结核病 分子生物学检验方法
结核病诊断TSPOT实验
02
结核杆菌实验室检查
结核诊断--临床应用
• 几乎所有的临床内科科室 都需要结核的鉴别诊断：
– 发热待查，结核排筛 – 结脑的鉴别诊断 – 胸腹水患者待查 – 儿童结核
16
结核杆菌
结核病 实验室检查
细菌学检查
分枝杆菌分离培养 分支杆菌药敏试验 分枝杆菌菌种鉴定
体液免疫学诊断
免疫学检查
细胞免疫学诊断
结核病诊断TSPOT实验文档ppt
目录
01. 分枝杆菌概述 02. 结核病实验室检查 03. 小结
2
01
分枝杆菌概述
3
分枝杆菌属分类
➢结核分枝杆菌(M.tuberculosis) ➢非结核分枝杆菌（NTM） ➢麻风分枝杆菌（）
4
结核分枝杆菌的发现
1882年 德国柯赫医生发现结核致病菌----结核杆菌
▪敏感性较直接涂片法高，理论上10-100条菌/毫升可检出阳性； ▪特异性较直接涂片法高，可以从菌落生长速度、色素产生初步判断非 结核分枝杆菌； ▪分离出具有活力的纯培养物，为进一步药敏试验提供基础。
▪需时长，根据接种量的大小，一般2-8周才能得到肉眼可见菌落。 ▪结果受标本保存运送时间、培养基成分和质量、前处理方法等影响， 操作较直接涂片法复杂，需经严格培训 。 ▪需培养基凝固灭菌器、离心机、涡旋振荡器、恒温培养箱等设备。 ▪成本是直接涂片法的7-8倍。
1份痰标本直接涂片抗酸杆菌镜检阳性+肺部影像学检查符合活动性肺结核表现。
细胞免疫学检查 *结[核Ep感ub染a者he体ad内o存f 在pr特int异] 的效应T淋巴细胞，PP效D应-T-淋结巴核细胞菌再素次受试到验
Janssens et al ERJ 2007 30(4):722-8
分子生物学技术在结核病诊断中的应用分析
分子生物学技术在结核病诊断中的应用分析摘要：目的对分子生物学技术在结核病诊断中的应用实施分析。
方法本次研究中共计选择了2020年1月至2020年12月期间在我中心初诊为肺结核疑似病例或临床病例的371例患者为对象，371例患者均为痰涂片阴性病例，对其全部开展DNA实时荧光恒温扩增检测和交叉引物恒温扩增检测技术和改良罗氏培养进行诊断。
结果所有参与本次研究的371例初诊为肺结核疑似病例或临床病例，通过DNA实时荧光恒温扩增检测和交叉引物恒温扩增检测技术进行诊断之后，最终有63例患者确诊为分子生物学阳性病例、47例为培养阳性病例。
DNA实时荧光恒温扩增检测和交叉引物恒温扩增检测阳性率比涂片镜检和改良罗氏培养更高。
结论在对肺结核疑似病例或临床病例实施诊断期间，对患者采取实时DNA实时荧光恒温扩增检测和交叉引物恒温扩增检测具有比较高的诊断效果，值得推广。
关键词:分子生物学技术；结核病；诊断；价值结核病是由结核分枝杆菌感染引起的慢性传染病,是全球最具威胁的传染病之一。
据世界卫生组织统计,我国患结核病人数居世界第2位,是全世界22个结核病流行严重的国家之一[1]。
结核病实验室检查是结核病诊断、治疗方案制定和治疗效果评估的重要依据。
目前我国大多数实验室广泛采用细菌学检查方法,包括抗酸杆菌痰涂片镜检和分枝杆菌分离培养。
涂片检查简便、易行,但阳性检查率较低[2];分离培养法是目前结核病诊断的金标准,具有很高的灵敏度,但至少需要3~8周的时间,但耗时较长,不能满足结核病早期诊断的要求。
随着分子生物学的发展,近年来涌现出很多方法用于结核分枝杆菌的快速诊断及鉴定[3]。
本文正是基于此，选择了2020年1月至2020年12月期间在我中心初诊为肺结核疑似病例或临床病例的371例患者为对象，对分子生物学技术在结核病诊断中的应用进行分析，具体的研究情况报道如下。
