第三章 发酵培养基
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发酵工程第三章工业用培养基制备
反应时间短（<2hrs），产品质量较好 对原料要求较低，淀粉乳浓度较高 对淀粉颗粒大小无严格要求
淀粉水解糖的制备
• 几种水解方法的比较
• 从时间上看： 酸解法最快，酶解法最慢
• 从原料转化率和糖液质量上看： 酶解法>酸酶法>酶酸法>酸解法
淀粉水解糖的制备
三、氮源物质
• 氮源物质是培养基的主要成分之一。
所以应该少量（0.05-0.1％），多次（1次/12 小时）。同时要注意前体物质被作为营养物质利 用。
五、补料
• 补料解决的问题：
菌体早衰；料粘，搅拌能耗高，消泡难，溶氧降低， 渗透压高。
• 补料有利于：
丰富培养基；产物合成旺盛期延长；控制PH和代 谢方向；补足发酵液体积。
• 补料的目的和方法：
限制生长速度； 仅维持呼吸，半饥饿状态，利于 产物合成；控制好时间、速率和配比。
酶酸结合法之一，酸酶法 反应原理：
酸水解
糖化酶
淀粉———>糊精、低聚糖 ———>葡萄糖
优点：
产品质量高，反应时间较短（<2d） 对原料要求较低，淀粉乳浓度较高 用酸量少
淀粉水解糖的制备
酶酸结合法之二，酶酸法 反应原理：
淀粉—淀—粉—酶> 糊精、低聚糖
酸水解 ———>
葡萄糖
30min
30min
优点：
三、按培养基的成分和目的
2、 鉴别性培养基 培养基中加有能与某一菌的无色代谢
产物发生显色反应的指示剂，从而达到只 须用肉眼辨别颜色就能方便的从近似菌落 中找出目的菌菌落的培养基。
最常见的鉴别性培养基是伊红美蓝乳 糖培养基，即EMB 培养基。
四、按生产工艺的要求
发酵培养基及制备
kA2>kA3>kA1，所以可断定A2为A因素的优水平。
同理，可以计算并确定B3、C3、D1分别为B、 C、D因素的优水平。四个因素的优水平组合 A2B3C3D1为本试验的最优水平组合，即酶法 液化生产山楂清汁的最优工艺条件为加水量 50mL/100g，加酶量7mL/100g，酶解 温度为50℃,酶解时间为1.5h。
• 根据生产实践和科学试验的不同要求选择 • 根据经济效益分析选择培养基
–价廉、来源Βιβλιοθήκη 富、运输方便、就地取材、无毒二、发酵培养基成分选择的原则
• 不同的微生物所需要的培养基成分是不同 的，要确定一个合适的培养基，就需要了 解生产根据不同生产菌种的培养条件、生 物合成的代谢途径、代谢产物的化学性质 等确定培养基。
3
2
1
3
2
1
3
18
3
3
2
1
42
不考察交互作用的试验结果分析
（1） 确定试验因素的优水平和最优水平组合
分析A因素各水平对试验指标的影响。由表3可以看出，A1 的影响反映在第1、2、3号试验中，A2的影响反映在第4、5、 6号试验中，A3的影响反映在第7、8、9号试验中。
A因素的1水平所对应的试验指标之和为
度。Rj越大，说明该因素对试验指
标判的断影因响素越的大主。次根顺据 序。Rj大1小. ，计可算以
Kjm，kjm
极差分析法－R法
Rj 因素主次
2. 判断 优水平
优组合
试验号
1 2 3 4 5 6 7 8 9
因素
液化率
A
B
C
D
％
1
1
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2
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同理，可以计算并确定B3、C3、D1分别为B、 C、D因素的优水平。四个因素的优水平组合 A2B3C3D1为本试验的最优水平组合，即酶法 液化生产山楂清汁的最优工艺条件为加水量 50mL/100g，加酶量7mL/100g，酶解 温度为50℃,酶解时间为1.5h。
