰 氏阴性菌产生的青霉素酰化酶则分泌于胞内。
选择重组表达系统
日前国内外研究中应用最多的青霉素酰化酶产生菌是大肠杆 菌和巨大芽孢杆菌。 伴随着科技的发展,分子生物学研究的不断创新,涌现出越来 越多的基因表达新技术,重组大肠杆菌的表达系统作为一种 表达外源基因的表达系统正日渐被人们熟知并广泛地利用。 结合代谢工程、融合表达及基因调控等手段,定向地对重组 大肠杆菌系统的宿主和载体进行合理改进,使目的基因在大 肠杆菌表达系统上的表达水平及产物蛋白的活性显著提高。 因而,重组大肠杆菌表达系统具有投入成本低,表达产物周期 短,培养方法简单,遗传背景明确等其他菌种表达系统所无法 比拟的优点。
头霉素类、硫霉素类、单环β -内酰胺类等其他非典型β -内酰胺类抗生素。此
类抗生素具有杀菌活性强、毒性低、适应症广及临床疗效好的优点。
作用机制
各种β -内酰胺类抗生素的作用机制均相似，都能抑制胞壁粘肽合成酶，即青霉素结 合蛋白，从而阻碍细胞壁粘肽合成，使细菌细胞壁缺损，菌体膨胀裂解。除此之外， 对细菌的致死效应还应包括触发细菌的自溶酶活性，缺乏自溶酶的突变株则表现出耐 药性。动物无细胞壁，不受β -内酰胺类药物的影响，因而本类药具有对细菌的选择 性杀菌作用，对宿主毒性小。近十多年来已证实细菌胞浆膜上特殊蛋白PBPs是β -内 酰胺类药的作用靶位。各种细菌细胞膜上的PBPs数目、分子量、对β -内酰胺类抗生 素的敏感性不同，但分类学上相近的细菌，其PBPs类型及生理功能则相似。例如大肠 杆菌有7种PBPs，PBP1A，PBP1B与细菌延长有关，青霉素、氨苄西林、头孢噻吩等与 PBP1A、PBP1B有高度亲和力，可使细菌生长繁殖和延伸受抑制，并溶解死亡，PBP2与 细管形状有关，美西林、棒酸与硫霉素能选择性地与其结合，使细菌形成大圆形细胞， 对渗透压稳定，可继续生几代后才溶解死亡。PBP3功能与PBP1A相同，但量少，与中 隔形成，细菌分裂有关，多数青霉素类或头孢菌素类抗生素主要与PBP1和（或）PBP3 结合，形成丝状体和球形体，使细菌发生变形萎缩，逐渐溶解死亡。PBP1，2，3是细 菌存活、生长繁殖所必需，PBP4，5，6与羧肽酶活性有关，对细菌生存繁殖无重要性， 抗生素与之结合后，对细菌无影响。
固定化酶及其应用研究进展
固定化酶及其应用研究进展摘要：随着社会的发展，越来越多酶被人们广泛的应用在工业生产、生物传感器和环境保护等领域。
作为一种良好的生物催化剂，酶可以在常温、常压等温和的反应条件下高效地催化反应,一些难以进行的化学反应在酶的催化下能顺利地完成。
关键词：酶固定化酶应用进展酶是由生物体内自身合成的生物催化剂。
多数酶的化学组成为蛋白质。
现已鉴定出3000种以上的酶，其中数百种已得到结晶。
酶具有催化效率高和高度专一性的特点，但易受强酸、强碱、高温等条件影响，使蛋白质变性而失去催化活性。
某些酶仅决定于它的蛋白质结构，如脲酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等。
另一些酶为酶蛋白与辅助因子结合形成的复合酶，称为全酶，在催化反应中，酶蛋白决定酶反应的专一性，而辅助因子则直接对电子、质子或某些基团起传递作用。
固定化酶是把酶人工偶联到不溶于水的载体上，并长时间保持催化活性，使过程连续化、简单化。
酶的固定化就是通过化学或物理的处理方法,使原来水溶性的酶与固态的水不溶性支持物相结合或被载体包埋。
固定化方法有物理吸附法、交联、共价结合及包埋等方法。
目前较先进的方法是将酶固定在生物膜或超滤膜上,制造出来的生物膜反应器的生产能力有明显提高。
经过固定化,酶具有了比原来水溶性酶更多的优点:1)酶经过固定化处理一般稳定性有较大提高,对热、pH等的稳定性提高,对抑制剂的敏感性降低,有的酶具有了抗蛋白酶分解的特性;2)反应完成后经过简单的过滤或离心,酶就可以回收,而且酶活力降低较少,这样就降低了生产成本;3)固定化体系适合于连续化、自动化生产,催化过程容易控制,且产品中不会带进酶蛋白或细胞,改善了后处理过程,提高了酶的利用效率,降低了生产成本。
酶在生理学、生物化学、医学、农业、工业等方面具有重大意义。
酶作为生物催化剂,尤其是固定化酶作为多相生物催化剂,能够在非常温和的条件下实现合成、降解及转换化学物质的特异性反应,效率高,能源消耗少.这无疑向我们展示出一幅广阔的应用前景. 现代意义下的酶,已不单单是一些微生物的重要产物,它已成为现代生物产业中一个不可缺少的组成部分。
产γ-内酰胺水解酶菌株的固定化及在手性药物合成中的应用的开题报告
产γ-内酰胺水解酶菌株的固定化及在手性药物合成中的应用的开题报告一、研究背景及意义：γ-内酰胺类抗生素是一类广泛应用于临床的抗生素，包括青霉素、头孢菌素等，其具有很强的抗菌活性。
γ-内酰胺类抗生素的合成主要使用β-内酰胺酶来降解，在这个过程中，β-内酰胺酶要求底物具有严格的立体构型。
但在实际的生产过程中，合成的β-内酰胺酶因其对温度、pH等条件的敏感性而难以稳定，这对γ-内酰胺类抗生素的生产造成了一定的影响。
因此，本研究旨在固定化产γ-内酰胺水解酶菌株，以提高其稳定性和催化效率，并探究其在手性药物合成中的应用，为γ-内酰胺类抗生素的生产提供一定的技术支持。