1资料与方法1.1一般资料本次研究中共计选择了2020年1月至2020年12月期间在我中心初诊为肺结核疑似病例或临床病例的371例患者为对象，对所有患者共计742份痰标本进行诊断。
结核病实验室诊断技术2017.10.13
• 绝对浓度法 • 比例法
• 液体培养法
基于固体培养基；时间：4周 多种药物
基于液体培养基，时间：4-12天 INH/RFP/SM/EMB/PZA
结核分枝杆菌药物敏感试验
不同药敏方法的差异
三者在临界药物浓度接种菌量、结果判读方法等方面都有一定差 别，导致结果有很少一部分不相符
比例法和绝对浓度法检测结果的一致率4 药均高达96 %以上,对于 结核分支杆菌,二种方法测试 SM INH RFP EMB的耐药率均无显著 性差异
涂片显微镜检查的敏感性
观察到的AFB
AFB估计数量 涂片阳性的可能性(%)
数量
( /ml)
• 0 in ≥100 fields
< 1,000
<10
• 1-2 in 300 fields 5,000 – 10,000
50
• 1-9 in 100 fields about 30,000
80
• 1-9 in 10 fields
结核分枝杆菌药敏试验-菌型鉴定
利用固体罗氏鉴别培养基的鉴别：
中性罗氏 培养基
+
噻吩-2-羧酸 肼TCH
+
对硝基苯 甲酸PNB
+
菌型鉴定 NTM
+
+
-
人型Mtb
+
-
-
牛型Mtb
结核分枝杆菌药敏试验-菌型鉴定
• 原理：硝基苯甲酸还原酶机制
绝大部分非结核分枝杆菌能将对硝基-苯甲酸（PNB ）还原为细菌能够利用的对氨基-苯甲酸（PABA），而 绝大部分（98%以上）MTBC缺乏对硝基-苯甲酸（PNB ）还原酶活性，为对氨基-苯甲酸（PABA）将对硝基苯甲酸（PNB）还原为细菌能够利用的对氨基-苯甲酸 （PABA） • 局限：鉴定周期长15天-30天，特异性不高
结核病分子诊断
3、耐药基因检测
多重耐药结核杆菌、广泛耐药结核杆菌的流行， 是结核病防治中的重大问题
耐药的主要原因是药物主要靶点的基因发生了 突变
检测这些耐药基因相关突变，可为临床治疗提 供依据：例如异烟肼耐药菌存在KatG基因突变 或缺失，突变模式为S315T。利福平耐药菌发生 发生了点突变、插入或缺失，突变形式为S531L、 H526Y等。
尿液 清晨第一次全部尿量或24小时尿沉渣
胸腹腔积液 尽快送检、离心
谢谢聆听！
结果判读
试验分四组：空白对照组、抗原组(ESAT-6和CFP10)、阳性对照组(植物血凝素PHA)。
通常正常结果：空白对照孔没有或有很少的斑点而 PHA对照孔斑点数超过20个。 空白对照孔斑点数超 过10个时结果被认为是“不确定”。当PHA对照孔 斑点数少于20个时，检测结果被认为是“不确定”。
如果抗原A和/或抗原B有应答，检测结果为“有反 应性”，参照以下标准：
空白对照孔斑点数为0-5个时且（抗原A或抗原B孔 的斑点数）-（空白对照孔斑点数）≥6；
空白对照孔斑点数为6-10个时且（抗原A或抗原B 孔的斑点数）≥2×（空白对照孔斑点数）；
检测结果为“无反应性”：不符合上述标准且 PHA对照孔正常。
还是死菌，也不能对疗效进行评价。
临床意义：
TB-DNA阳性主要见于：传统培养或涂 片阳性的患者，菌量多，有活力；涂片或培 养阴性的患者，患者菌量少，涂片或培养阳 性率低；经治疗后带有死菌或低活力菌的患 者；体内结核杆菌已死亡，但DNA尚未分 解。
TB-DNA阴性主要见于：非结核分枝 杆菌感染。非结核病患者；不排菌患者。