• 根据生产实践和科学试验的不同要求选择 • 根据经济效益分析选择培养基
–价廉、来源Βιβλιοθήκη 富、运输方便、就地取材、无毒二、发酵培养基成分选择的原则
• 不同的微生物所需要的培养基成分是不同 的，要确定一个合适的培养基，就需要了 解生产根据不同生产菌种的培养条件、生 物合成的代谢途径、代谢产物的化学性质 等确定培养基。
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不考察交互作用的试验结果分析
（1） 确定试验因素的优水平和最优水平组合
分析A因素各水平对试验指标的影响。由表3可以看出，A1 的影响反映在第1、2、3号试验中，A2的影响反映在第4、5、 6号试验中，A3的影响反映在第7、8、9号试验中。
A因素的1水平所对应的试验指标之和为
度。Rj越大，说明该因素对试验指
标判的断影因响素越的大主。次根顺据 序。Rj大1小. ，计可算以
Kjm，kjm
极差分析法－R法
Rj 因素主次
2. 判断 优水平
优组合
试验号
1 2 3 4 5 6 7 8 9
因素
液化率
A
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C
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第三章发酵培养基的制备及灭菌
牛肉膏、蛋白胨、玉米浆、玉米蛋白粉、米糠、酵母粉、 鱼粉、蚕蛹粉、黄豆饼粉、花生饼粉、棉籽饼粉、发酵菌丝体、酒 糟等。
这些含氮原料是否需要处理，则视具体情况而定。处理的 目的：有的是为了获得稳定的成分，有的是为了加速利用，有的是 为了去除过多的某些成分。
（三）无机盐及微量元素
1. 无机盐及微量元素的主要功能 ①参与细胞物质和代谢产物的组成；②参与细胞内能量代谢和转 移； ③调节细胞内的渗透压、pH值、氧化还原电位；④作为酶的 组成和激活剂。 2. 发酵培养基中所需的无机元素和微量元素 （1）无机元素
这些原料根据微生物的不同要求，有些需要处理，有些需要部 分处理，有些不需要处理。
（二）氮源
1. 氮源的功能 氮源主要构成微生物细胞物质和代谢产物（主要是蛋白质、
氨基酸等含氮化合物）中的氮素来源。 2. 常用作发酵培养基的氮源原料 （1）无机氮源（速效性氮源）
铵盐（硫酸铵、磷酸铵、碳酸铵、氯化铵、硝酸铵、尿素 和氨水等）、硝酸盐（硝酸钠、硝酸钾、硝酸铵）。 （2）有机氮源（迟效性氮源）
尽管目前已通过物理化学方法获得了去离子水和 脱盐水，但在建造发酵工厂时，还应首先考虑附近水源的 质量。
水源质量主要包括：pH值、溶解氧、可溶性固体、 矿物质组成、污染程度。
三．发酵培养基的调节剂——前体物质、促进剂和抑制剂
（一）目的 在某些氨基酸、核苷酸、酶制剂、抗生素发酵工业
中，发酵培养基除了添加碳源、氮源、无机盐、生长因子 和水之外，还应根据发酵菌种的特性和生物合成代谢调控 的需要，在发酵培养基中添加前体物质、促进剂和抑制剂， 其目的是大幅度提高发酵生产率并降低成本。
·在抗生素发酵培养基中添加某些促进剂和抑制剂，常可促进抗生素的 生物合成。在不同抗生素发酵中，不同的促进剂和抑制剂的作用不 同：
这些含氮原料是否需要处理，则视具体情况而定。处理的 目的：有的是为了获得稳定的成分，有的是为了加速利用，有的是 为了去除过多的某些成分。
（三）无机盐及微量元素
