环境内分泌干扰物的检测
环境内分泌干扰物_邻苯二甲酸酯的研究_林兴桃
第一作者:林兴桃,女,1977年出生,在读硕士研究生,研究方向为环境生物有机化学。
*北京市自然科学基金资助项目(8000001)环境内分泌干扰物——邻苯二甲酸酯的研究*林兴桃 王小逸 任 仁(北京工业大学环境与能源工程学院, 北京100022)摘要 介绍了环境内分泌干扰物的生殖毒性,综述了不同环境样品中邻苯二甲酸酯类内分泌干扰物的前处理技术和分析测试技术,并指出环境中邻苯二甲酸酯的污染状况。
关键词 邻苯二甲酸酯 环境内分泌干扰物 前处理 分析测试技术Environmental endocrine disruptors ——a study of phthalate esters L in X ingtao ,W ang X iaoy i ,Ren Ren .Colleg e of Env ir onmental and Ener gy Engineer ing ,Beij ing Poly technic University ,Beij ing 100022Abstract :T he repro ductiv e tox ico lo gy o f env ir onmental endocr ine disr upto rs wa s intr oduced .Pr etr eatments o f pht halate ester s in differ ent env ir onmental samples w ere co mpar ed,and it s analysis technolog ies wer e rev iew ed.T hen its pollut ion statas in env iro nment wa s pr esented .Keywords :Phthalate ester s Env ir onmental endocr ine disr upt or s P ret reatm ent Analysis technolog y 环境内分泌干扰物又称环境激素,是一类存在于环境中能进入人体内部,危害人体正常激素分泌的化学物质。
水环境中农药类污染物的内分泌干扰效应研究
水环境中农药类污染物的内分泌干扰效应研究摘要：环境中往往是多种内分泌干扰物并存条件下的综合效应，未来研究应重点关注低剂量联合暴露下的综合效应以及农药中间体和有毒代谢物的毒性效应，对生物体产生作用的机理研究等。
生物检测技术以生物效应为目标导向，是内分泌干扰类农药识别监测与风险评价的有效方法，但生物方法往往难以对目标物定量，因此应结合化学和仪器测试进行综合性的科学评价，形成以生物检测为导向、化学和仪器分析技术为支撑的内分泌干扰效应导向分析方法。
基于此，对水环境中农药类污染物的内分泌干扰效应进行研究，仅供参考。
关键词：农药；内分泌干扰物；防治引言随着农业和工业发展被不断排入环境的化学污染物，已对人类健康构成威胁，这是目前全球环境健康领域最令人关切的问题之一。
已有流行病学和实验研究表明，很多污染物与人类健康密切相关，存在内分泌干扰效应。
其中部分干扰生物体内分泌系统正常功能与作用的外源性化合物被称为内分泌干扰物(endocrine-disruptingchemicals,EDCs)，它们可干扰内源激素的产生、分泌、运输、代谢及作用，从而影响生物体的生长、发育和生殖等生理过程。
环境中EDCs主要包括各种农药、阻燃剂、重金属等。
1农药(Pesticides)大量研究发现人类广泛暴露于各类农药，其中不乏持久性化合物，例如大多数国家已禁用有机氯杀虫剂(dichlorodiphenyltrichloroethane,DDT)，但至今其污染仍然存在。
英国一项研究根据农药的暴露源和健康影响评估确定了127种具有内分泌干扰特性的杀虫剂。
有机氯农药是目前普遍存在的高持久性污染物，其中围绕杀虫剂DDT及其代谢物(dichlorodiphenyldichloroethylene,DDE)和(dichlorodiphenyldichloroethane,DDD)的研究尤为集中。
南非一项研究显示，与居住在非喷洒残留室内的男子相比，居住在喷洒残留室内的男子血液中DDT和DDE浓度更高，在检出DDT的男性中血清LH和FSH浓度低于未检出组(P=0.02,P=0.001)，在检出DDE的男性中FSH浓度显著下降(P=0.02)。
环境内分泌干扰物筛选与控制技术的研究进展
２０ ０ ７年 第 ２ 期
环
保
科
技
Ｖｏ． ３ Ｎ ． １１ Ｏ ２
环 境 内分泌 干扰 物 筛选 与控 制
技 术 的研 究进 展
陈 一 萍
