2020年诺贝尔奖绿色荧光蛋白(精选干货)
绿色荧光蛋白的基因克隆及表达
绿色荧光蛋白的基因克隆和表达研究（湖北师范学院生命科学学院生物科学0802班湖北黄石435002）摘要：目的：研究绿色荧光蛋白（Greed Fluorescent Protein，GFP）基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达。
方法：通过分别将DH-5α (pEGFP-N3)和DH-5α(pET-28a)提取质粒、酶切并连接形成重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入E.coli DH-5α感受态细胞中进行转化,通过限制性核酸内切酶Not I与Bam H1和PCR对所建质粒进行分析鉴定后, 通过转化的方法把含绿色荧光蛋白（GFP）外源基因转入大肠杆菌体BL-21内进行表达，再用IPTG 诱导GFP基因表达，可以看到显现绿色，判断GFP基因在大肠杆菌中成功表达。
结果：结果显示构建的重组质粒pET-28a-GFP在E.coli中成功表达。
关键词：绿色荧光蛋白；质粒重组；原核表达；诱导表达中图分类号：Q53Studies On Cloning and Expression of Green FluorescentProtein geneAbstract: Objective:Studies indicated that the cloning and expression of the GFP gene in the E.coli. Methods:Extract the plasmid of the DH-5α(pEGFP-N3) and DH-5α(pET-28a). Then cutting by enzyme and connecting the two plasmids to form pET-28a-GFP recombined plasmid. The recombinant plasmid confirmed by restriction enzyme and PCR transfected into E.coli DH-5α to ensure the expression of green fluorescent protein. Guiding the recombined plasmid, which contains exogenous genes of GFP into E.coli for expression, through transformative method. The expression of GFP gene can be induced by the IPTG and then we can see green. Results: The results suggest that pET-28a-GFP recombined plasmid has successfully expressed in E.coli. Keywords: G ed Fluorescent Protein; Recombined Plasmid; Prokaryote Expression; Induced Expression绿色荧光蛋白的基因克隆和表达的研究引言随着分子生物学和基因工程技术的迅速发展和广泛应用, 人们根据自己的意愿有目的、有计划、有根据、有预见地将外源基因导入动物细胞内, 使外源基因进行表达、阐明基因表达的调控机理或者通过与染色体基因组进行稳定整合，将生物性状传递给子代动物的研究方兴未艾[1]。
荧光蛋白
Martin Chalfie
马丁-查尔菲展示了 绿色荧光蛋白作为 各种生物现象的亮 光基因标签的价值。
Roger Y Tsien
钱永健的巨大贡献在 于，他使科学从红到 蓝的颜色，并开发了 很多使用工具，这使 得绿色荧光蛋白技术 的应用非常简单。
相对分子质量小，对细胞无毒性 检测方便，可直接用于活体测定（只需紫外光或蓝光激发，即可
发出绿色荧光） 无种属特异性，也没有细胞种类和位置的限制 不受假阳性干扰，灵敏度高（由于其他生物本身不含有GFP，因
此不会出现假阳性结果）
GFP的改进
Heim等(1995)采用定点突变的方式，把 第65位丝氨酸换成苏氨酸或胱氨酸，荧 光强度提高了4～6倍。后来的研究中用 到的GFP突变体都是在此基础上通过改变 若干碱基而得到的。
一 GFP的研究历史
1962年，下村修和约翰森等在《细胞和比较生理学杂志》 上报道，他们分离纯化了水母（Aequorea victoria）中发 光蛋白水母素。
1963年，下村修和约翰森在《科学》杂志报道钙和水母 素发光的关系。