二、研究内容：1. 产γ-内酰胺水解酶菌株的筛选与鉴定：筛选出适合固定化的产γ-内酰胺水解酶菌株，并进行鉴定。
2. 固定化产γ-内酰胺水解酶菌株的制备和优化：采用不同的固定化方法制备固定化菌株，研究不同的固定化条件对催化效率的影响。
3. 固定化产γ-内酰胺水解酶菌株在手性药物合成中的应用：以手性药物合成为模型，探究固定化产γ-内酰胺水解酶菌株在手性选择性合成过程中的应用。
三、研究方法：1. 筛选出适合固定化的产γ-内酰胺水解酶菌株：采用从土壤、植物体内等来源的微生物菌株进行筛选，并进行鉴定。
2. 固定化产γ-内酰胺水解酶菌株制备和优化：采用层析、吸附等固定化方法制备固定化菌株，同时考虑温度、pH等因素对催化效率的影响。
3. 固定化产γ-内酰胺水解酶菌株在手性药物合成中的应用：采用手性催化合成反应，探究固定化产γ-内酰胺水解酶菌株对手性选择性合成过程的影响。
四、研究意义：1、固定化产γ-内酰胺水解酶菌株的制备可提高其稳定性和催化效率，为γ-内酰胺类抗生素的生产提供技术支持。
2、探究固定化产γ-内酰胺水解酶菌株在手性药物合成中的应用，为手性药物的合成提供新的手段和思路。
3、本研究的结果有望为相关领域的研究提供指导性和参考性意义，具有一定的科学研究价值。
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重组头孢菌素C酰化酶的固定化研究 朱琳琳;常雁红;姚舜;罗晖;于慧敏;沈忠耀 【摘 要】将含头孢菌素C(CPC)酰化酶的重组大肠杆菌E.coli BL21 (DE3)/pET28-CPCAcy在50 L发酵罐中发酵,发酵液OD600可达19.5,酶活达到11 542 U·L-1;CPC酰化酶粗酶液经1％活性炭纯化后,比酶活由6.56 U· mg-1提高到10.77 U· mg-1;然后将纯化的CPC酰化酶共价结合固定在氨基载体LX-1000HA和环氧基载体LX-1000EPC上,并对固定化酶的热稳定性及pH值稳定性进行考察.结果表明,LX-1000HA固定化酶的初始酶活较LX-1000EPC固定化酶低,但其热稳定性、pH值稳定性以及酶与载体的结合强度均高于LX-1000EPC固定化酶;并且在固定化酶投加量相同时,LX-1000HA固定化酶的催化性能优于LX-1000EPC固定化酶.对LX-1000HA固定化酶进行催化批次实验,在催化39批次时达到半衰期.%In this paper,the recombinant E.coli BL21 (DE3)/pET28-CPCAcy which contains cephalosporin C(CPC) acylase was fermented in a 50 L fermentor.When the OD600 value of the broth and the enzyme activity reached 19.5 and 11 542 U · L-1,respectively.Crude enzyme solution was purified by 1％ activated carbons,and the specific enzyme activity increased from 6.56 U · mg-1 to 10.77 U · mg-1.Then the purified CPC acylase was immobilized on LX-1000HA(amino carrier) and LX-1000EPC(epoxy carrier) by covalent binding,and the thermal stability and pH value stability of the immobilized enzyme were investigated.The results showed that the initial enzyme activity of LX-1000HA immobilized enzyme was lower than that of LX-1000EPC immobilized enzyme,while its thermal stability,pH value stability,and binding strength of LX-1000HA immobilized enzyme and carrier were better than those of LX-1000EPC immobilized enzyme.Catalytic performance of LX-1000HA immobilized enzyme was better than that of LX-1000EPC immobilized enzyme for the same enzyme dosage.The half-life of LX-1000HA immobilized enzyme was about 39 cycles under such catalytic reaction conditions.