1. 无机盐及微量元素的主要功能 ①参与细胞物质和代谢产物的组成；②参与细胞内能量代谢和转 移； ③调节细胞内的渗透压、pH值、氧化还原电位；④作为酶的 组成和激活剂。 2. 发酵培养基中所需的无机元素和微量元素 （1）无机元素
这些原料根据微生物的不同要求，有些需要处理，有些需要部 分处理，有些不需要处理。
（二）氮源
1. 氮源的功能 氮源主要构成微生物细胞物质和代谢产物（主要是蛋白质、
氨基酸等含氮化合物）中的氮素来源。 2. 常用作发酵培养基的氮源原料 （1）无机氮源（速效性氮源）
铵盐（硫酸铵、磷酸铵、碳酸铵、氯化铵、硝酸铵、尿素 和氨水等）、硝酸盐（硝酸钠、硝酸钾、硝酸铵）。 （2）有机氮源（迟效性氮源）
尽管目前已通过物理化学方法获得了去离子水和 脱盐水，但在建造发酵工厂时，还应首先考虑附近水源的 质量。
水源质量主要包括：pH值、溶解氧、可溶性固体、 矿物质组成、污染程度。
三．发酵培养基的调节剂——前体物质、促进剂和抑制剂
（一）目的 在某些氨基酸、核苷酸、酶制剂、抗生素发酵工业
中，发酵培养基除了添加碳源、氮源、无机盐、生长因子 和水之外，还应根据发酵菌种的特性和生物合成代谢调控 的需要，在发酵培养基中添加前体物质、促进剂和抑制剂， 其目的是大幅度提高发酵生产率并降低成本。
·在抗生素发酵培养基中添加某些促进剂和抑制剂，常可促进抗生素的 生物合成。在不同抗生素发酵中，不同的促进剂和抑制剂的作用不 同：
3第三章发酵培养基61讲义教材
3、用量：根据具体的产品，以实验决定，P104
4、使用注意点 A. 对于其它渠道有可能带入的过多的某种无机离子和 微量元素在发酵过程中必须加以考虑
例：铁离子 青霉素发酵中，铁离子的浓度要小于20μg/ml 发酵罐必须进行表面处理
B、使用时注意盐的形式（pH的变化） 例：黑曲酶NRRL-330,生产α-淀粉酶，P对酶活的影响
有机氮源是这些生长因子的重要来源，多数有机氮源 含有较多的B簇维生素和微量元素及一些微生物生长不可 缺少的生长因子
2、前体
前体指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接彼微生 物在生物合成过程中合成到产物物分子中去，而其自身的结 构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大 的提高。
青霉素：分子量356
第三节 发酵培养基的设计和优化
目前还不能完全从生化反应的基本原理来推断和计算 出适合某一菌种的培养基配方，只能用生物化学、细胞生 物学、微生物学等的基本理论，参照前人所使用的较适合 某一类菌种的经验配方，再结合所用菌种和产品的特性， 采用摇瓶、玻璃罐等小型发酵设备，按照一定的实验设计 和实验方法选择出较为适合的培养基。
苯乙酸:分子量136
作用：前体有助于提高产量和组份 P107
用量：前体的用量可以按分子量衡算，具体使用有个转化 率的问题
例：6000单位/ml的青霉素G,需要多少苯乙酸 青霉素＝6000*0.6（微克）＝36mg/ml 苯乙酸＝（36*136）/356=13.8mg/ml=1.38%
实际使用时的转化率在46-90%之间
成分复杂：除提供氮源外，有些有机氮源还提供大量的无机 盐及生长因子。
例 玉米浆： ①可溶性蛋白、生长因子（生物素）、苯乙酸 ②较多的乳酸 ③硫、磷、微量元素等
有机氮源成分复杂可以从多个方 面对发酵过程进行影响，而另一方面 有机氮源的来源具有不稳定性。所以 在有机氮源选取时和使用过程中，必 须考虑原料的波动对发酵的影响
4、使用注意点 A. 对于其它渠道有可能带入的过多的某种无机离子和 微量元素在发酵过程中必须加以考虑