Ridgway和Ashley 提出可以用水母素来检测钙浓度，创 造了检测钙的新方法。钙离子是生物体内的重要信号分 子，水母素成为第一个有空间分辨能力的钙检测方法， 是目前仍用的方法之一。
1974年，下村修和约翰森纯化了绿色蛋 白，即以后的绿色荧光蛋白GFP。
Morin和Hastings提出水母素和GFP之间可 以发生能量转移。水母素在钙刺激下发 光，其能量可转移到GFP，刺激GFP发光。 这是物理化学中知道的荧光共振能量转 移(FRET)在生物中的发现。
1985年普腊石和日裔科学家Satoshi Inouye独立 根据蛋白质顺序拿到了水母素的基因（准确地 说是cDNA）。1992年，普腊石拿到了GFP的 基因。
2009新题：“绿色荧光蛋白”相关(含详解)00
2009新题：“绿色荧光蛋白”相关（含详解）2008年度诺贝尔化学奖授予美国华裔化学家钱永健等三位科学家，以表彰他们在发现和研究绿色荧光蛋白(GFP)所做出的贡献。
GFP首次在水母中被发现，它是由水母中的GFP基因表达一种能在紫外线照射下发出绿色荧光的蛋白质，即绿色荧光蛋白。
GFP可做为生物示踪分子，同时为追踪多种生物细胞变化的研究奠定了基础。
回答以下问题：（Ⅰ）1．GFP的合成是在相关基因的控制下完成的，它包括在细胞核中进行的和在中进行的两个过程组成。
2. GFP是由238个氨基酸组成。
科学家发现将第65位丝氨酸换为苏氨酸(S65T)或半胱氨酸(S65C)，荧光强度将提高4倍。
荧光强度的改变，其变异的来源是。
3. GFP发出的荧光稳定，检测方便而且对细胞也不会产生明显毒害，因此在基因工程中可以作为，用以追踪多种生物细胞的迁移和变化情况。
（Ⅱ）下面是某科学家用GFP做的相关实验，根据所学知识补充实验过程，并分析回答相关问题。
课题：研究GFP标记的大鼠神经干细胞移植于损伤脊髓后的迁移情况目的：观察神经干细胞移植于损伤脊髓后的迁移方法：（1）构建含GFP基因的慢病毒载体。
（2）体外培养胎鼠脊髓神经干细胞：取孕14～16天Wistar大鼠，在条件下取胎鼠脊髓，解剖显微镜下剔除表面软膜和血管，剪碎，再用进行处理，制成神经干细胞悬浮液，200目铜网过滤，离心，加干细胞培养液，其他条件适宜，进行培养，2－3天换培养液。
（3）用浸染神经干细胞，将已浸染的神经干细胞以乙交酯一丙交酯共聚物(PLGA)为支架移植入大鼠T9半横断脊髓损伤处。
（4）移植后1个月在荧光显微镜下。
结果：荧光显微镜下，神经干细胞球及散在的神经干细胞呈强烈的绿色荧光，各个部位深浅不一。
神经干细胞的迁移移植后1个月，在脊髓损伤的头端和尾端可见发绿色荧光的神经干细胞。
结论：。
分析与讨论：（1）在构建含GFP基因的慢病毒载体过程，需要用到的工具酶有和。
2019-2020学年生物技术专业《蛋白质与酶工程》第8章 荧光蛋白工程
HaloTag protein
Halo-tag™蛋白是分子量为33kDa的蛋白标签，
由微生物紫红红球菌（Rhodococcus rhodochrous）
的脱卤素酶（dehalogenase）演化而来。该酶可通过 置换其酶活性中心的His，把卤代烷烃（haloalkanes） 中的卤素取代基去除，从而令烷基残基可以有效地 以共价键形式结合于蛋白上。Halo-tag™可以在原核
3 用于研究蛋白与DNA之间的相互作用 HaloLink树脂是一种固相支持物，可使HaloTagTM
融合蛋白直接粘附于Sepharose表面，可以被用来沉淀 Halo-tagTM融合蛋白——DNA交联复合物。使用这种 方法就不再需要像传统的染色质免疫共沉淀试验 （ChIP）那样使用抗体了。
4 研究蛋白质转运机制 使用不同的荧光标记配体可以在活体细胞内不同
荧光猪
荧光鼠
Chapter 8 荧光蛋白工程
Fluorescence Protein Engineering
唐王刚
生物化学与分子生物学
教学目的与要求
【教学时数】
2.5 学时
【掌握】掌握GFP的优点与发光过程、RFP的优势与发光过程、
HaloTag技术的原理等。
【熟悉】三位因发现和研究GFP获诺贝尔奖的科学家的贡献、
2 生物荧光技术 主要是通过荧光测定仪测定荧光素酶(fluciferase)催
化荧光素氧化过程中所释放的生物荧光。这种技术通 过测定荧光素酶活性的高低来就可以判断刺激前后或 不同刺激对感兴趣的调控元件的影响。由于生物荧光 不需要激发光就可以将化学光转换为生物光，因此没 有本底影响，相关线性程度高，所以特别适合于药物 筛选。
为了克服野生型GFP的缺陷，1955年钱永键构建 S65T点突变，提高了GFP的光谱性质，增强了荧光强 度和稳定性。突变体的激发峰转移至488 nm，而发射 峰仍保持在5505 nm。F64L点突变可改善GFP在37 ℃ 的折叠能力。两者结合(S65T/F64L)即得到EGFP。目 前世界上应用的荧光蛋白，多半是他发明的变种。
