再生柞蚕丝素蛋白膜的制备及性能研究
不同分子量丝素蛋白的制备及其对丝素材料理化性能的影响
26现代丝绸科学与技术2020年（第35卷）第5期不同分子量丝素蛋白的制备及其对丝素材料理化性能的影响王颖，程志玲，孙笑笑，李明忠（苏州大学纺织与服装工程学院，江苏苏州215021）摘要:丝素蛋白材料在组织工程领域的应用前景广阔。
不同组织的再生对丝素蛋白支架的力学性能和生物降解速率有不同要求，而控制丝素蛋白的分子量可调控再生丝素材料的结构和理化性能。
蚕丝的脱胶和溶解过程对制得的丝素蛋白分子量有显著影响。
综述了脱胶、溶解体系及其工艺条件与再生丝素蛋白分子量之间的关系，以及分子量对再生丝素蛋白材料凝聚态结构、力学性能、体外生物降解速度等的影响。
关键词：丝素蛋白；分子量；理化性能丝胶将两根丝素单丝黏合于一体构成直径约为10〜20am的家蚕丝。
丝胶是球状蛋白，可溶于水，在真丝织物染色之前以及从蚕丝中提取丝素蛋白时,一般都需将其脱除。
丝素蛋白是纤维状蛋白，其分子量约为2286kDa,由重链（H链，350kDa）、轻链（L链,26kDa）及糖蛋白P25（30kDa）组成，三者的摩尔比为H：L：P25=6：6：何。
家蚕丝素蛋白具有：（1）优良的力学性能，这主要是因为丝素蛋白分子凝聚能大，且具有较高的结晶度凶；（2）良好的细胞相容性冈，丝素蛋白材料能支持骨髓间充质干细胞⑷、血管内皮细胞旧、成纤维细胞冏等多种细胞的粘附、生长、分化和迁移；（3）生物可降解性刀，降解产物为肽和游离氨基酸，可被机体吸收；（4）低免疫原性，植入体内后无明显的炎症反应口切。
家蚕丝经脱胶、溶解和纯化后可获得丝素蛋白水溶液，再通过流延法、冷冻干燥法、静电纺丝法等可制备多种形态的功能性再生丝素蛋白材料，如丝素膜、水凝胶、多孔支架、纳米微球、纳米纤维等，并应用于生物传感器、药物控制释放载体、组织工程支架等。
在组织工程领域，不同组织（如骨、肌腱、韧带、血管等）的力学性能、修复周期、组织生长速率不同，对组织工程支架的机械强度和生物降解速率的要求有很大差异。
柞蚕丝素蛋白的体外酶降解研究
在 近年 的研究 报 道 中， 丝被 用 于 制作 多 种 生 蚕
物 材料 ， 例如 用于骨 再生 的丝 素一 羟基 磷灰 石 复合 材
为 ， 降解残 留物 的理化 性 质进行 分析 ， 对 以探 讨其 降 解 过程 的动 力学机 理 和机械 性能变 化 。
料 ， 于前十 字韧带 的替代 物 ， 用 用于治 疗组 织损 伤的
一
研究 较少 。而柞 蚕 丝 素 与家 蚕 丝素 相 似 ， 活 细胞 对
具有很 好 的相容 性 ， 是一 种 具 有 很 大潜 力 的 可用 也
作生 物医用 材料 的生 物高 聚物 。本 文 的研究 目的在
于 了解柞蚕 丝素 膜暴露 于蛋 白酶 中被酶 降解 时的行
次 （ 后 至 少要有 ８ 的酶保 持 活性 ） ３ｄ ０ 。每 次换
１ 材 料 与 方 法
作 为 良好 的生物 材 料 ， 素材 料 应被 整合 入 再 丝 生 组织 ， 持久 地停 留在 再 生组 织 内直 到形 成 所 要 且 求 的功 能 。这 就提 出一个 重要 问题 即丝 素 的生 物稳 定 性 问题 。因此 ， 了解 蚕丝蛋 白的结 构 、 工过 程与 加
中， 浓度 为 ０ ３ ｗｔ ． 左右 。丝 素水溶 液 于室 温用 聚 乙烯板 流延 法制备 得 到柞 蚕 丝素 膜 。膜 用 ５ （ ／ ０ ｖ
ｖ 的 甲 醇 溶 液 处 理 ３ ｎ 在 酶 处 理 前 于 ８ 。 干 燥 ） ０ｍｉ， ５Ｃ
３ ｈ。
生 物 降解 性 能之 间 的关 系 ， 设计 蚕 丝 丝 素蛋 白基 是
间的延 长 ， 纤维 的完 整性也 将逐 渐丧 失 ， 丝 断裂 强度
下降 ， 直径减 小 ， 量也 随之逐 渐损 失 。 质
蚕丝素材料的研究与制备
蚕丝素材料的研究与制备蚕丝是一种广泛应用于各种领域的天然纤维素材料，它具有优异的物理和化学性质，因此蚕丝素材料一直是研究的重点。
本文将介绍蚕丝素材料的研究与制备。
一、蚕丝素材料的特性蚕丝素材料具有以下特性：1.高强度：蚕丝素材料的强度比同重量的钢还要高，而且能够保持很长时间。
2.柔软舒适：蚕丝素材料比其他纤维更柔软，更舒适，人们穿着蚕丝制品不容易感到不舒适。
3.保湿性：蚕丝素材料比其他纤维具有更好的保湿性能，人们穿着蚕丝制品会感到皮肤更加光滑。
4.抗菌性：蚕丝素材料具有良好的抗菌能力，可以有效抑制微生物生长。
二、蚕丝素材料的制备蚕丝素材料的制备需要从蚕的茧中提取出丝来。
具体步骤如下：1.将蚕的茧放入热水中煮沸，这会使得蚕丝变得柔软并松开。
2.用笼子将蚕丝拉出，并将多个蚕丝合并成单个的粗蚕丝。
3.将粗蚕丝放入浓碱水中，这会将其融化并分解成碱性水溶液。
4.将碱性水溶液过滤，并用酸中和，随后用机器拉丝成为单丝。
5.将精细的蚕丝纤维条覆盖在一层薄膜上，制成可纺纱的蚕丝线。
三、蚕丝素材料的应用蚕丝素材料广泛应用于各种领域，包括纺织、医疗、电子、航空航天等：1.纺织：蚕丝素材料用于制造高档服装和贴身衣物，因其舒适，柔软，且使用寿命长。
2.医疗：蚕丝素材料具有生物相容性和可降解性，可以用于制备生物医学材料，如缝合线和人工血管等。
3.电子：蚕丝素材料具有优异的电绝缘性能和热稳定性，可以用于电子产品中，如平板电视、显示器等。
4.航空航天：蚕丝素材料的强度比金属更高且密度更小，可以用于制造航空航天器件，如喷气发动机叶片等。
结语：蚕丝素材料的研究和制备，促进了其应用的广泛开发，未来蚕丝素材料的发展将会在各种领域得到不断的拓展，对人类的生产生活产生更多的价值。
丝素蛋白多孔支架制备、性能及体内外生物评价的开题报告
丝素蛋白多孔支架制备、性能及体内外生物评价的
开题报告
一、研究背景
人类组织修复与再生技术是当今生物医学研究领域的热门话题之一。
自然界中，丝素蛋白具有良好的生物相容性和生物分解性能，并能促进
细胞生长和再生组织的形成。
因此，丝素蛋白被广泛应用于组织工程、
医疗敷料、疝修复等领域。
目前，多孔支架是组织工程中重要的支撑材料。
制备高质量、合适
的多孔支架，对于成功地构建组织工程产品有着至关重要的作用。
因此，研究如何制备具有良好机械性能、生物相容性和生物可降解性的丝素蛋
白多孔支架，是当前组织工程领域需要突破的一项技术难题。
二、研究内容
1. 建立丝素蛋白多孔支架制备方法，研究各工艺参数对多孔性能和
力学性能的影响。
2. 评价丝素蛋白多孔支架在体外的生物评价，包括其细胞黏附、增
殖和分化等。
3. 评价丝素蛋白多孔支架在体内的生物评价，包括其生物降解性、
组织相容性和再生效果等。
4. 探究适宜的诱导剂和生长因子对于丝素蛋白多孔支架促进组织再
生的作用。
三、研究意义
1. 为组织工程产品的开发提供了一种新材料和制备方法，丰富了组
织修复与再生技术的手段。
2. 能够解决目前多孔支架材料在生物相容性和降解性方面的局限性，提高多孔支架在组织工程中的应用价值。
3. 通过对多孔支架的生物评价，能够进一步了解多孔支架在体外和
体内的性能，加深对组织工程的认识和理解。
4. 有助于丰富生物学、医学以及材料科学等学科之间的交叉研究，
推动医学治疗技术的发展。
丝素蛋白合成高吸水材料的研究基础和前景
丝素蛋白合成高吸水材料的研究基础和前景丝素蛋白，简称丝，是一类多肽的总称，结构由大量亮氨酸（L-Arg）和甘氨酸（L-Glu）组成，是一种类似玻璃的高分子材料，具有优异的物理和力学性能，并具有良好的生物相容性。
将其制备成无定型的超疏水性纤维状材料，具有极佳的吸收性，可以应用于环境修复，棉花类材料和生物相关材料等领域。
随着科学技术的进步，丝素蛋白纤维状材料研究取得了长足的进展，以致其在现实应用中起着越来越重要的作用。