例：铁离子 青霉素发酵中，铁离子的浓度要小于20μg/ml 发酵罐必须进行表面处理
B、使用时注意盐的形式（pH的变化） 例：黑曲酶NRRL-330,生产α-淀粉酶，P对酶活的影响
有机氮源是这些生长因子的重要来源，多数有机氮源 含有较多的B簇维生素和微量元素及一些微生物生长不可 缺少的生长因子
2、前体
前体指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接彼微生 物在生物合成过程中合成到产物物分子中去，而其自身的结 构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大 的提高。
青霉素：分子量356
第三节 发酵培养基的设计和优化
目前还不能完全从生化反应的基本原理来推断和计算 出适合某一菌种的培养基配方，只能用生物化学、细胞生 物学、微生物学等的基本理论，参照前人所使用的较适合 某一类菌种的经验配方，再结合所用菌种和产品的特性， 采用摇瓶、玻璃罐等小型发酵设备，按照一定的实验设计 和实验方法选择出较为适合的培养基。
苯乙酸:分子量136
作用：前体有助于提高产量和组份 P107
用量：前体的用量可以按分子量衡算，具体使用有个转化 率的问题
例：6000单位/ml的青霉素G,需要多少苯乙酸 青霉素＝6000*0.6（微克）＝36mg/ml 苯乙酸＝（36*136）/356=13.8mg/ml=1.38%
实际使用时的转化率在46-90%之间
成分复杂：除提供氮源外，有些有机氮源还提供大量的无机 盐及生长因子。
例 玉米浆： ①可溶性蛋白、生长因子（生物素）、苯乙酸 ②较多的乳酸 ③硫、磷、微量元素等
有机氮源成分复杂可以从多个方 面对发酵过程进行影响，而另一方面 有机氮源的来源具有不稳定性。所以 在有机氮源选取时和使用过程中，必 须考虑原料的波动对发酵的影响
微生物工程(发酵)第三章 培养基制备与灭菌
3.3 培养基及设备的灭菌
3.3.1常见灭菌方法： • 加热灭菌 • 过滤灭菌 • 辐射灭菌 • 化学灭菌 • 熏蒸灭菌
1、高温灭菌
• 1）干热灭菌
烘箱内热空气灭菌 160℃，2小时
干）煮沸消毒
3）丁达尔灭菌 4）常规高压灭菌 121℃，15分钟； 115℃，30分钟；
类胡萝卜素高产菌Y11的培养基的优化
郭秒,食品与工业发酵，2004
类胡萝卜素的作用：色素、营养保健
原培养基:
初步确定可能的培养基成分(以碳源为例)
通过单因子实验确定适宜的培养基成分(以碳源为例)
考虑到成本：乙酸钠是较为合适的碳源 进一步：乙酸钠的浓度2%比较好
结果： 碳源：乙酸钠 0. 2% 氮源：氯化铵 0.2% 酵母膏0.03%
3.1.1.6 前体物质、抑制剂和促进剂
前体物质指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接彼 微生物在生物合成过程中合成到产物物分子中去，而其自身 的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有 较大的提高。
青霉素：分子量356
苯乙酸:分子量136
• 前体一般都有毒性，浓度过大对菌体的生 长不利 • 苯乙酸，一般基础料中仅仅添加 0.07%
有些促进剂的作用是沉淀或螯合有害的重金属离子。
抑制剂：能使酶的催化活性下降而不引起酶蛋白质 变性的物质； 可用透析或超滤的方式去除；
在培养基中添加抑制剂会抑制某些代谢途径的进行， 同时会使另一代谢途径活跃，从而获得人们所需要 的某一终产物或使正常代谢的某一代谢中间产物积 累起来;
3.1.2 发酵工业原料的选择原则