凡临床怀疑肺结核的患者，在送检痰涂片 和痰培养的同时，送检痰TB-DNA检查。
结核病诊断细菌学检验规程
结核病诊断细菌学检验规程一、样本采集结核病诊断细菌学检验的样本主要包括痰液、肺泡灌洗液、血液等。
采集样本时应遵守无菌操作原则，避免交叉感染。
样本采集后应尽快送检，并注明采样时间、病人姓名、年龄、性别、疾病等信息。
二、样本处理1.痰液处理：将痰液放入无菌容器中，加入等量1%氢氧化钠溶液，混合均匀，作用15分钟后用无菌水冲洗2～3次，再取沉淀物涂片检查。
2.肺泡灌洗液处理：将肺泡灌洗液过滤后，离心沉淀，取沉淀物涂片检查。
3.血液处理：抽取病人静脉血5～10毫升，离心沉淀，取沉淀物涂片检查。
三、抗酸染色涂片染色采用萋-尼氏染色法，涂片干燥后用萋-尼氏染色液染色，然后用碳酸钠溶液冲洗，最后用无水乙醇脱色，晾干后镜检。
抗酸染色阳性表明涂片中有抗酸菌存在，可用于初步诊断结核病。
四、培养法将处理后的样本接种在罗氏培养基或改良罗氏培养基上，置37℃恒温箱中培养。
结核分枝杆菌在此培养基上生长缓慢，需时约6～8周。
培养阳性表明有结核分枝杆菌生长，可用于确诊结核病。
五、药敏试验药敏试验用于检测结核分枝杆菌对药物的敏感性。
试验方法有多种，如纸片法、比例法等。
药敏试验结果可作为选择和调整抗结核药物的依据。
六、鉴定与分型通过形态学、生化反应和基因鉴定等方法对结核分枝杆菌进行鉴定与分型。
这些方法有助于了解结核病的传播途径和特点，为预防和治疗提供依据。
七、质控与报告发放结核病诊断细菌学检验的质控包括室内质控和室间质评。
室内质控主要是对检验过程进行质量控制，包括试剂质量、仪器校准等；室间质评则是通过参加实验室间的比对试验来评估检验结果的准确性。
检验结果经审核后发放给临床医生或病人。
报告应包含样本采集时间、病人信息、检验方法、检验结果等内容。
几种常见的结核分枝杆菌快速检测方法
肺结核属于肺部慢性传染疾病，临床发病率高，该病的主要致病菌为结核分枝杆菌，病程相对较长，会向全身多个脏器累及。
菌阴肺结核指的是通过一次结核杆菌培养以及三次痰涂片检查，结果均显示为阴性的肺结核患者，具有较低的传染性。
大多数患者不了解菌阴肺结核的相关性知识，如果没有采取及时有效的诊断、治疗，患者的病情就会延误，继而转变为阳性，对患者的预后造成不利影响。
目前，临床中对于菌阴肺结核的特异性诊断措施相对缺乏，最常用的方法就是痰或呼吸道采集标本中结核分枝杆菌的检验。
近年来，结核病的发病率及死亡率呈现逐年上升的趋势。
筛选出一种能有效确诊早期结核病的检验方法十分重要。
目前临床上应用于辅助结核病诊断的检验方法以结核分枝杆菌培养和抗酸染色涂片为主，其中培养法作为结核疾病诊断的金标准具有准确性高、特异性高的优势。
结核分枝杆菌痰的分离培养，消耗时间较长，如果利用固体改良罗氏培养基进行培养，一般会需要至少20d，最长可需要60d，如果使用先进的全自动分枝杆菌进行检测，至少需要7d，至多需要20d。
实验室一般会通过痰涂片法进行检测，该方法的操作相对简单，价格较低，但是，操作费时，在基层痰检实验室涂片量过大的时候，一天内无法得到实验结果，这种现象无法满足目前的结核病防治工作。
近些年来，随着染色技术的逐渐先进，荧光染色技术作为新型的实验手段，已经在医学科学领域中广泛应用。
目前，涂片染色法已经成为无菌体液的主要检查方法，但是，通过传统制片以及染色法的检出率相对较低，误诊率以及漏诊率较高。
主要是因为染色时制片以及标本固定环节容易出现误差，而细胞沉淀仪法、改良的抗酸染色法、萋-尼氏抗酸染色法、金胺O荧光染色法、PCR等技术的应用越来越多。