近些年来，研究人员主要利用环境可控的改性方法，将丝素蛋白纤维材料进一步改性成具有高吸水性的复合材料。
这类吸水材料具有良好的高吸水率，弹性和抗拉强度等优点，可以广泛应用于医疗、环保、工业、军事等领域，具有重要的理论和实际意义。
研究表明，在制备具有高吸水性的丝素蛋白复合材料过程中，可以采用多种改性方法，这些方法可以有效改变丝素蛋白纤维基材的表面特性和内部结构，从而改善其水吸收。
常见的改性方法主要有环境可控的光化学改性、化学改性、电化学改性和物理改性等。
这些改性方法可用于加强材料的吸水性能，使其具有更高的吸水率和水持久性，可以有效应用于多种高吸水性材料的制备。
此外，丝素蛋白纤维状材料也可以表面改性，以改善水吸收性和抗润湿性。
表面改性是通过多种表面改性剂来改善丝素蛋白纤维表面性能的方法。
常用的表面修饰剂主要包括有机化学、生物化学、物理化学等，通过基材物理表面改性和化学改性等方法，可以有效提高丝素蛋白纤维状材料的表面性能，例如水吸收率、抗润湿性、抗菌性和耐腐蚀性等。
在未来的研究中，丝素蛋白纤维状材料的开发和性能改进将是推动丝素蛋白纤维状材料应用发展的主要方向。
通过改性和表面改性，可以在维持原有结构的基础上，有效改善丝素蛋白纤维状材料的物理特性和表面性能。
此外，随着纳米技术的发展，丝素蛋白纳米纤维状材料的研究也受到了广泛关注，将会为丝素蛋白材料的开发和应用带来更多的可能性。
总之，丝素蛋白合成的高吸水性材料由于其优异的物理性能和生物相容性，可以广泛应用于环境修复、工业和医疗等领域。
基于酪氨酸酶的丝素蛋白膜的制备及其性能
基于酪氨酸酶的丝素蛋白膜的制备及其性能李新玥;邢铁玲【摘要】基于酪氨酸酶对丝素蛋白的催化氧化,用流延法制备了丝素蛋白膜.通过反应浴中溶解氧的消耗分析,验证了酪氨酸酶可以催化丝素上的酪氨酸残基发生氧化反应.采用紫外/可见分光光度计对交联前后丝素溶液的吸光度进行测试,确定最佳的膜制备条件为:酶用量4 000 U/g,反应温度45℃,反应时间120 min.最后测试了丝素膜的热水溶失率和力学性能,结果表明交联丝素膜的溶失率低于未交联的,而且交联丝素膜的断裂强度和初始模量高于未交联的,交联与否膜的断裂伸长率几乎没有变化.通过丝素膜的氨基酸含量分析,以及X射线衍射分析,进一步验证了酪氨酸酶的加入起到了促进丝素蛋白分子间交联的作用.【期刊名称】《丝绸》【年(卷),期】2013(050)010【总页数】6页(P24-29)【关键词】酪氨酸酶;丝素膜;交联;制备;性能【作者】李新玥;邢铁玲【作者单位】苏州大学纺织与服装工程学院,江苏苏州215021;苏州大学纺织与服装工程学院,江苏苏州215021【正文语种】中文【中图分类】TS149;Q814.9丝素蛋白具有良好的绿色环保性能，一直是人们研究的热点。
早期的丝素蛋白主要用于食品添加剂和化妆品中［1］。
在目前的研究中，丝素蛋白由于与生俱来的无毒性、无刺激性，优良的生物相容性和可降解性等优势，常被用于制备人工皮肤、人工骨骼、酶固定化材料、药物缓释载体、抗血凝性材料、细胞培养基质等生物医用材料的重要可选原料［2］。
丝素蛋白溶液直接经一般条件烘干、静电纺或冷冻干燥等方法制得膜、无纺网和多孔支架等不同形态的材料，其聚集态结构多以无规卷曲为主，分子间的结合力较弱，在水中溶失率大，限制了丝素蛋白材料的应用［3］。
当前多采用各种物理和化学方法制备共混的丝素膜，从而得到耐水性好的材料。
酪氨酸酶(Tyrosinase)是一种含铜的金属酶，广泛分布于微生物、动植物及人体中，它具有双重的生物催化作用，既有单酚酶活性又有二酚酶活性，既能催化单酚类化合物生成邻苯二酚，又能氧化邻苯二酚脱氢生成邻苯醌，能将酪氨酸羟化，产生L-多巴，然后再将多巴氧化成多巴醌，进而生成一系列引起褐化的色素类物质［4］。
基于三元溶液为溶剂的再生丝素纤维的制备及结构性能的研究
基于三元溶液为溶剂的再生丝素纤维的制备及结构性能的研究吕红;田保中【摘要】以CaCl2∶H2O∶C2H5OH=1∶8∶2（摩尔比）为溶剂溶解丝素,然后采用湿法纺丝制得再生丝素纤维。
用电子显微镜（SEM）、红外光谱（FTIR）、广角X射线衍射（XRD）、热分析（TG/TA）等方法对再生丝素纤维进行测试分析表明,与天然丝素纤维相比,再生丝素纤维蛋白质的构象发生了变化,结晶度降低;通过对再生丝素拉伸纤维的力学性能进行测试分析,结果表明再生丝素拉伸纤维的断裂强度和断裂伸长率降低。
在纺丝过程中经过第二凝固浴后,再生丝素拉伸纤维的断裂伸长率有了明显的升高。
【期刊名称】《现代丝绸科学与技术》【年(卷),期】2012(027)002【总页数】4页(P52-55)【关键词】湿法纺丝;再生丝素纤维;结构和性能【作者】吕红;田保中【作者单位】苏州大学纺织与服装工程学院,江苏苏州215021;苏州大学纺织与服装工程学院,江苏苏州215021／现代丝绸国家工程实验室,江苏苏州215123【正文语种】中文【中图分类】TQ341.5蚕丝是一种天然的蛋白质，通过脱胶后得到的丝素是一种天然蛋白质纤维[1]。
由于丝素的生物相容性良好，无毒，无刺激，被广泛的应用于生物医学等领域。
近年来随着生物医疗技术及其他高新技术的发展，再生丝素材料的开发和利用日趋广泛，丝素可以不同的形式再生，包括溶液、膜、粉末、纤维等。
丝素蛋白是一种线型蛋白质[2]，丝素溶液就具备了制取再生丝素纤维的基本条件，采用的纺丝方法有干法纺丝，湿法纺丝，干湿法纺丝和静电纺丝，其中湿法纺丝的研究最为普遍, 但由于再生丝素纤维的力学性能不能达到要求，目前仍然处于试验研究阶段。
三元溶液(CaCl2∶H2O∶C2H5OH=1∶8∶2(摩尔比))是溶解丝素最常用的溶剂。
本文以三元溶液溶解丝素制得纺丝液通过湿法纺丝制得再生丝素纤维，用SEM、FTIR、XRD，TG/TA等方法对再生丝素初生纤维的结构进行测定,分析其结构的变化，对再生丝素拉伸纤维的力学性能进行测试，分析其力学性能的变化。
丝素蛋白的研究和应用进展
物 材 料 的 最新 研 究进 展 。并 对 丝 素 蛋 白的 纺 丝 研 究 进 展 进 行 了述评 。
关键词 ： 丝素蛋 白； 结构 ； 生物材料 ； 生物 医学材料 ； 纺丝 中图分类号： Ｓ ０ ． Ｔ １１３ 文献标识码 ： Ａ 文章编号 ：６ ３ ３ ６ ２ Ｏ ）２ Ｏ ３ ６ １ ７ 一Ｏ ５ （Ｏ ７ Ｏ ～Ｏ１ 一Ｏ
而用于临床上如 用作 手术缝 合线 等 ， 已经 有几 十年 的历史 。 也
自从发现丝素蛋 白具有 独特 的物理化学性质和对人体有 良好的 相容性 以来 ， 它作为食品 添加 剂和 在化妆品上 的应 用 已进 行了 广泛的研究。近年来 ， 逐渐发现丝 素蛋 白有更 多潜 力 ， 应用于 如 生物传感 ， 生物医学材料 ， 软组织相容材料 ， 组织 工程等领域 ， 同 时在传统 领域也有 了新 的进展 。
度 的提高而增大 。
Ａｒｉ ｋ ｙｋ 等 用丝素膜和丝素纤维培养水解蛋 白酶 １ ａ Ｔａａ ｕ ｉ
～
１ ， ７ｄ 研究丝素在体外 的生物降解情 况 。结果表 明培养 酶后 ，
丝素纤维样品的重量和聚合度 的变化很小 ， 伸性受 酶的影响 拉 大， 与降解时 间成 函数关系 ； 丝素膜试样的重量和聚合度都有明 显 的减小 ， 减小 程度 与酶 的种类 ， ～基 质 比例 及 降解时 间有 酶 关， 如培养蛋 白水解 酶就 比培养 一胰凝 乳蛋 白酶 降解表 现明 显 。丝素纤维的生物 降解表现 为表 面粗糙 度的增 大 ， 丝素 膜的 生物降解表现为膜表 面龟 裂和 内部空穴 。 直接制得的丝素蛋 白材料 ， 如膜 、 凝胶 、 粉末 和纤维等 都溶