【期刊名称】《化学与生物工程》 【年(卷),期】2017(034)002 【总页数】6页(P19-24) 【关键词】重组;头孢菌素C酰化酶;固定化酶;稳定性;生物催化 【作 者】朱琳琳;常雁红;姚舜;罗晖;于慧敏;沈忠耀 【作者单位】北京科技大学环境工程系,北京100083;北京科技大学环境工程系,北京100083;北京科技大学环境工程系,北京100083;北京科技大学生物科学与工程系,北京100083;清华大学化学工程系,北京100084;清华大学化学工程系,北京100084
【正文语种】中 文 【中图分类】TQ465.1;Q556 头孢菌素类抗生素是一类高效、低毒、临床应用广泛的重要抗生素，是世界上最畅销的抗感染药物之一[1]。7-氨基头孢烷酸(7-ACA)是合成头孢菌素的重要中间体，一般由头孢菌素C(CPC)通过化学法或酶法催化制得。CPC酰化酶是一种能直接水解CPC的侧链一步生成7-ACA的生物酶[2]，在7-ACA工业生产中具有非常重要的应用，近年来得到了快速发展[3-5]。由于游离酶存在反应条件苛刻、稳定性差、易失活、不能重复使用等缺点，限制了其在实际工程中的应用，而固定化酶因稳定性好、易分离、可重复利用等优点备受人们青睐[6-7]。 因此，作者将含CPC酰化酶的重组大肠杆菌E．coli BL21(DE3)/pET28-CPCAcy在50 L发酵罐中发酵，经纯化后获得活性较高的CPC酰化酶，进而将其固定在不同载体上得到固定化CPC酰化酶，并对其性能进行考察，以期得到性能优良的固定化CPC酰化酶，为7-ACA工业生产提供参考。 1.1 菌种与试剂 CPC酰化酶重组菌种E．coli BL21(DE3)/pET28-CPCAcy，参照文献[8]构建，自行保存。 CPC钠盐、7-ACA，河北石家庄九派集团；环氧基载体LX-1000EPC、氨基载体LX-1000HA，西安蓝晓科技有限公司；高效液相色谱用流动相试剂为色谱纯；活性炭(颗粒)及其它试剂为分析纯；BCA法测蛋白试剂盒、蛋白质marker，上海生工生物工程技术服务有限公司。 1.2 CPC酰化酶的分离纯化 1.2.1 菌种发酵 将保存的菌种E.coli BL21(DE3)/pET28-CPCAcy接种到含有50 mg·L-1卡那霉素的LB培养基中活化。接种量为1%，37 ℃、160 r·min-1摇床培养12 h。 将上述菌种培养液以2.5%的接种量接种至50 L发酵罐中进行培养。发酵培养基(g·L-1)：玉米浆50，酵母粉10，甘油5，NH4Cl 2.5，KH2PO4 2.3，K2HPO4·2H2O 21.5，乳糖3，用1 mol·L-1的NaOH溶液调pH值至7.5。发酵条件：28 ℃，搅拌速度300 r·min-1，通气量2 m3·h-1，料液体积30 L，发酵时间24 h。发酵期间定时取样，测定生物量(OD600)和酶活。 1.2.2 酶的分离纯化 活性炭具有高度发达的孔隙结构和很大的比表面积，化学稳定性好，耐酸碱，不溶于水和有机溶剂，能经受水浸及高温高压的作用，失效后可以再生，所以常作为吸附剂被广泛应用。除了作为常规的吸附剂吸附有色物质外，活性炭还可吸附小分子蛋白[9]。因此，本实验采用活性炭对CPC酰化酶粗酶液进行纯化。由于活性炭可能对分子量为86 kDa的CPC酰化酶有非特异性吸附，因此应选择合适的活性炭添加量。本实验选择活性炭添加量分别为粗酶液的0.5%、1%和3%。 将收集的菌体用pH值8.5的0.1 mol·L-1磷酸缓冲液(PB)洗涤2次，再用该缓冲液重悬。