• • • • • • • • 因地制宜，就地取材； 营养丰富，浓度恰当； 资源丰富，容易收集； 易于储藏； 理化性质稳定，成分间无反应； 不影响通气、搅拌、产物分离，废物处理方便 不含毒副作用的物质 价格低廉
微生物工程第三章发酵工业培养基设计
苏勤，林业化学与工业，2004
结果：各种碳源相差不大
推论：该菌种的碱性纤维素酶为组成型
第十七页，共73页
４、油和脂肪
脂肪酶
氧气
油、脂肪
甘油＋脂肪酸
CO2＋H2O
ATP
※供氧要充足，否则会使有机酸积累，引起pH下降
常用：豆油、菜油、葵花籽油、猪油、鱼油、棉籽油等
第十八页，共73CH3COONa＋O2→CO2+H2O+NaOH
第十页，共73页
第十一页，共73页
不同加工方法对甘蔗糖蜜的影响：
第十二页，共73页
糖蜜使用应注意除杂：
除糖份外，含有较多的杂质，其中有些是有用的 ，但是许多都会对发酵产生不利的影响，需要进行
预处理。
例：谷氨酸发酵
有害物资：胶体成分（起泡、结晶）、钙盐（结晶）
生物素（发酵控制）
预处理：澄清→脱钙→脱除生物素
子量。
第四十一页，共73页
2.种子培养基
要求
营养丰富、完全，氮和维生素的含量高些； 培养基中加入一些易于吸收利用的快C、N源，
便于孢子萌发生长； pH要稳定； 最后一级尽可能接近发酵培养基，常加入少量发
酵合成期才大量需要的物质。
第四十二页，共73页
3. 发酵培养基
目的：获得高产量的发酵产物。
培养大肠杆菌常用两种培养基
M培养基(1L)： Na2HPO4 6g，KH2PO4 3g， NaCl 0.5g， NH4Cl 1g， MgSO4.7H2O 0.5g， CaCl2 0.011g，葡萄糖 2-10g, pH 7.0
YPS培养基：酪蛋白胨（日本大五营养）10g，酵母
提取物（英国Oxoid）5g, NaCl 10g，pH 7.2
结果：各种碳源相差不大
推论：该菌种的碱性纤维素酶为组成型
第十七页，共73页
４、油和脂肪
脂肪酶
氧气
油、脂肪
甘油＋脂肪酸
CO2＋H2O
ATP
※供氧要充足，否则会使有机酸积累，引起pH下降
常用：豆油、菜油、葵花籽油、猪油、鱼油、棉籽油等
第十八页，共73CH3COONa＋O2→CO2+H2O+NaOH
第十页，共73页
第十一页，共73页
不同加工方法对甘蔗糖蜜的影响：
第十二页，共73页
糖蜜使用应注意除杂：
除糖份外，含有较多的杂质，其中有些是有用的 ，但是许多都会对发酵产生不利的影响，需要进行
预处理。
例：谷氨酸发酵
有害物资：胶体成分（起泡、结晶）、钙盐（结晶）
生物素（发酵控制）
预处理：澄清→脱钙→脱除生物素
子量。
第四十一页，共73页
2.种子培养基
要求
营养丰富、完全，氮和维生素的含量高些； 培养基中加入一些易于吸收利用的快C、N源，
便于孢子萌发生长； pH要稳定； 最后一级尽可能接近发酵培养基，常加入少量发
酵合成期才大量需要的物质。
第四十二页，共73页
3. 发酵培养基
目的：获得高产量的发酵产物。
培养大肠杆菌常用两种培养基
M培养基(1L)： Na2HPO4 6g，KH2PO4 3g， NaCl 0.5g， NH4Cl 1g， MgSO4.7H2O 0.5g， CaCl2 0.011g，葡萄糖 2-10g, pH 7.0
YPS培养基：酪蛋白胨（日本大五营养）10g，酵母
提取物（英国Oxoid）5g, NaCl 10g，pH 7.2
第三章 发酵工业培养基
2020/9/20生命科学学院微生物教研室 Nhomakorabea12
产品
青霉素 链霉素 红霉素
前体
苯乙酸及其衍生物 肌醇、精氨酸
丙酸、丙醇、丙酸盐