（ 州 师 范 学 院 资源 与环 境 学 院 ，福 建 泉 州 ３ ２ ０ ） 泉 ６ ０ ０
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３ ・ ３
维普资讯
２０ ０ ７年 第 ２期
环 保 科 技
Ｖ １１ Ｏ． ３
Ｎ ． Ｏ２
似 与否 ，都可 通过天 然激 素受体 或其他 细胞 核 受体 以及直 接通过 胞 内其 他信 号传 递 系统 的介导 产生生 物效应 。
推荐用 Ｔｉ 法 （ 阶段 性地 实行 试验 的筛 检 ｅ ｒ 分 方法 ） 。此 试验 法 由 Ｔ ｅｌ和 Ｔｉｒ ｉｒ ｅ２两个 阶段 组 成 ，在 Ｔｉ ｌ阶 段 的试 验 又分 为 ｉ ｉ ｏ ｅ ｒ ｎ ｖｔ ｒ （ 体外 试验 ） ｉ ｉｏ 体 内试验 ） 和 ｎｖｖ （ 两种 ， 这 用 些试验 方法 筛选 化合 物质 是否具 有雌激 素活 性、 雄激 素 活性 、 甲状 腺皮 质激 素活性 ； ｉｒ Ｔ ｅ２ 阶段 是 Ｔｉ ｅ ｒ的补充 试验 ，调查在 Ｔ ｅｌ阶段 ｉｒ 中被筛选 出的物质对 人 、野 生生物 的 内分泌 干扰性质 、 可能 危害 性 、 量一反 应关系 、 剂 对 后代 的生殖影 响 等更 具体 的 工作Ｌ 。这种方 ８ ］ 法具有 相对 的准确 性 和权威 性 ，但 同时往 往 操作过 程复 杂 、费时 费力 ，不适用 于高通 量 筛选 以及 现场应用 ， 因此建立 快速 、 简便 、 经 济 、可靠并 可 实现 高通量 筛选 的体外检 测系 统 至关 重要 。李 延 等Ｌ通 过鲫 鱼 淋巴细胞 体 ９ 外 培养 ， 采用 ＭＴ 法 测试 ． Ｔ １ １种酚类 化合物 对鲫 鱼淋 巴细胞 增 殖 的影 响 ，初步筛选 出具 有 内分 泌干 扰 活 性 的物 质 ，结 果 表 明 ＭＴＴ 法是 测定 淋 巴细胞增 殖 的常用 方法 ，具有快 速 、 敏等 优点 ， 以作 为 Ｅ Ｃ 灵 可 Ｄ ｓ的一种筛选 方 法和污 染物 免疫 毒性 的快 速测定法 。
环境内分泌干扰化学物的甄别方法和评价体系
・述评・作者单位:610041成都,四川大学华西公共卫生学院环境卫生、营养与食品卫生教研室环境内分泌干扰化学物的甄别方法和评价体系张立实 吴德生 环境内分泌干扰化学物(environmental endocrine disrupting chemicals ,EEDCs )对人类和野生动物健康的危害已是不争的事实。
从预防医学的观点出发,对环境中各种化学物的内分泌干扰活性进行甄别(screening and testing ),以确定该化学物(或混合物)是否具有干扰生物机体内分泌活性的作用,即是否属于内分泌干扰物?这对于制定保护生态环境和人类健康的预防措施和决策具有重要意义。
在环境内分泌干扰物的甄别方法研究中,目前尤其应注意的是:(1)随着研究的不断深入和扩大,EEDCs 的作用已不仅仅局限于由激素受体介导的对激素功能的激活或阻遏,还应当包括对整个内分泌腺轴内稳态的破坏,以及对激素的产生、分泌、合成、代谢、转运和排泄等过程的干扰等。
因此用“环境激素”或“环境类激素”来代表整个这一类化学物就显得不够准确;(2)在目前对动物实验要求实施三“R ”(refine/replace/reduce )呼声很高的环境氛围中,如何建立我们自己的、可靠和实用的环境内分泌干扰物甄别方法和评价体系。
一、环境内分泌干扰物甄别方法的范围环境化学物内分泌干扰活性的甄别是指应用科学的方法来鉴定某种化学物是否具有EEDCs 的各类效应特征,以确定该化学物是否属于EEDCs 。
这是识别、研究和控制EEDCs 污染和保障人类健康的前提,也是目前EEDCs 研究中最急需解决的问题。
环境内分泌干扰物的甄别和评价方法目前至少应包括以下几方面:(1)环境化学物模拟或拮抗生物体内主要激素如雌激素、雄激素、甲状腺素活性的甄别和评价方法;(2)环境化学物对生物体内上述激素的产生、分泌、转运、代谢、排泄等活动过程干扰的甄别和评价方法;(3)环境内分泌干扰物对人类健康整体效应(尤其是下丘脑-垂体-腺轴)的评价方法;(4)环境内分泌干扰物的生态效应评价方法;(5)多种环境化学物(混合物)内分泌干扰活性(联合作用)的评价方法。
环境内分泌干扰物
环境内分泌干扰物
(Environmental Endocrine Disruptors)
时国庆 北京科技大学化生学院生物科学与工程系
问题：
1. 什么是环境内分泌干扰物？ 2. 什么是低剂量效应？ 3. 环境内分泌干扰物对人类及野生动物的影 响有哪些？ 4. 你认为应该怎样协调工农业新技术与潜在 环境风险的关系？