蚕丝是 由蚕体 内绢丝 腺分泌 出来的丝液 凝 固而成 ， 由丝 它 素蛋白（ｉ ｉｒｉ， Ｓｌ Ｆｂｏ 简称 Ｓ ） ｋ ｎ Ｆ 和丝胶蛋 白（ ｉ ｅｉｎ） Ｓｌ Ｓ ｒ ｉ 两部分 ｋ ｃ 组成 。丝素蛋 白是蚕 丝的主体 ， 占蚕丝 质量 的 ７ ～８ ， 约 Ｏ Ｏ 是一种无生理活性的天然 生物大分 子 ， 由乙氨 酸 、 氨酸 、 丙 丝氨 酸、 酪氨酸等 １ 种 氨基酸 以多 缩氨键连 接而 成 ， 常认 为其分 ８ 通
调控丝素蛋白膜的力学性能研究进展
调控丝素蛋白膜的力学性能研究进展
刘海宇;梁文安;王叶元;胡豆豆;孙京臣
【期刊名称】《丝绸》
【年(卷),期】2024(61)4
【摘要】作为一种潜在的生物材料,以丝素蛋白制备的膜材料越来越多地应用到生物医学领域。
丝素蛋白膜的力学性能是一个重要的表征参数,对其后续的体外体内应用有较大的影响。
本文先简述丝素蛋白的多级结构与力学性能的关系;然后总结制备工艺对丝素蛋白膜力学性能的影响,阐述不同的处理方式对丝素蛋白膜微观结构的影响及由此所致的力学性能的变化。
丝素蛋白膜的制备工艺包括丝素蛋白溶液的制备(先脱胶再溶解丝素)、成膜工艺(按结构形式分为致密膜、多孔膜和多层膜),以及成膜后处理(有机溶剂浸泡、水蒸气退火和外力作用)等。
此外,讨论复合丝素蛋白膜中不同改性方法导致的结构变化与力学性能的关系。
最后,展望丝素蛋白膜材料的发展趋势,为不同需求下的丝素蛋白膜的发展提供借鉴和参考。
【总页数】12页(P50-61)
【作者】刘海宇;梁文安;王叶元;胡豆豆;孙京臣
【作者单位】华南农业大学动物科学学院
【正文语种】中文
【中图分类】TS102.54;TB324
【相关文献】
1.双轴向不同拉伸速率下丝素蛋白/聚己内酯复合纳米纤维膜的力学性能
2.改善再生丝素蛋白材料力学性能的研究进展
3.预处理对丝素蛋白膜调控羟基磷灰石晶体生长的影响
4.混杂聚丁二酸丁二醇酯调控再生丝素蛋白超细纤维膜的力学性能
5.丝素蛋白再生医学材料对细胞功能调控的研究进展
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乙醇诱导的柞蚕丝素蛋白多孔材料的研究
研究与技术ＤＯＩ:１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.１００１￣７００３.２０１８.１０.００１乙醇诱导的柞蚕丝素蛋白多孔材料的研究王心如１ａꎬｂꎬ邹盛之１ａꎬｂꎬ冯文庆１ａꎬｂꎬ张耀鹏１ａꎬｂꎬ张佳明２ꎬ邵惠丽１ａꎬｂ(１.东华大学ａ.纤维材料改性国家重点实验室ꎻｂ.材料科学与工程学院ꎬ上海２０１６２０ꎻ２.复旦大学附属华山医院老年科ꎬ上海２０００４０)摘要:文章采用乙醇诱导再生柞蚕丝素蛋白(ＡＳＦ)水溶液形成凝胶ꎬ并对该凝胶冷冻干燥制备出不溶于水的ＡＳＦ多孔材料ꎬ利用傅里叶变换红外光谱(ＦＴＩＲ)和扫描电子显微镜(ＳＥＭ)研究乙醇水溶液浓度㊁ＡＳＦ初始浓度对ＡＳＦ凝胶及其冻干后样品结构的影响ꎬ并采用激光扫描共聚焦显微镜(ＬＳＣＭ)对ＡＳＦ多孔材料的生物相容性进行评价ꎮＦＴＩＲ结果表明ꎬ乙醇诱导ＡＳＦ水溶液成胶伴随着大量β￣折叠构象的形成ꎮＳＥＭ结果显示ꎬ冻干后的ＡＳＦ多孔材料孔径在１４.２~３０.４μｍꎮＬＳＣＭ结果表明ꎬ该材料在生物医学领域具有潜在的应用价值ꎮ关键词:柞蚕丝素蛋白ꎻ冷冻干燥ꎻＦＴＩＲꎻβ￣折叠构象ꎻ凝胶中图分类号:ＴＳ１０２.３３㊀㊀㊀文献标志码:Ａ㊀㊀㊀文章编号:１００１￣７００３(２０１８)１０￣０００１￣０８㊀㊀㊀引用页码:１０１１０１ＳｔｕｄｉｅｓｏｎＡｎｔｈｅｒａｅａｐｅｒｎｙｉｓｉｌｋｆｉｂｒｏｉｎｐｏｒｏｕｓｍａｔｅｒｉａｌｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙｅｔｈａｎｏｌＷＡＮＧＸｉｎｒｕ１ａꎬｂꎬＺＯＵＳｈｅｎｇｚｈｉ１ａꎬｂꎬＦＥＮＧＷｅｎｑｉｎｇ１ａꎬｂꎬＺＨＡＮＧＹａｏｐｅｎｇ１ａꎬｂꎬＺＨＡＮＧＪｉａｍｉｎ２ꎬＳＨＡＯＨｕｉｌｉ１ａꎬｂ(１ａ.ＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｆｏｒＭｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＣｈｅｍｉｃａｌＦｉｂｅｒｓａｎｄＰｏｌｙｍｅｒＭａｔｅｒｉａｌｓꎻ１ｂ.ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＭａｔｅｒｉａｌｓＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇꎬＤｏｎｇｈｕａＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＳｈａｎｇｈａｉ２０１６２０ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＧｅｒｉａｔｒｉｃＣａｒｄｉｏｌｏｇｙꎬＨｕａｓｈａｎＨｏｓｐｉｔａｌꎬＦｕｄａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＳｈａｎｇｈａｉ２０００４０ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ:Ａｎｔｈｅｒａｅａｐｅｒｎｙｉｓｉｌｋｆｉｂｒｏｉｎ(ＡＳＦ)ｇｅｌｓｗｅｒｅｐｒｅｐａｒｅｄｆｒｏｍｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄＡＳＦａｑｕｅｏｕｓｓｏｌｕｔｉｏｎｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙｅｔｈａｎｏｌꎬａｎｄｆｒｅｅｚｅ￣ｄｒｉｅｄｔｏｆｏｒｍｉｎｓｏｌｕｂｌｅＡＳＦｐｏｒｏｕｓｍａｔｅｒｉａｌｓ.Ｆｏｕｒｉｅｒｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｆｒａｒｅｄｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ(ＦＴＩＲ)ａｎｄｓｃａｎｎｉｎｇｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ(ＳＥＭ)ｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｅｔｈａｎｏｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎａｎｄｏｒｉｇｉｎａｌＡＳＦｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｎｔｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＡＳＦｇｅｌａｎｄｉｔｓｆｒｅｅｚｅ￣ｄｒｉｅｄｓａｍｐｌｅｓ.Ｍｏｒｅｏｖｅｒꎬｌａｓｅｒｓｃａｎｎｉｎｇｃｏｎｆｏｃａｌｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ(ＬＳＣＭ)ｗａｓｕｓｅｄｔｏｆｕｒｔｈｅｒｅｖａｌｕａｔｅｔｈｅｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙｏｆｔｈｅｏｂｔａｉｎｅｄＡＳＦｐｏｒｏｕｓｍａｔｅｒｉａｌｓ.ＦＴＩＲｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｇｅｌａｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓｏｆｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄＡＳＦａｑｕｅｏｕｓｓｏｌｕｔｉｏｎｉｎｄｕｃｅｄｂｙｅｔｈａｎｏｌｗａｓａｃｃｏｍｐａｎｉｅｄｂｙｔｈｅｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌβ￣ｓｈｅｅｔｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ.ＳＥＭｒｅｓｕｌｔｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｐｏｒｅｓｉｚｅｏｆｔｈｅｏｂｔａｉｎｅｄＡＳＦｆｒｅｅｚｅ￣ｄｒｉｅｄｓａｍｐｌｅｓｒａｎｇｅｄｆｒｏｍ１４.２ｔｏ３０.４μｍ.ＬＳＣＭｒｅｓｕｌｔｓｆｕｒｔｈｅｒｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅＡＳＦｍａｔｅｒｉａｌｓｈａｄｇｒｅａｔｐｏｔｅｎｔｉａｌｆｏｒｂｉｏｍｅｄｉｃａｌａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:Ａｎｔｈｅｒａｅａｐｅｒｎｙｉｓｉｌｋｆｉｂｒｏｉｎꎻｆｒｅｅｚｅ￣ｄｒｙｉｎｇꎻＦＴＩＲꎻβ￣ｓｈｅｅｔｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎꎻｇｅｌ收稿日期:２０１７￣１１￣２３ꎻ修回日期:２０１８￣０８￣３０基金项目:国家自然科学基金项目(２１６７４０１８)ꎻ上海市曙光人才计划项目(１５ＳＧ３０)ꎻ国家重点研发计划(２０１８ＹＦＣ１１０５８００ꎬ２０１８ＹＦＣ１１０６００２)作者简介:王心如(１９９３)ꎬ女ꎬ硕士研究生ꎬ研究方向为生物质材料成型与加工ꎮ通信作者:张耀鹏ꎬ教授ꎬｚｙｐ＠ｄｈｕ.ｅｄｕ.ｃｎꎮ㊀㊀生物医用材料是一类与生命系统相作用ꎬ用以诊断㊁治疗㊁修复和替代人体病变或损伤的组织㊁器官ꎬ或增进其功能的材料[１]ꎮ目前ꎬ正在研究及已得到应用的生物医用材料很多ꎬ例如硅橡胶㊁胶原蛋白㊁甲壳胺㊁尼龙㊁聚酯等ꎬ它们各有其特点ꎬ但有些合成材料的生物相容性不足ꎬ有些天然材料则提纯比较困难ꎬ成本较高[１￣２]ꎮ相比之下ꎬ天然蚕丝是一种容易获得且价格相对便宜的生物材料ꎬ由于其具有优良的柔韧性㊁吸湿性㊁透气性和优雅的光泽而被人们熟知ꎮ蚕丝中含有生物相容性良好的丝素蛋白ꎬ而丝素蛋白自身及降解产物对细胞和机体无毒ꎬ不会或较少引起炎症和免疫排斥反应ꎬ从而使得蚕丝在生物医学领域的研究得到迅速发展ꎮ蚕丝可分为家蚕丝与野蚕丝两大类ꎬ家蚕丝主要指桑蚕丝ꎬ野蚕丝则包括柞蚕丝㊁天蚕丝㊁蓖麻蚕丝等ꎬ其中柞蚕丝在我国资源丰富㊁分布广阔ꎮ目前ꎬ中国柞蚕茧每年产量占世界总产量的９０％左右[３]ꎮ近年来ꎬ人们对蚕丝丝素蛋白的研究逐渐转向分子水平ꎮ通过研究发现ꎬ柞蚕丝中的丝素蛋白(ＡＳＦ)具备一般蚕丝丝素蛋白所不具备的优点ꎬ即ＡＳＦ中含有大量的精氨酸￣甘氨酸￣天门冬氨酸(Ａｒｇ￣Ｇｌｙ￣ＡｓｐꎬＲＧＤ)三肽序列ꎬ经证明该序列对细胞的黏附有利[４]ꎬ因此ꎬ利用ＡＳＦ制备的生物组织工程支架在医学领域中有较大的应用前景ꎮ为了制备ＡＳＦ多孔组织工程支架材料ꎬ冷冻干燥技术是一种环境友好㊁经济高效的成型方法ꎮ但研究发现ꎬ经冷冻干燥法直接得到的ＡＳＦ材料是溶于水的ꎬ尚无法有效应用于生物医学领域ꎮ人们在对家蚕丝素蛋白(ＢＳＦ)的研究中发现ꎬ采用某些方法可使丝素蛋白构象转变ꎬ从而使制备的材料不溶于水ꎮ其中ꎬ用乙醇处理是最简单和可靠的方法ꎮ目前ꎬ有些研究小组已报道了乙醇影响ＢＳＦ构象的研究结果[５￣７]ꎮ然而ꎬ国内外尚未见报道在溶液中直接加入乙醇诱导ＡＳＦ成胶㊁再冷冻干燥制备ＡＳＦ多孔材料ꎮ为此ꎬ本研究以柞蚕丝为原料ꎬ采用乙醇促使ＡＳＦ溶液快速凝胶并进一步冷冻干燥的方法制备ＡＳＦ多孔材料ꎬ然后通过傅里叶变换红外光谱(ＦＴ￣ＩＲ)㊁扫描电子显微镜(ＳＥＭ)探讨了乙醇水溶液浓度及ＡＳＦ初始浓度对ＡＳＦ样品结构的影响ꎮ采用激光扫描共聚焦显微镜(ＬＳＣＭ)对ＡＳＦ多孔材料的生物相容性进行初探ꎬ本研究有望对制备性能优良的ＡＳＦ组织工程支架材料提供一定的理论指导ꎮ１㊀实㊀验１.１㊀材㊀料柞蚕丝ꎬ购自辽宁丹东(市售)ꎮ无水碳酸钠(Ｎａ２ＣＯ３)(分析纯ꎬ上海凌峰化学试剂有限公司)ꎬ硫氰酸锂(ＬｉＳＣＮ)(分析纯ꎬ西格玛奥德里奇有限公司)ꎬ纤维素透析袋(截留相对分子质量为１４０００ʃ２０００)(上海源聚生物科技有限公司)ꎬ无水乙醇(分析纯ꎬ江苏常熟市鸿盛精细化工有限公司)ꎬ雪旺细胞(ＳＣｓ细胞株)(中国科学院生物化学与细胞生物学研究所)ꎬ鬼笔环肽(ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ®５６８ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ)(英杰生命科技有限公司)ꎬ４ ꎬ６￣二脒基￣２￣苯基吲哚(ＤＡＰＩ)(北京索莱宝科技有限公司)ꎮ１.２㊀仪器与设备ＭＤＦ￣１９２型超低温冰柜(日本ＳＡＮＹＯ公司)ꎬＦＤ￣１Ａ￣５０型冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司)ꎬＮｉｃｏｌｅｔ８７００型傅里叶变换红外光谱(美国热电公司)ꎬＪＳＭ￣５６００ＬＶ型扫描电子显微镜(ＳＥＭ)(日本电子株式会社)ꎬＴＣＳＳＰ５Ⅱ型激光扫描共聚焦显微镜(德国徕卡公司)ꎮ１.３㊀再生柞蚕丝素蛋白水溶液的制备将柞蚕丝放入质量分数０.５％的Ｎａ２ＣＯ３水溶液中ꎬ浴比１︰５０ꎬ在１００ħ下脱胶３０ｍｉｎꎬ重复该过程３次ꎬ用去离子水充分洗涤ꎬ然后干燥获得脱胶丝ꎮ将脱胶丝以１︰１０的浴比在５０ħ下溶解于９.０ｍｏｌ/Ｌ的ＬｉＳＣＮ水溶液中ꎬ经离心过滤后将滤液装入纤维素透析袋ꎬ在４ħ下用去离子水透析后进一步浓缩形成初始质量分数分别为４％㊁６％㊁８％和１０％的再生ＡＳＦ水溶液ꎬ并将它们分别等体积置于不同的烧杯中待用ꎮ１.４㊀再生柞蚕丝素蛋白多孔材料的制备向上述各种质量分数的再生ＡＳＦ水溶液中以１︰１的体积比分别加入７０％㊁８０％㊁９０％和１００％的乙醇水溶液或纯乙醇ꎬ将混合溶液于４ħ下静置使其形成凝胶后ꎬ采用ＭＤＦ￣１９２型超低温冰柜在－５０ħ下对其进一步冷冻２４ｈꎬ然后采用ＦＤ￣１Ａ￣５０型冷冻干燥机进行减压干燥ꎬ得到再生ＡＳＦ多孔材料(简称ＡＳＦ冻干样品)ꎮ１.５㊀再生柞蚕丝素蛋白样品结构与性能的表征采用Ｎｉｃｏｌｅｔ８７００型傅里叶变换红外光谱(ＦＴ￣ＩＲ)仪ꎬ通过ＡＴＲ法对再生ＡＳＦ凝胶及其冷冻干燥后样品的二级结构进行表征ꎮ测定波数范围为４０００~５２５ｃｍ－１ꎬ分辨率为４ｃｍ－１ꎬ扫描次数为３２次ꎮ上述样品的ＦＴＩＲ谱图的酰胺Ⅰ区(１６００~１７００ｃｍ－１)中ꎬ各子峰与丝素蛋白二级结构的对应关系如下[８￣１０]:１６００~１６４０ｃｍ－１为β￣折叠构象ꎬ１６４０~１６６０ｃｍ－１为α￣螺旋或无规线团构象ꎬ１６６０~１６９０ｃｍ－１为β￣转角构象ꎮ按文献[１１]所述方法用Ｐｅａｋｆｉｔ软件采用高斯函数对样品谱图进行曲线拟合ꎬ根据归一化后各子峰的积分面积计算ＡＳＦ样品中对应的二级结构相对百分含量ꎮ采用ＪＳＭ￣５６００ＬＶ型扫描电子显微镜(ＳＥＭ)在１０ｋＶ电压下对表面经喷金处理的ＡＳＦ冻干样品的形态进行观察及拍照ꎬ并用图像处理软件(ＮａｎｏＭｅａｓｕｒｅｒ)分析电镜照片中１００个孔的尺寸ꎬ由此得到样品的平均孔径及孔径分布ꎮ参考文献[１２]方法ꎬ在再生ＡＳＦ多孔材料(ＡＳＦ水溶液初始质量分数为６％ꎬ乙醇诱导采用纯乙醇)上接种雪旺细胞(ＳＣｓ)ꎬ培养第４天后用鬼笔环肽和４ ꎬ６￣二脒基￣２￣苯基吲哚(ＤＡＰＩ)染色ꎬ使用激光扫描共聚焦显微镜观察接种在多孔材料上的细胞形貌ꎮ２㊀结果与分析２.