传统方法：获取痰标本后，排除口水痰，然后纳入研究范围，确认纳入的当天，需要在每份痰标本相同位置，取两份，制成痰涂片。
离心处理标本，再在洁净的玻片上涂抹沉渣，涂完一层之后，使其自然干燥，再次涂抹，形成厚涂片，先使用萋尼抗酸染色法进行染色，随后使用石炭酸复红溶液初染，再使用盐酸酒精脱色，然后用美兰复染，寻找红色区域，待涂片干燥后置于显微镜镜检，于蓝色背景中寻找红色的杆状、分枝状细菌。
结核病的实验室诊断方法
结核病的实验室诊断方法结核病实验室检查主要有；涂片染色显微镜检查、分枝杆菌分离培养、分枝杆菌药物敏感性试验、分枝杆菌菌种鉴定、分枝杆菌基因分型、分枝杆菌血清学及核酸扩增检测等。
细菌学检查细菌学检验结果的准确性首先取决于标本的质量。
正确地采集、转送标本，是直接影响检验结果的重要因素和取得准确结果的前提。
各种标本(痰液、血液、伤口分泌物和各种感染组织等)采集时应充分考虑到选择恰当合理的时问，考虑到可能存在的病原菌的性质，按要求采集标本，这样可使标本包含细菌，并为后续检验步骤打下良好的。
合格的痰标本在低倍镜视野里上皮细胞应<10个，白细胞数应>25个。
涂片染色显微镜检查根据我国结核病防治规划的要求，对咳嗽、咳痰>13周或有咯血或血痰的肺结核可疑症状者，应留取3份痰标本(夜间痰、清晨痰和即时痰)进行痰涂片抗酸染色检查。
即时痰为病人就诊时咳出的痰液：清晨痰为清晨深咳出的痰液；夜间痰为就诊前1天晚睡前咳出的痰液。
留取的痰液标本常规涂片后，进行要尔－尼尔逊氏染色法(ziehl-Neelen)染色。
分枝杆菌分离培养结核分枝杆菌是兼性需氧菌，最适生长温度为37℃，最适pH为6.5～7.2。
分枝杆菌分离培养检查法，是结核病确诊最可靠的方法。
是获得纯培养物进行菌种鉴定、药物敏感性试验以及其他生物学研究的。
当前，我国普遍采用改良L-J(改良罗氏)培养基来分离培养结核分枝杆菌。
通常情况下，当每1ml标本中微生物含量达102～3CFU(菌落形成单位)时，即可培养阳性。
分枝杆菌快速培养检查是使用分枝杆菌快速培养仪(MIGT、BacT/A1err、ESP)，通过测定细菌生长代谢检测分枝杆菌生长情况的方法。
在进行分枝杆菌快速培养检查时，标本接种前的祛污染处理，必须严格按照系统说明书中给定的方法进行。
孵育检测过程中系统报告阳性时，相应标本的培养液必须首先进行抗酸染色镜检，发现抗酸菌后方可发出阳性报告。
分枝杆菌药物敏感性试验分枝杆菌药物敏感性试验对于结核病人合理的药物选择、合适的药物剂量以及针对耐药病人的预防控制具有积极的作用。
结核检测方法(2)0000
病原体感染后各靶标的含量变化
相对 浓度示意
RNA
用药治疗
DNA
病原体 抗体
窗口期
二、结核实验室常规检测方法
➢ γ-干扰素释放试验
二、结核实验室常规检测方法
➢ 辅助诊断涂阴肺结核
▲姓名：*** ▲性别：男 ▲年龄：28岁， ▲症状：咳嗽咳痰2周，疲惫，午后发热，既往体健 ▲胸部影像：弥漫粟粒样结节 ▲县医院初步诊断：肺结核，患者为求进一步诊断来实验室检 查： ESR:56，CRP：92，结核抗体: (-)，抗酸染色(AFS): （-） GeneXpert：（-） ▲ T-SPOT: (有反应性) 抗原A：256，抗原B：341，PHA：289 ▲诊断性抗结核治疗有效 ▲ 一月后痰结核分枝杆菌培养（-）
▲最终诊断：肺结核
二、结核实验室常规检测方法
➢ 高敏感性排除肺结核