荧光蛋白发光综述
荧光蛋白及其发光原理介绍Xxx（xxxx xxxx xxx xxxxx）摘要本文介绍了荧光蛋白的来源，基本结构和发光机理，并通过与电子行业中广泛应用的无机固体发光材料进行比较，提出荧光蛋白可行的应用前景。
关键词：荧光蛋白，生色团，发光原理，应用前景1 引言自然界有许多生物能够发光。
多数生物发光过程是通过小分子有机化合物荧光素和荧光素酶的化学反应释放出光能。
然而有一类荧光物质不仅能在化学能激发下发出荧光，还能被光激发---荧光蛋白。
荧光蛋白种类很多，其中最有应用价值的是在最早在多管水母中提取的绿色荧光蛋白]1[。
绿色荧光蛋白化学性质稳定，分子量约27000，为238个氨基酸残基组成的单链结构。
在溶液中可形成二聚体或四聚体桶状晶体。
其荧光发射峰在509nm , 最大激发波长为395 nm , 并在470 nm 处有一肩峰。
由绿色荧光蛋白为蓝本通过基因技术合成的突变体发射光谱在整个可见光波段，因此在生物荧光标记方面得到广泛的应用，2008年诺贝尔化学奖也授予下俢村，钱永健等在此方面做出贡献的科学家。
2 绿色荧光蛋白基本结构绿色荧光蛋白分子呈圆柱桶状。
Yang 等]2[的研究表明, GFP是由两个相当规则的内含一个α2螺旋和外面包围11个β2折叠链的β2桶状结构组成的二聚体。
图1 绿色荧光蛋白结构蛋白质前端环化形成生色团。
生色团的结构可以人工改造，从而发出不同波长的荧光。
生色团一经形成其化学性质便十分稳定，又能通过桶装蛋白质外壳给予其足够的保护，只有遇到强化学或者温度环境时才会遭到破坏，而且还具有一定的自我恢复能力。
正是这样的特殊结构使得荧光蛋白具有稳定的发光能力。
图2 生色团环化形成示意图如图所示，蛋白质二聚体端基环化氧化后能够发生质子化以及顺-反异构变化]3[，因此导致分子能级发生变化，具有发光能力。
生色团在蓝光照射下，会吸收蓝光的部分能量，然后发射出绿色的荧光。
利用这一性质，生物学家们可以用绿色荧光蛋白来标记几乎任何生物分子或细胞，然后在蓝光照射下进行显微镜观察。
gfp激发光波长和发射光波长
gfp激发光波长和发射光波长GFP激发光波长和发射光波长：深入探究引言绿色荧光蛋白（GFP）是一种非常流行的荧光蛋白家族成员，自从1990年首次从水螅上分离出来以来，已经成为生物技术和分子生物学领域的研究热点。
GFP 是一种蛋白质，能够在特定条件下发出特定颜色的荧光，广泛应用于荧光显微镜和融合蛋白质表达等领域。
在使用GFP时，有两个重要的概念需要了解，即GFP 激发光波长和发射光波长。
本文将介绍这两个概念的定义和相关背景知识，并探讨它们对GFP应用的影响。
第一部分：GFP的背景知识GFP的背景知识我们不必过多赘述，因为它在分子生物学和生物技术领域已被广泛运用，但我们仍然需要介绍一下它的简要历史和结构。
GFP的简要历史GFP最初是在1962年从海葵（Aequorea victoria）的触手中分离出来的。
然而，由于当时在结构和化学组成方面的技术限制，GFP的分子结构和工作机制一度不为人们所知。
1990年，Martin Chalfie等人成功地将GFP引入到线虫（Caenorhabditis elegans）的基因表达研究中。
随后，Douglas Prasher和Roger Tsien分别研究GFP的发射光波长和在其他生物系统中的应用。
由于这些重要研究的贡献，GFP成为了分子生物学和生物技术领域的研究热点，并在2008年赢得了化学领域的诺贝尔奖。
GFP的结构GFP是由一个238个氨基酸残基组成的蛋白质，其分子结构的最重要特点是三个环状结构。
这三个环状结构共同构成了GFP的一个色团（chromophore），这个色团是GFP能够发出荧光的根本原因，因此这个结构是研究GFP的重要关键之一。
值得一提的是，GFP虽然是从海葵中分离出来的，但它实际上是一种正常存在于海葵内的分子。
海葵在需要发出荧光时，GFP就会在细胞中储存并释放出来，所以GFP对于海葵来说就像是一种反应器，而我们可以通过基因工程技术在其他生物体系中引入这个反应器，从而实现在生物学中的应用。
大学精品课件：2015年第05讲+GFP绿色荧光蛋白
5
下村修从大量的维多 利亚水母中分离出的 蛋白，在UV照射下 发出绿色荧光
水母素与钙离子结合-发出蓝光 蓝光被GFP吸收，发出荧光
6
钱永健，Roger Tsien
Professor，美国科学院院士 Department of Chemistry, UCSD
主要贡献: 系统地研究了绿色荧光蛋白的工作原理， 并对它进行了大刀阔斧的化学改造， 不但大大增强了它的发光效率， 还发展出了红色、蓝色、黄色、青色荧光蛋白
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Chalfie，查尔非