１㊀乙醇诱导柞蚕丝素蛋白结构转变的二级结构分析ＡＳＦ分子的二级结构主要包括β￣折叠构象㊁α￣螺旋构象和无规线团构象ꎬ另外还有部分的中间态构象(即β￣转角构象)[１３￣１４]ꎮ图１是不同ＡＳＦ样品的ＦＴＩＲ图谱ꎮ其中ꎬ图１(ａ)为天然柞蚕丝经脱胶后的样品结果ꎬ从图中可以发现ꎬ脱胶柞蚕丝在１６２５ｃｍ－１(酰胺Ⅰ)㊁１５２０ｃｍ－１(酰胺Ⅱ)㊁１２３７ｃｍ－１(酰胺Ⅲ)㊁９６２ｃｍ－１(酰胺Ⅳ)和７００ｃｍ－１(酰胺Ⅴ)处的吸收峰均属于丝素蛋白β￣折叠构象[１５￣１６]ꎬ６２１ｃｍ－１(酰胺Ⅴ)处的吸收峰则属于α￣螺旋构象[１７]ꎮ由此可见ꎬ脱胶柞蚕丝样品的二级结构以β￣折叠构象为主ꎮ图１㊀不同ＡＳＦ样品的ＦＴＩＲ图谱Ｆｉｇ.１㊀ＦＴＩＲｓｐｅｃｔｒａｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔＡＳＦｓａｍｐｌｅｓ图１(ｂ)反映的是初始质量分数为４％的再生ＡＳＦ水溶液的红外结果ꎮ考虑到乙醇处理过程是在其中以１︰１的体积比加入乙醇或乙醇水溶液ꎬ混合溶液中ＡＳＦ的质量分数会下降至２％左右ꎬ为了便于比较分析ꎬ图１(ｃ)进一步给出了２％再生ＡＳＦ水溶液的ＦＴＩＲ结果ꎮ可以发现ꎬ图１(ｂ)与图１(ｃ)具有相同的出峰位置ꎬ其中１６４５ｃｍ－１(酰胺Ⅰ)处较尖锐的峰是丝素蛋白无规线团/α￣螺旋构象所致[１８￣１９]ꎬ而７００ｃｍ－１(酰胺Ⅴ)处属于β￣折叠构象的峰相对较弱ꎮ由此可见ꎬ与上述脱胶柞蚕丝相比ꎬ再生ＡＳＦ水溶液中β￣折叠构象要少得多ꎮ图１(ｄ)是乙醇诱导ＡＳＦ水溶液所形成的凝胶的ＦＴＩＲ图谱ꎬ较明显看出ꎬ该谱图的吸收峰位置和脱胶柞蚕丝样品(图１(ａ))的红外吸收峰位置类似ꎬ１６３０ｃｍ－１(酰胺Ⅰ)㊁１５２２ｃｍ－１(酰胺Ⅱ)㊁１２４１ｃｍ－１(酰胺Ⅲ)㊁９６５ｃｍ－１(酰胺Ⅳ)和７００ｃｍ－１(酰胺Ⅴ)处是丝素蛋白β￣折叠构象的典型吸收峰ꎬ６２１ｃｍ－１(酰胺Ⅴ)处为丝素蛋白α￣螺旋构象的吸收峰ꎮ从红外光谱变化来看ꎬ乙醇诱导溶液成胶后ꎬＡＳＦ凝胶的红外谱图(图１(ｄ))出现了明显的β￣折叠构象的吸收带ꎮ对图１(ｂ~ｄ)曲线的酰胺Ⅰ区按文献[８]提及方法进行分峰处理ꎬ可得到各样品中不同二级结构的含量ꎬ其中２％和４％再生ＡＳＦ水溶液中的β￣折叠构象含量分别仅为１０.９％和１３.０％ꎬ而添加乙醇后得到的凝胶中β￣折叠构象的含量升至２６.５％ꎬ这表明ＡＳＦ溶液在乙醇的诱导作用下形成凝胶后ꎬ部分ＡＳＦ分子由原来的α￣螺旋/无规线团构象转变成了β￣折叠构象ꎮ图１(ｅ)是上述ＡＳＦ凝胶冷冻干燥后样品的ＦＴ￣ＩＲ图谱ꎮ由图１(ｅ)可知ꎬ该样品红外光谱的出峰位置和图１(ｄ)基本一致ꎬ但酰胺Ⅰ区属于β￣折叠构象的吸收带略往低波数方向移动至１６２４ｃｍ－１处ꎮ据文献[２０]报道ꎬ酰胺Ⅰ区(１６００~１７００ｃｍ－１)的产生主要由Ｃ Ｏ伸缩振动贡献ꎬ且易受到氢键效应的影响ꎮ氢键的产生会引起伸缩振动频率向低波数方向偏移ꎬ由此说明了ＡＳＦ凝胶冷冻干燥得到的ＡＳＦ样品中含有更多的氢键ꎮ定量分析结果显示ꎬＡＳＦ冻干样品中β￣折叠构象含量也更高ꎬ这可能是因为在ＡＳＦ凝胶冷冻干燥过程中ꎬ冰晶会对丝素蛋白产生类似剪切的作用而诱导丝素蛋白由α￣螺旋/无规线团构象向β￣折叠构象转变[２１￣２２]ꎬ使得ＡＳＦ样品中形成更多的分子间氢键ꎮ因此ꎬ与ＡＳＦ凝胶相比ꎬＡＳＦ冻干样品在酰胺Ⅰ区的吸收带略往低波数方向移动(更接近于脱胶柞蚕丝)ꎮ２.２㊀乙醇水溶液浓度对ＡＳＦ凝胶及其冻干样品二级结构的影响根据本研究中ＦＴＩＲ测试结果并结合文献[２３￣２５]ꎬ一方面ꎬ在ＡＳＦ水溶液中加入乙醇会使乙醇分子更多地与水分子结合ꎬ破坏水分子与丝素蛋白分子的结合ꎬ从而使得丝素蛋白分子之间的相互作用增强ꎬ导致丝素蛋白分子间形成更多的氢键ꎬ生成更多β￣折叠构象ꎮ另一方面ꎬＡＳＦ富含聚丙氨酸序列ꎬ该序列表现出很强的疏水性ꎮ而乙醇分子中的乙基与ＡＳＦ中丙氨酸链段的结构较为相似ꎬ推测能与其相似相溶ꎬ故在ＡＳＦ水溶液中加入乙醇后ꎬ丝素蛋白的疏水基团与乙醇分子的相互作用逐渐增强ꎬ削弱了丝素蛋白分子在疏水区域之间的相互作用ꎬ促进了这些疏水链段的活动ꎬ从而导致丝素蛋白从高能量的无规线团/α￣螺旋构象转变为低能量的β￣折叠构象ꎮ当β￣折叠构象的含量增加到某个临界值时ꎬＡＳＦ水溶液中就出现了不溶物ꎬ随着不溶物尺寸和数目不断增多ꎬ体系的流动性逐渐变差ꎬ最终形成凝胶ꎮ研究表明ꎬ在正常情况下ＡＳＦ凝胶过程十分缓慢ꎬ将低质量分数(如４％或２％)的ＡＳＦ水溶液置于４ħ的温度下ꎬ经过两周仍无凝胶现象产生ꎮ而在与一定量的乙醇作用后ꎬ即有部分丝素蛋白变性成白色絮状物ꎬ这些白色絮状丝素蛋白就是前述的不溶物ꎮ当水溶液中ＡＳＦ含量一定时ꎬ随着乙醇浓度的提高ꎬ溶液中出现的白色絮状物增多ꎬ凝胶过程也大幅加速ꎮ当乙醇浓度仅为７０％时ꎬ体系完全形成凝胶的时间需２０ｈ以上ꎻ当乙醇浓度上升至８０％及９０％时ꎬ溶液中出现白色絮状物的速度加快ꎬ且凝胶时间分别缩短至７ｈ和５ｈꎻ而当乙醇浓度达到１００％时ꎬ溶液中很快出现白色絮状物ꎬ凝胶时间仅需３ｈꎮ图２反映了乙醇水溶液浓度对ＡＳＦ凝胶及其冻干样品二级结构的影响ꎮ在不同乙醇浓度下ꎬＡＳＦ凝胶中β￣折叠构象含量均比其进一步冷冻干燥后的样品低ꎬ这再次佐证了上一节的相关结论ꎮ从图２中ａ曲线还可以看出ꎬ乙醇浓度的增加能使ＡＳＦ凝胶中β￣折叠构象的含量增多ꎮ这是因为溶液中乙醇浓度越高ꎬ有越多的乙醇分子会与水分子结合ꎬ从而破坏水分子与丝素蛋白分子结合ꎬ导致丝素蛋白分子之间的相互作用增强ꎬ这种情况下形成β￣折叠构象的速度更快ꎬ凝胶中β￣折叠构象的含量相对更多ꎮ此外ꎬ乙醇浓度越高意味着有更多的乙醇分子会与丝素蛋白的疏水基团发生相互作用ꎬ使得疏水链段图２㊀乙醇水溶液浓度对ＡＳＦ凝胶及其进一步冻干后样品的二级结构的影响Ｆｉｇ.２㊀ＥｆｆｅｃｔｏｆｅｔｈａｎｏｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｎｔｈｅｓｅｃｏｎｄａｒｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＡＳＦｇｅｌａｎｄｆｒｅｅｚｅ￣ｄｒｉｅｄＡＳＦｓａｍｐｌｅｓ的活动能力加快ꎬ从而导致更多的无规线团/α￣螺旋构象转变为β￣折叠构象ꎮ从图２中ｂ曲线进一步可以看出ꎬＡＳＦ凝胶冷冻干燥后的样品也有类似的结果ꎬ当乙醇水溶液浓度从７０％上升至１００％时ꎬＡＳＦ冻干样品中β￣折叠构象的含量从２９.６％增加至３６ ５％ꎮ由此可见ꎬ提高乙醇诱导过程中采用的乙醇水溶液浓度ꎬ将促进冷冻干燥法ＡＳＦ材料中β￣折叠构象的形成ꎮ２.３㊀ＡＳＦ初始质量分数对ＡＳＦ凝胶及其冻干样品二级结构的影响图３反映了ＡＳＦ初始质量分数对ＡＳＦ凝胶及其进一步冻干后样品二级结构的影响ꎬ可以发现ꎬ当ＡＳＦ初始质量分数从４％上升至１０％时ꎬＡＳＦ凝胶中的β￣折叠构象含量(图３(ａ))从２６.５％提高到３３ ０％ꎬ而α￣螺旋/无规线团构象含量则从５４.７％降至４３.９％ꎬ这说明ＡＳＦ初始质量分数的增加有利于凝胶中β￣折叠构象的形成ꎮＡＳＦ初始质量分数越高ꎬ越能减少丝素蛋白分子与水分子结合的几率ꎬ使得丝素蛋白分子链相互碰撞的机会更大ꎬ丝素蛋白分图３㊀ＡＳＦ初始质量分数对ＡＳＦ凝胶及其进一步冻干后样品二级结构的影响Ｆｉｇ.３㊀ＥｆｆｅｃｔｏｆｏｒｉｇｉｎａｌＡＳＦｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｎｔｈｅｓｅｃｏｎｄａｒｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＡＳＦｇｅｌａｎｄｆｒｅｅｚｅ￣ｄｒｉｅｄＡＳＦｓａｍｐｌｅｓ子之间的相互作用也更强ꎮ随着丝素蛋白分子间相互作用的增强ꎬＡＳＦ水溶液成胶的过程中形成β￣折叠构象的速度将变快ꎬ从而导致β￣折叠构象的含量更多ꎮＡＳＦ初始质量分数对ＡＳＦ凝胶进一步冻干后样品二级结构的影响也有类似的结果(图３(ｂ))ꎬ当ＡＳＦ初始质量分数从４％上升至１０％时ꎬＡＳＦ冻干样品中β￣折叠构象的含量随之从３６.５％提高至４６ １％ꎬ而α￣螺旋/无规线团构象的含量则从４２.０％降至３３.５％ꎮ由此可见ꎬＡＳＦ水溶液质量分数的适当提高ꎬ有利于冷冻干燥法ＡＳＦ材料中丝素蛋白构象向β￣折叠构象转变ꎮ２.４㊀ＡＳＦ初始质量分数与乙醇水溶液浓度对ＡＳＦ冻干样品微观结构的影响由前述可知ꎬＡＳＦ凝胶中β￣折叠构象含量已明显高于ＡＳＦ水溶液ꎬ但仍不占主导地位ꎬ这导致凝胶结构不是非常稳定ꎮ因此ꎬ在对ＡＳＦ样品进行形态结构分析时ꎬ主要采用由凝胶进一步冷冻干燥处理后的样品ꎮ图４为由不同初始质量分数的ＡＳＦ水溶图４㊀由不同质量分数的ＡＳＦ水溶液制得的ＡＳＦ冻干样品横截面的ＳＥＭ照片及对应的孔径分布Ｆｉｇ.４㊀ＳＥＭｉｍａｇｅｓａｎｄｐｏｒｅｓｉｚｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｈｉｓｔｏｇｒａｍｓｏｆｆｒｅｅｚｅ￣ｄｒｉｅｄＡＳＦｓａｍｐｌｅｓｐｒｅｐａｒｅｄｆｒｏｍＡＳＦａｑｕｅｏｕｓｓｏｌｕｔｉｏｎｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ液制得的ＡＳＦ冻干样品横截面的ＳＥＭ照及对应的孔径分布结果ꎬ从中可以看出ꎬＡＳＦ水溶液初始质量分数为４％时ꎬ样品截面中空隙形态大体呈无规则(故无法分析其孔径分布ꎬ图４(ａ)中无所对应的孔径分布图)ꎬ这可能是由于ＡＳＦ质量分数较低使得材料强度不高ꎬ导致制样及测试中材料形态易被破坏ꎮ而当溶液中ＡＳＦ含量逐渐增大时ꎬ样品截面的形态也变得更有规则ꎬ逐渐呈现孔状结构ꎮ从图４(ｂ~ｄ)右侧所对应的各样品孔径分析结果可以进一步发现ꎬＡＳＦ水溶液的初始质量分数从６％上升至１０％时ꎬ样品的平均孔径从３０.４μｍ减小至１８.８μｍꎮ这可能是因为溶液中ＡＳＦ含量较高时ꎬ冷冻过程中ＡＳＦ分子对水分子运动的阻力较大ꎬ不利于形成大的冰晶ꎬ故所制得的ＡＳＦ多孔材料的孔径相对较小ꎮ图５进一步给出了采用不同浓度的乙醇水溶液诱导制得的ＡＳＦ冻干样品横截面的ＳＥＭ照片ꎮ由图图５㊀由不同浓度的乙醇水溶液诱导制得的ＡＳＦ冻干样品横截面的ＳＥＭ照片及对应的孔径分布Ｆｉｇ.５㊀ＳＥＭｉｍａｇｅｓａｎｄｐｏｒｅｓｉｚｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｈｉｓｔｏｇｒａｍｓｏｆｆｒｅｅｚｅ￣ｄｒｉｅｄＡＳＦｓａｍｐｌｅｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙｅｔｈａｎｏｌａｑｕｅｏｕｓｓｏｌｕｔｉｏｎｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ５可知ꎬ随乙醇水溶液浓度的增加ꎬＡＳＦ样品的平均孔径呈一定的上升趋势ꎮ由文献[２６￣２７]可知ꎬ孔径在１０~２０μｍ的微小孔洞能基本满足细胞黏附及生长因子㊁营养物质通过的要求ꎬ孔径介于２０~１００μｍ的多孔材料在动物表皮细胞培养及载入生长因子方面具有一定的应用前景[２８]ꎬ而更大孔洞则有利于细胞生长[２９]ꎮ因此ꎬ为了验证所制备的ＡＳＦ多孔材料能否满足细胞黏附㊁生长的需求ꎬ本研究进一步考察了其生物相容性ꎮ２.５㊀再生柞蚕丝素蛋白多孔材料的生物相容性评价选择ＡＳＦ质量分数为６％㊁纯乙醇诱导作为优选条件来制备多孔材料ꎮ细胞在材料上的生长数目和形态可直观体现生物相容性ꎮ图６显示了ＳＣｓ在ＡＳＦ多孔材料和盖玻片材料上接种４ｄ后的激光扫描共聚焦显微镜图(采用鬼笔环肽和ＤＡＰＩ分别对细胞的骨架和细胞核进行染色)ꎮ从图６中可以看出ꎬＡＳＦ多孔材料和盖玻片上的细胞生长形态很多是圆形ꎬ部分细胞出现了伪足ꎮ并且ꎬ相比于盖玻片ꎬＳＣｓ在ＡＳＦ多孔材料上生长得更为密集ꎬ细胞数目和伪足更多ꎬ这说明ＡＳＦ多孔材料比盖玻片更能促进细胞的黏附和生长ꎮ因此ꎬ本研究所制备的ＡＳＦ多孔材料可作为组织工程支架应用在生物医疗领域ꎬ并具有较大的潜在价值ꎮ图６㊀ＳＣｓ接种４ｄ的激光扫描共聚焦显微镜图Ｆｉｇ.６㊀ＬａｓｅｒＳｃａｎｎｉｎｇＣｏｎｆｏｃａｌＭｉｃｒｏｓｃｏｐｅｉｍａｇｅｓｏｆＳＣｓｓｅｅｄｅｄｆｏｒ４ｄａｙｓ３㊀结㊀论本研究以柞蚕丝为原料ꎬ采用乙醇促使ＡＳＦ水溶液快速凝胶并进一步冷冻干燥的方法ꎬ制备了ＡＳＦ多孔材料ꎬ得到以下结论:１)乙醇能诱导ＡＳＦ水溶液形成凝胶ꎬ且形成凝胶的过程中伴随有大量β￣折叠构象的产生ꎮ２)随乙醇水溶液浓度的升高及ＡＳＦ水溶液初始质量分数的增加ꎬ凝胶中β￣折叠含量也相应上升ꎮ３)提高乙醇水溶液浓度或适当降低ＡＳＦ水溶液初始质量分数ꎬ有利于获得孔径较大的冷冻干燥法ＡＳＦ多孔材料ꎮ４)细胞实验结果表明ꎬ本研究所制备的ＡＳＦ多孔材料可作为组织工程支架应用在生物医用领域ꎬ并具有较大的潜在价值ꎮ参考文献:[１]陶伟.再生柞蚕丝素多孔材料的制备及其结构[Ｄ].苏州:苏州大学ꎬ２００５.ＴＡＯＷｅｉ.ＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄＳｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＲｅｇｅｎｅｒａｔｅｄＡｎｔｈｅｒａｅａＰｅｒｎｙｉＳｉｌｋＦｉｂｒｏｉｎＰｏｒｏｕｓＭａｔｅｒｉａｌｓ[Ｄ].Ｓｕｚｈｏｕ:ＳｏｏｃｈｏｗＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ２００５.[２]李娟.柞蚕丝素蛋白的自组装及其在药物缓释上的应用[Ｄ].上海:东华大学ꎬ２０１２.ＬＩＪｕａｎ.Ｓｅｌｆ￣ＡｓｓｅｍｂｌｙＢｅｈａｖｉｏｒｏｆＴｕｓｓａｈＳｉｌｋＦｉｂｒｏｉｎａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎＤｒｕｇＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄＲｅｌｅａｓｅ[Ｄ].Ｓｈａｎｇｈａｉ:ＤｏｎｇｈｕａＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ２０１２.[３]赵春山ꎬ李喜升.柞蚕的经济与生态作用的再认识[Ｊ].辽宁农业科学ꎬ２００４(３):２８￣２９.ＺＨＡＯＣｈｕｎｓｈａｎꎬＬＩＸｉｓｈｅｎｇ.Ｒｅｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｏｆｅｃｏｎｏｍｉｃａｎｄｅｃｏｌｏｇｉｃａｌｅｆｆｅｃｔｆｏｒｔｈｅｔｕｓｓａｈ[Ｊ].ＬｉａｏｎｉｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓꎬ２００４(３):２８￣２９.[４]ＭＩＮＯＵＲＡＮꎬＡＩＢＡＳꎬＧＯＴＯＨＹꎬｅｔａｌ.Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔａｎｄｇｒｏｗｔｈｏｆｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｃｅｌｌｓｏｎｓｉｌｋｆｉｂｒｏｉｎ[Ｊ].ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓꎬ１９９５ꎬ２０８(２):５１１￣５１６.[５]莫春丽.傅立叶变化红外光谱对再生丝蛋白二级结构的表征[Ｄ].上海:复旦大学ꎬ２００９.ＭＯＣｈｕｎｌｉ.ＦｏｕｒｉｅｒＩｎｆｒａｒｅｄＳｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｎｔｈｅＳｅｃｏｎｄａｒｙＳｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＳｉｌｋＦｉｂｒｏｉｎ[Ｄ].Ｓｈａｎｇｈａｉ:ＦｕｄａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ２００９.[６]ＹＡＮＧＹＨꎬＳＨＡＯＺＺꎬＣＨＥＮＸ.ＯｐｔｉｃａｌｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄＢｏｍｂｙｘｍｏｒｉｓｉｌｋｆｉｂｒｏｉｎｉｎｓｏｌｕｔｉｏｎ[Ｊ].Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓꎬ２００４ꎬ５(３):７７３￣７７９.[７]成蓥栋.再生家蚕丝素蛋白结构转变的研究[Ｄ].苏州:苏州大学ꎬ２００８.ＣＨＥＮＹｉｎｇｄｏｎｇ.ＲｅｓｅａｒｃｈｏｎｔｈｅＳｔｒｕｃｔｕｒａｌＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆＲｅｇｅｎｅｒａｔｅｄＢｏｍｂｙｘｍｏｒｉＳｉｌｋＦｉｂｒｏｉｎ[Ｄ].Ｓｕｚｈｏｕ:ＳｏｏｃｈｏｗＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ２００８.[８]卢雁ꎬ张玮玮ꎬ王公轲.ＦＴＩＲ用于变性蛋白质二级结构的研究进展[Ｊ].光谱学与光谱分析ꎬ２００８ꎬ２８(１):８８￣９３.ＬＵＹａｎꎬＺＨＡＮＧＷｅｉｗｅｉꎬＷＡＮＧＧｏｎｇｋｅ.ＰｒｏｇｒｅｓｓｉｎｓｔｕｄｙｏｆｓｅｃｏｎｄａｒｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｄｅｎａｔｕｒｉｚｅｄｐｒｏｔｅｉｎｂｙＦＴＩＲ[Ｊ].ＳｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙａｎｄＳｐｅｃｔｒａｌＡｎａｌｙｓｉｓꎬ２００８ꎬ２８(１):８８￣９３.[９]ＷＵＸꎬＷＵＸＤꎬＳＨＡＯＭ.ＳｔｒｕｃｔｕｒａｌｃｈａｎｇｅｓｏｆＢｏｍｂｙｘｍｏｒｉｆｉｂｒｏｉｎｆｒｏｍｓｉｌｋｇｌａｎｄｔｏｆｉｂｅｒａｓｅｖｉｄｅｎｃｅｄｂｙＴｅｒａｈｅｒｔｚｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙａｎｄｏｔｈｅｒｍｅｔｈｏｄｓ[Ｊ].ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓꎬ２０１７ꎬ１０２:１２０２￣１２１０.[１０]ＶＡＮｄｅＷｅｅｒｔＭꎬＨＡＲＩＳＰＩꎬＨＥＮＮＩＮＫＷＥꎬｅｔａｌ.Ｆｏｕｒｉｅｒｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｆｒａｒｅｄｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆｐｒｏｔｅｉｎｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ:Ｅｆｆｅｃｔｏｆｓａｍｐｌｉｎｇｍｅｔｈｏｄａｎｄｓｔｒｅｓｓｆａｃｔｏｒｓ[Ｊ].ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙꎬ２００１ꎬ２９７(２):１６０￣１６９.[１１]刘明.ＦＴＩＲ对丝素蛋白构象的研究[Ｄ].杭州:浙江大学ꎬ２００６.ＬＩＵＭｉｎｇ.ＳｔｕｄｉｅｓｏｎｔｈｅＣｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆＳｉｌｋＦｉｂｒｏｉｎｂｙＦＴＩＲ[Ｄ].Ｈａｎｇｚｈｏｕ:ＺｈｅｊｉａｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ２００６.[１２]刘强强.周围神经修复用搭载双因子静电纺有序丝素蛋白支架的研究[Ｄ].上海:东华大学ꎬ２０１６.ＬＩＵＱｉａｎｇｑｉａｎｇ.ＳｉｌｋＦｉｂｒｏｉｎＳｃａｆｆｏｌｄｓｗｉｔｈＷｅｌｌ￣ＡｌｉｇｎｅｄＦｉｂｅｒｓＬｏａｄｅｄｗｉｔｈＤｕａｌＦａｃｔｏｒｓｆｏｒＰｅｒｉｐｈｅｒａｌＮｅｒｖｅＲｅｐａｉｒ[Ｄ].Ｓｈａｎｇｈａｉ:ＤｏｎｇｈｕａＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ２０１６.[１３]杭怡春.再生丝素/丝胶蛋白水溶液的经典纺丝和干法纺丝研究[Ｄ].上海:东华大学ꎬ２０１２.ＨＡＮＧＹｉｃｈｕｎ.ＳｔｕｄｉｅｓｏｎｔｈｅＥｌｅｃｔｒｏｓｐｉｎｎｉｎｇａｎｄＤｒｙＳｐｉｎｎｉｎｇｏｆｔｈｅＲｅｇｅｎｅｒａｔｅｄＳｉｌｋＦｉｂｒｏｉｎ/ＳｅｒｉｃｉｎＡｑｕｅｏｕｓＳｏｌｕｔｉｏｎｓ[Ｄ].Ｓｈａｎｇｈａｉ:ＤｏｎｇｈｕａＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ２０１２.[１４]ＨＡＲＤＹＪＧꎬＲＯＥＭＥＲＬＭꎬＳＣＨＥＩＢＥＬＴＲ.Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃｍａｔｅｒｉａｌｓｂａｓｅｄｏｎｓｉｌｋｐｒｏｔｅｉｎｓ[Ｊ].Ｐｏｌｙｍｅｒꎬ２００８ꎬ４９(２０):４３０９￣４３２７.[１５]ＨＵＸꎬＫＡＰＬＡＮＤꎬＣＥＢＥＰ.Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｂｅｔａ￣ｓｈｅｅｔｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｉｔｙｉｎｆｉｂｒｏｕｓｐｒｏｔｅｉｎｓｂｙｔｈｅｒｍａｌａｎａｌｙｓｉｓａｎｄｉｎｆｒａｒｅｄｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ[Ｊ].Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ.２００６ꎬ３９:６１６１￣６１７０.[１６]ＺＨＡＮＧＣꎬＺＨＡＮＧＹＰꎬＳＨＡＯＨＬꎬｅｔａｌ.Ｈｙｂｒｉｄｓｉｌｋｆｉｂｅｒｓｄｒｙ￣ｓｐｕｎｆｒｏｍｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄｓｉｌｋｆｉｂｒｏｉｎ/ｇｒａｐｈｅｎｅｏｘｉｄｅａｑｕｅｏｕｓｓｏｌｕｔｉｏｎｓ[Ｊ].ＡＣＳＡｐｐｌｉｅｄＭａｔｅｒｉａｌｓ＆Ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓꎬ２０１６ꎬ８(５):３３４９￣３３５８.[１７]ＰＡＱＵＥＴＭＦꎬＬＥＦＥＶＲＥＴꎬＡＵＧＥＲＭꎬｅｔａｌ.Ｅｖｉｄｅｎｃｅｂｙｉｎｆｒａｒｅｄｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙｏｆｔｈｅｐｒｅｓｅｎｃｅｏｆｔｗｏｔｙｐｅｓｏｆｂｅｔａ￣ｓｈｅｅｔｓｉｎｍａｊｏｒａｍｐｕｌｌａｔｅｓｐｉｄｅｒｓｉｌｋａｎｄｓｉｌｋｗｏｒｍｓｉｌｋ[Ｊ].