▲姓名：*** ▲性别：女 ▲年龄：21岁 ▲症状：咳嗽咳痰2周，低热，胸闷，突发右侧眼睑下垂，既往体健 ▲胸部影像：发现两肺多发占位 ▲胸科医院诊断：肺结核，诊断性抗涝治疗无效后转我院 ▲实验室检查： ESR:29，CRP:36，结核抗体: （-）, AFS: （-） ▲ T-SPOT.TB：无反应性 抗原A: 0，抗原B：0，PHA：345 ▲ G试验:(-) GM试验:(+) ▲血隐球菌乳胶凝集试验：1:640
▲诊断：隐球菌肺炎 ▲治疗：两性霉素B＋5-FC（5-氟胞嘧啶）
二、结核实验室常规检测方法
➢ 结核分子诊断方法
分子生物学检测方法
分子生物学检测方法嘿，你知道分子生物学检测方法吗？那可真是超厉害的玩意儿！想象一下，分子生物学检测就像是在微观世界里的大侦探，能找出那些隐藏极深的秘密。
先说说步骤吧。
首先得收集样本，这就像在大海里捞针，可不能马虎。
然后进行核酸提取，把那些关键的分子从样本中分离出来，就好像从一堆杂物中挑出宝贝。
接着是扩增，让那些微量的分子变得多多的，就像吹气球一样，越吹越大。
最后进行检测分析，得出结果。
在这个过程中，一定要注意操作规范，不然就可能前功尽弃。
哎呀，你说要是不小心弄错了一步，那得多悲催啊！再讲讲安全性和稳定性。
分子生物学检测通常在特定的实验室环境中进行，安全措施那是杠杠的。
只要严格按照操作规程，就不会有啥大问题。
而且检测结果也很稳定，不会像天气一样说变就变。
这多让人放心啊！你想想，如果检测结果一会儿一个样，那还不得把人急死？那分子生物学检测都有啥应用场景呢？可多了去了！比如在医学领域，可以检测疾病的病原体，帮助医生快速准确地诊断疾病。
在食品安全方面，能检测食品中的有害物质，保障我们的餐桌安全。
在环境监测中，也能发挥大作用，检测污染物啥的。
这优势可太明显了，快速、准确、灵敏，简直无敌了！你说这么好的方法，为啥不早点用起来呢？给你举个实际案例吧。
有一次，在一个疫情防控中，分子生物学检测就大显身手。
快速检测出病毒，为防控工作争取了宝贵的时间。
要是没有这种方法，那后果简直不堪设想。
你说这分子生物学检测是不是超厉害？分子生物学检测方法就是这么牛！它是我们探索微观世界的有力武器，为我们的生活带来了很多好处。
相信在未来，它还会发挥更大的作用。
结核分枝杆菌的核酸检测
结核分枝杆菌的核酸检测结核病是一种由结核分枝杆菌引起的严重传染病，对人类健康构成了重大威胁。
准确、快速地检测结核分枝杆菌对于结核病的诊断、治疗和防控至关重要。
在众多检测方法中，核酸检测技术凭借其高特异性和敏感性，成为了结核病诊断的重要手段。
一、什么是结核分枝杆菌核酸检测结核分枝杆菌核酸检测是一种通过检测样本中结核分枝杆菌的核酸（DNA 或 RNA）来确定是否存在感染的方法。
核酸是生物体遗传信息的携带者，每种生物都有其独特的核酸序列。
结核分枝杆菌也不例外，通过检测其特有的核酸片段，可以准确地判断样本中是否有这种病原菌的存在。
二、核酸检测的原理常见的结核分枝杆菌核酸检测方法包括聚合酶链反应（PCR）、荧光定量 PCR、环介导等温扩增技术（LAMP）等。
以 PCR 为例，其基本原理是先从样本中提取核酸，然后利用特定的引物（一小段与目标核酸序列互补的 DNA 片段），在 DNA 聚合酶的作用下，经过多次循环的变性、退火和延伸过程，使目标核酸序列得到大量扩增。
扩增后的产物可以通过琼脂糖凝胶电泳、荧光检测等方法进行检测和分析。
荧光定量 PCR 则是在 PCR 反应体系中加入荧光染料或荧光标记的探针，随着 PCR 反应的进行，荧光信号不断累积，通过实时监测荧光信号的变化，可以实现对核酸的定量检测。