Professor, Columbia University
线虫体内表达了绿色荧光蛋白
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荧光蛋白的结构解析
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维多利亚水母GFP由238个AA组成，分子量约27kD
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Topology structure (拓扑结构分析）
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荧光生色AA为65,66,67
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GFP用于药物筛选
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GFP用于肿瘤研究
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GFP用于细胞定位研究
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利用GFP观察病毒入侵宿主
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可用于检测重金属离子污染
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中国首例有GFP转基因荧光猪
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能发绿色荧光的油菜(UV light)
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GFP“调色板”
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“Methods for tumor diagnosis and therapy” US Patent 20030021791
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计算机辅助设计的探针分子
Extracellular PAP (Prostatic Acid Phosphatase)
绿色荧光蛋白及其应用
p-HBI 生色团的成熟过程经历 GFP 多肽骨架折叠 和生色团形成两个阶段，期间 4 个保守氨基酸残基发 挥着特殊的功能作用［10］。
2011，31( 1)
邓 超 等: 绿色荧光蛋白及其应用
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图 1 野生型 avGFP 的结构 Fig． 1 The structure of wild type avGFP
4 不同类型的荧光蛋白
通过 定 点 突 变 和 随 机 突 变 得 到 了 不 同 突 变 型 的 avGFP 样蛋白，珊瑚类荧光蛋白的发现使人们发展出更 多性质各异的荧光蛋白，发射谱覆盖 420 ～ 655 nm，应 用范围不断扩大 ［14-15］。部分荧光蛋白及基本性质见表 1 所示。 4． 1 蓝色荧光蛋白
2 绿色荧光蛋白的结构
从维 多 利 亚 多 管 水 母 中 分 离 出 来 的 野 生 型 GFP ( avGFP ) 由 238 个 氨 基 酸 残 基 组 成，分 子 质 量 约 27kDa，二级结构包括 11 个 β 折叠链( β-sheet strand) ， 8 个螺旋( helix) ，3 个转折( turn) ［图 1 ( a) ］，三维结构 ( PDB 登录号 1EMA 和 1GFL，1GFL 为二聚体) 为 42 × 24 ( 高 × 直径) 的 β 圆柱( β-barrel) ，圆柱两端由一 些较短的 α 螺旋盖住，圆柱中央是几段 α 螺旋，生色团 的三肽( Ser65-Tyr66-Gly67) 位于圆柱中央［图 1 ( b) ～ ( d) ］。该结构性质稳定，圆柱内部的微环境对维持生 色团的正确构象从而产生荧光以及保护生色团不被氧 气淬灭等都有重要作用［10］［图 1( e) ］。
荧光蛋白的寡聚可能会影响融合蛋白的正确定位和迁移几乎所有荧光蛋白都有寡聚趋势通过对有相互作用的侧链氨基酸进行突变可消除这种趋如蓝色荧光蛋白激发光接近紫外光一些珊瑚类荧光蛋白细胞毒性已有报道荧光蛋白发展至今人们对其在研究生物大分子相互作用及时空变化中的重要作用已没有质疑但相对于复杂的生命来说荧光蛋白还不足以解决许多问题