用高压匀浆机(BIOTECH-50BSG型)在800 bar压强下匀浆3次得到破碎菌液，离心，取上清(即粗酶液)，分别加入0.5%、1%和3%的经水洗的活性炭，在摇床中于25 ℃、160 r·min-1振荡1 h，离心，取上清，即得CPC酰化酶纯化酶液，测定其酶活和蛋白浓度。 1.3 CPC酰化酶的固定化 1.3.1 氨基载体LX-1000HA的活化 将10 g LX-1000HA载体加到40 mL 0.1 mol·L-1 pH值8.0的PB溶液中，用1 mol·L-1 NaOH溶液调pH值至7.8～8.2，于25 ℃摇床振荡15 min后测pH值，再调pH值为7.8～8.2，重复上述步骤，直至振荡后溶液pH值稳定在7.8～8.2。然后加入40 mL 2%(体积分数)的戊二醛(用0.1 mol·L-1 pH值8.0的PB溶液配制)，25 ℃搅拌1 h，过滤，再用去离子水洗涤3次。由于醛基稳定性较差，载体活化后需立即使用。 1.3.2 固定化酶的制备 LX-1000EPC固定化酶的制备：称取一定量用0.1 mol·L-1 pH值8.0的PB溶液洗涤过的LX-1000EPC载体置于锥形瓶中，按300 U·g-1的投加量加入CPC酰化酶纯化酶液；根据所加入的酶液的体积，加入2倍酶液体积的1.25 mol·L-1 pH值8.0的PB溶液，用1 mol·L-1 NaOH溶液调体系pH值至8.0；在25 ℃、160 r·min-1摇床固定化24 h；抽滤，用大量去离子水、0.1 mol·L-1pH值8.5的PB溶液依次洗涤；抽滤，即得LX-1000EPC固定化酶，4 ℃保存。 LX-1000HA固定化酶的制备：取活化的LX-1000HA载体按上述方法固定化20 h，即得。 1.4 CPC酰化酶酶活测定 采用比色法测定游离CPC酰化酶酶活[10-11]：用0.1 mol·L-1 pH值8.5的PB溶液配制20 mg·mL-1的CPC溶液，并用1 mol·L-1 NaOH溶液调节pH值至8.5。取20 μL CPC酰化酶纯化酶液加到20 μL经37 ℃预热的20 mg·mL-1CPC溶液中，吹打均匀，于37 ℃水浴放置5 min后加入200 μL终止液(50 mmol·L-1的NaOH溶液与20%的醋酸溶液按1∶2的体积比混合)，吹打均匀。将上述混合液于12 000 r·min-1离心3 min，取上清200 μL加入40 μL质量浓度为0.5%的显色液[对二甲氨基苯甲醛(PDAB)的甲醇溶液]，室温显色10 min后测定OD415。 游离酶的酶活定义：在37 ℃、pH值8.5、底物浓度一定的条件下，每分钟催化CPC生成1 μmol 7-ACA所需的酶量定义为1个酶活力单位。 固定化CPC酰化酶(以下简称固定化酶)酶活测定方法及酶活定义与游离酶相同。 1.5 固定化酶性质的测定 1.5.1 固定化酶的热稳定性 将固定化酶加到20 mmol·L-1 pH值8.0的PB溶液中，在50 ℃温育不同时间，定时测定固定化酶酶活，计算残余酶活(以零时刻初始酶活值为100%的相对酶活，下同)。 1.5.2 固定化酶的pH值稳定性 将固定化酶置于pH值分别为6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的20 mmol·L-1 PB溶液中，25 ℃下温育不同时间，定时测定固定化酶酶活，计算残余酶活。 1.5.3 酶与载体的结合强度 十二烷基磺酸钠(SDS)与蛋白质的疏水部分结合会破坏其折叠结构，形成稳定的