LAMP 技术则是利用一种特殊的酶和引物设计，在恒温条件下就能快速扩增目标核酸，具有操作简便、快速的优点。
三、检测样本的类型结核分枝杆菌核酸检测的样本类型多样，常见的有痰液、支气管肺泡灌洗液、胸水、脑脊液、血液等。
痰液是最常用的样本之一，对于肺结核患者，痰液中往往含有较多的结核分枝杆菌。
但对于一些不排痰或排痰困难的患者，如儿童、肺外结核患者，就需要采集其他类型的样本。
支气管肺泡灌洗液对于肺部病变部位的检测具有较高的准确性。
胸水和脑脊液则常用于结核性胸膜炎和结核性脑膜炎的诊断。
血液样本常用于检测潜伏性结核感染。
四、核酸检测的优势1、高特异性：能够准确识别结核分枝杆菌特有的核酸序列，减少误判。
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结核病分子生物学检验方法
结核病是一种由结核分枝杆菌引起的慢性传染病，其传播途径主要为空气飞沫传播。
结核病在全球范围内仍然是一个严重的公共卫生问题，因此早期的诊断和治疗非常重要。
分子生物学检验方法是一种快速、准确的结核病诊断方法，本文将对其进行详细介绍。
分子生物学检验方法是通过检测结核分枝杆菌的核酸来诊断结核病。
与传统的培养分离方法相比，分子生物学检验方法具有更高的灵敏度和特异性。
目前常用的分子生物学检验方法包括聚合酶链反应（PCR）和核酸杂交技术。
PCR是一种通过体外扩增目标DNA序列的技术，它可以将微量的目标DNA扩增至足够的数量进行检测。
在结核病的分子生物学检验中，PCR可以通过扩增结核分枝杆菌的特异性基因序列来检测其存在。
常用的靶基因包括IS6110、16S rRNA和hsp65等。
IS6110是结核分枝杆菌特有的序列，在结核分枝杆菌中存在多个拷贝，因此可以提高检测的灵敏度。
16S rRNA和hsp65是结核分枝杆菌的保守基因，通过扩增这些基因可以进一步确认结核分枝杆菌的存在。
核酸杂交技术是一种通过标记的探针与目标核酸序列的互补配对来检测目标核酸的方法。
在结核病的分子生物学检验中，核酸杂交技术可以通过将结核分枝杆菌的核酸序列与标记的探针进行杂交来检
测结核分枝杆菌的存在。
常用的核酸杂交技术包括荧光原位杂交（FISH）和线性探针杂交（LPA）等。
FISH是一种将荧光标记的探针与靶细胞中的核酸序列进行杂交的方法，通过观察荧光信号的强度和位置可以判断结核分枝杆菌的存在。
LPA是一种将线性标记的探针与目标核酸序列进行杂交的方法，通过检测标记的探针与目标核酸序列的杂交产物可以判断结核分枝杆菌的存在。
分子生物学检验方法在结核病的诊断中具有许多优点。
首先，分子生物学检验方法可以快速获得结果，通常在几小时内就可以完成检测。
其次，分子生物学检验方法具有高度的灵敏度和特异性，可以检测到非常低浓度的结核分枝杆菌。
此外，分子生物学检验方法还可以对结核分枝杆菌的耐药性进行检测，从而指导临床上的治疗选择。
然而，分子生物学检验方法也存在一些限制。
首先，分子生物学检验方法对样本的质量要求较高，如果样本中的核酸存在严重的降解或者污染，可能会导致检测结果的偏差。
其次，分子生物学检验方法对设备和技术的要求较高，需要专门的实验室和培训有素的操作人员。
此外，分子生物学检验方法的成本较高，不适用于资源匮乏的地区。
分子生物学检验方法是一种快速、准确的结核病诊断方法。
通过PCR和核酸杂交技术可以检测结核分枝杆菌的存在，并可以对其耐
药性进行分析。
分子生物学检验方法在结核病的早期诊断和治疗中具有重要的应用价值，但仍需要进一步改进和推广，以更好地服务于临床和公共卫生工作。