产品
前体
VB12
钴化物
胡萝卜素 β-紫罗兰酮
L-色氨酸 邻氨基苯甲酸
青霉素：分子量356
苯乙酸:分子量136
2020/9/20
生命科学学院微生物教研室
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(2)促进剂：
指那些既不是营养物又不是前体却能提高 产量的添加剂。
2、有利于减少培养基原料的消耗，即 提高单位营养物质的转化率。
2020/9/20
生命科学学院微生物教研室
4
3、有利于提高产物浓度，以提高单 位容积发酵罐的生产能力。
4、有利于提高产物的合成速度，缩 短发酵周期。
5、尽量减少副产物的形成，便于产 物的分离纯化。
2020/9/20
生命科学学院微生物教研室
生命科学学院微生物教研室
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2020/9/20
生命科学学院微生物教研室
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(3)抑制剂：
指在发酵过程中加入的能抑制微生物 某些代谢途径的进行而使另一代谢途 径活跃，从而积累人们所需产物的那 些物质。
2020/9/20
生命科学学院微生物教研室
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常用的抑制剂有亚硫酸氢钠、亚硫酸 钠、溴化剂等。
2020/9/20
生命科学学院微生物教研室
8
2.氮源
氮源是指构成微生物细胞和代谢产物中 的氮素的营养物质。
根据需要使用无机氮源、有机氮源或二 者混合使用。
有机氮源有花生饼粉、黄豆饼粉、棉子 饼粉、玉米浆、酵母粉、酒糟等。
无机氮源有硫酸铵、硝酸盐、氯化铵、 磷酸氢二铵和氨水等。
微生物工程--第3章-发酵工业的培养基及原料处理可编辑全文
加热
维持
加压灭菌法
连续加压灭菌法优点
①因采用高温瞬时灭菌，故既可杀灭微生物，又可最大 限度减少营养成分的破坏，从而提高了原料的利用率， 比“实罐灭菌”（120℃，30分钟）提高产量5～10％；
②由于总的灭菌时间较分批灭菌明显减少，所以缩短了 发酵罐的占用周期，从而提高了它的利用率；
③由于蒸汽负荷均匀，故提高了锅炉的利用率； ④适宜于自动化操作； ⑤降低了操作人员的劳动强度。
①营养不能太丰富，否则不易产孢。
②无机盐浓度要适当，不然会影响孢子 量和孢子的颜色（质量）。
③注意pH和湿度。
常用的孢子培养基有：麸皮培养基、小 米培养基、大米培养基、玉米碎屑培养基等。
它们含氮量低，疏松、表面积有摇瓶种子和种子罐用的种子培养基等。对种 子培养要求做到纯种、健壮、活力旺盛，并有足 够的数量，以满足下一级菌种生长繁殖需要。
葡萄糖值（DE）98以上
含非发酵性糖、NaCl等杂质， 糖化液纯度高，易于精制 精制较难
糖化液具苦味，色深 高温、高压 淀粉浆浓度低 收率较低，成本较高
糖化液不具苦味，色浅 常温、常压 淀粉浆浓度高 收率比酸法提高10％，成本 降低10％
长时间多次结晶，才能制得 可一次结晶制得纯葡萄糖 纯葡萄糖
废液利用率低 酸用量少，糖化时间短
对这种培养基的要求是能够使菌体长得快 而健壮，而且不易引起菌种变异。
一般斜面培养基中碳源和氮源含量不 宜过多，特别是碳源，多了会引起pH波动， 无机盐浓度也要控制适当，以免影响菌种 特性。
2、孢子培养基：
供菌种繁殖孢子的一种固体培养基，要 求使菌体生长迅速，产生数量较多的优质孢 子，并且不引起菌种的变异，因此在配置上 要求:
（二）消毒（disinfection）