ＳｏｆｔＭａｔｔｅｒꎬ２０１３ꎬ９(１):２０８￣２１５.[１８]ＭＥＮＧＧＴꎬＭＡＣＹ.Ｆｏｕｒｉｅｒ￣ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｆｒａｒｅｄｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃｓｔｕｄｙｏｆｇｌｏｂｕｌｉｎｆｒｏｍｐｈａｓｅｏｌｕｓａｎｇｕｌａｒｉｓ(ｒｅｄｂｅａｎ)[Ｊ].ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓꎬ２００１(２９):２８７￣９４.[１９]ＣＯＲＭＩＥＲＡＲꎬＲＵＩＺＯＣꎬＡｌａｍｏＲＧꎬｅｔａｌ.ＳｏｌｉｄＳｔａｔｅＳｅｌｆ￣ＡｓｓｅｍｂｌｙＭｅｃｈａｎｉｓｍｏｆＲＡＤＡ１６￣ＩＤｅｓｉｇｎｅｒＰｅｐｔｉｄｅ[Ｊ].Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓꎬ２０１２ꎬ１３(６):１７９４￣１８０４.[２０]刘明ꎬ闵思佳ꎬ朱良均.冷冻干燥对丝素蛋白凝胶结构的影响[Ｊ].蚕业科学ꎬ２００７ꎬ３３(２):２４６￣２４９.ＬＩＵＭｉｎｇꎬＭＩＮＳｉｊｉａꎬＺＨＵＬｉａｎｇｊｕｎ.Ｅｆｆｅｃｔｏｆｆｒｅｅｚｅ￣ｄｒｙｏｎｔｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｓｉｌｋｆｉｂｒｏｉｎｇｅｌ[Ｊ].ＳｃｉｅｎｃｅｏｆＳｅｒｉｃｕｌｔｕｒｅꎬ２００７ꎬ３３(２):２４６￣２４９.[２１]ＤＯＮＧＡꎬＰＲＥＳＴＲＥＬＫＩＳＪꎬＡＬＬＩＳＯＮＳＤꎬｅｔａｌ.Ｉｎｆｒａｒｅｄｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃｓｔｕｄｉｅｓｏｆｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ￣ａｎｄｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ￣ｉｎｄｕｃｅｄｐｒｏｔｅｉｎａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓꎬ１９９５ꎬ８４(４):４１５￣４２４.[２２]ＬＵＣＩＭＡＲＡＡＦꎬＲＵＢＥＮＳＢＦꎬＬＵＩＺＡＣ.ＰｒｏｔｅｉｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅｉｎＫＢｒｐｅｌｌｅｔｓｂｙｉｎｆｒａｒｅｄｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ[Ｊ].ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙꎬ１９９８ꎬ２５９(１):１３６￣１４１.[２３]金媛.蚕丝的仿生纺丝研究[Ｄ].上海:东华大学ꎬ２０１３.ＪＩＮＹｕａｎ.ＳｔｕｄｉｅｓｏｎＢｉｏｍｉｍｅｔｉｃＳｐｉｎｎｉｎｇｏｆＳｉｌｋｗｏｒｍＳｉｌｋ[Ｄ].Ｓｈａｎｇｈａｉ:ＤｏｎｇｈｕａＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ２０１３.[２４]杨宇红.再生Ｂｏｍｂｙｘｍｏｒｉ丝素蛋白在水溶液中结构和性质的研究[Ｄ].上海:复旦大学ꎬ２００４.ＹＡＮＧＹｕｈｏｎｇ.ＩｎｖｅｒｓｔｉｇａｔｉｏｎｏｎＳｔｒｕｃｔｕｒｅｓａｎｄＰｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆＲｅｇｅｎｅｒａｔｅｄＢｏｍｂｙｘｍｏｒｉＳｉｌｋＦｉｂｒｏｉｎｉｎＡｑｕｅｏｕｓＳｏｌｕｔｉｏｎ[Ｄ].Ｓｈａｎｇｈａｉ:ＦｕｄａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ２００４.[２５]余晶梅.荧光探针法和疏水相互作用层析法分析蛋白表面疏水性[Ｄ].杭州:浙江大学ꎬ２０１４.ＹＵＪｉｎｇｍｅｉ.ＭｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｏｆＰｒｏｔｅｉｎＳｕｒｆａｃｅＨｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙｂｙＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＰｒｏｂｅＭｅｔｈｏｄａｎｄＨｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃＩｎｔｅｒａｃｔｉｏｎＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ[Ｄ].Ｈａｎｇｚｈｏｕ:ＺｈｅｊｉａｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ２０１４.[２６]丁珊ꎬ李立华.新型组织工程支架材料[Ｊ].生物医学工程学杂志.２００２ꎬ１９(１):１２２￣１２６.ＤＩＮＧＳｈａｎꎬＬＩＬｉｈｕａ.Ｎｏｖｅｌｓｃａｆｆｏｌｄｍａｔｅｒｉａｌｓｆｏｒｔｉｓｓｕｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇꎬ２００２ꎬ１９(１):１２２￣１２６.[２７]张润ꎬ邓政兴ꎬ李立华ꎬ等.用超临界ＣＯ２法制备聚乳酸三维多孔支架材料[Ｊ].材料研究学报ꎬ２００３ꎬ１７(６):６６５￣６７２.ＺＨＡＮＧＲｕｎꎬＤＥＮＧＺｈｅｎｇｘｉｎｇꎬＬＩＬｉｈｕａꎬｅｔａｌ.ＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆｐｏｒｏｕｓＰＬＡｓｃａｆｆｏｌｄｍａｔｅｒｉａｌｓｂｙｓｕｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌＣＯ２ｆｌｕｉｄｔｅｃｈｎｉｑｕｅ[Ｊ].ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＭａｔｅｒｉａｌｓＲｅｓｅａｒｃｈꎬ２００３ꎬ１７(６):６６５￣６７２.[２８]刘倩倩ꎬ唐川ꎬ杜哲ꎬ等.超临界ＣＯ２发泡法制备ＰＬＧＡ多孔组织工程支架[Ｊ].高分子学报ꎬ２０１３(２):１７４￣１８２.ＬＩＵＱｉａｎｑｉａｎꎬＴＡＮＧＣｈｕａｎꎬＤＵＺｈｅꎬｅｔａｌ.Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎｏｆｐｏｒｏｕｓｐｏｌｙ(ｌａｃｔｉｃａｃｉｄ￣ｃｏ￣ｇｌｙｃｏｌｉｃａｃｉｄ)ｓｃａｆｆｏｌｄｓｕｓｉｎｇｓｕｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌｃａｒｂｏｎｄｉｏｘｉｄｅ[Ｊ].ＡｃｔａＰｏｌｙｍｅｒｉｃａＳｉｎｉｃａꎬ２０１３(２):１７４￣１８２.[２９]ＣＨＡＮＧＢＳꎬＬＥＥＣＫꎬＨＯＮＧＫＳ.Ｏｓｔｅｏｃｏｎｄｕｃｔｉｏｎａｔｐｏｒｏｕｓｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅｗｉｔｈｖａｒｉｏｕｓｐｏｒｅｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎｓ[Ｊ].Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓꎬ２０００ꎬ２１(１２):１２９１￣１２９８.。