2004年7月8日美国环境保护署对美国杜邦公司提起行政 指控，称其隐瞒了其生产不粘锅涂料“特富龙” （Teflon）中的一种关键化合物PFOA（全氟辛酸铵）具 有潜在健康风险的事实，拟对其处以数亿美元的重罚。 7月14日，我国国家质检总局正式就 “特富龙”事件发 表声明，表示将迅速组织专家就全氟辛酸对人体健康的 危害进行研讨和论证。
杀虫剂
杀线虫剂 工业化合物 重金属 树脂原料
铅、镉、汞 烷基酚、壬基酚、辛基酚、苯乙烯、双酚-A 、聚氯乙烯、邻 苯二甲酸二丁酯、双(2- 乙基己基) 己二酸盐、双(2-乙基己基) 邻苯二甲酸盐。 他莫昔芬、己烯雌酚、溴萘酚、壬苯醇醚-9 壬基酚。 多氯联苯、阿罗可罗-1254、派兰诺油。
药物 绝缘油
1962年，《寂静的春天》出版发行。书中阐述了滥 用杀虫剂对生态环境造成的危害，对美国及世界其 他主要国家生态环境政策的制定产生了巨大影响。
1961-1971年越南战争期间，美军在越南战场上使用含二恶 英的枯叶剂——“橙剂（Agent Orange）”，总量达4000多 万升。这是迄今为止历史上最严重的二恶英污染事件，对 越南饱受脱叶剂危害地区的事后调查发现大量流产、死胎、 新生儿畸形等案例。
1962年，在《寂静的春 天》一书中，R. Carson用大量 的证据证明有机氯农药DDT是导 致游隼（peregrine falcon, Falco peregrinus）卵壳变薄 的元凶。
丹麦将用SIN清单内分泌干扰物质检验物质分类标准
国际市场— ＯＲ Ｄ ＭＡＲ Ｅ ２ ２０ Ｗ Ｌ Ｋ Ｔ ０１ ．３
进 口卫 生 标 准 ， 及 所 有 进 口的无 机 风 险 材料 （ ＮＺ ＴＤ— 涉 Ｂ －Ｓ
是不遮 盖 脚踝 ， 式 不分男女 ， 款 内底 长 度 超 过 ２ 厘 米 ， ４ 外底 及 中层 鞋 底 分 别 以橡 胶 及 低 密 度 聚 合 物 制 造 。 面 以 多块 纺 鞋
织物、 革及 塑胶制造 。 皮 规例 内容 进 一 步 说明 训练 鞋 的特 征细 节 ， 括 颜 色、 包 制 造 物 料 以及 如 何 接 合 物 料 ， 提 供 图 像 显 示 未 制 成 及 制 并
运动鞋； 网球 鞋 、 球 鞋 、 操 鞋 、 练 鞋 及 类 似 物 ， 缴 付 篮 体 训 须
１ ． ％ 的 关税 。 ６９
第 ７ ２ ２ １号 规 例 对 儿 童 安 全 椅 座 作 出 描 述 ， ７ ／ ０１ 亦于 日前
公 布 。 种产 品配备 可延伸 的椅 脚 ， 以红色 ／ 色标 示方 这 并 绿 式 标 示 安 全 椅 是 否 已 正 确 安 装 。 座 适 用 于 不 同 型 号 的儿 童 椅 安 全椅 ， 于 儿 童 安 全 椅 的 一 部 分 ，因此 被 纳 入 合 并 名 目编 属 号 ９ ０ ０ ０ 须 缴 付 ２７ 的 关税 。 ４ １９ ８ ， ．％
新 西 兰 日前 发 出通 报 ， 无 机 风 险 材 料 的 进 口卫 生 标 准 对
pde 残留基准值
pde 残留基准值近年来，不少国家陆续将pde作为环境内分泌干扰物的一个重要组成部分，加以控制。
近年来，不少人发现其血液中的pde（ 2-甲基苯并呋喃）含量增多，甚至出现pde中毒症状，称为“血液白细胞pde中毒症”。
有关专家研究后指出， pde的蓄积可能与人们对癌症和慢性肝病的担忧及肿瘤的发生率上升相关。
pde的潜在威胁表现在两个方面： 1、人们在接触这类物质时，由于可产生细胞核染色体断裂、基因突变等致癌作用，因而会导致癌症或其它疾病的发生。
2、这类物质可通过吸入途径进入人体，从而造成呼吸道刺激和肺损伤。
更为严重的是，pde具有一定的致畸性和致突变性，它与环境雌激素有交叉反应。
pde的残留基准值也会引起免疫力下降。
近期有研究表明， pde 还具有强大的诱导淋巴细胞转化功能。
这种特殊的淋巴细胞在淋巴细胞活化过程中可产生大量细胞因子，同时pde还是最重要的淋巴因子——白细胞介素-1的前体物质， pde还可能诱导nk细胞分化，同时又能刺激t细胞的生长。
在癌症治疗过程中， pde可以成为抗癌药物与放射线治疗效果减弱的原因之一。
因此， pde被认为是肿瘤的形成因素之一， pde也被认为是肿瘤的发病机理之一。
我国自2002年正式将pde纳入环境内分泌干扰物的检测项目，并确定为正式监测指标，有关部门已把其列为我国工业污染源监督性监测项目。
但由于pde在废水处理过程中容易产生耐药性，且具有一定的蓄积性，因此我国各地的污水处理厂还没有将其纳入常规监测指标。
由于我国是发展中国家，经济发展水平较低，各方面的条件都相对落后。
而pde的环境危害并非局限于中国，许多国家包括欧美等发达国家也正在采取措施加强对其的控制。
例如，美国环保局（ epa）和联邦贸易委员会（ ftc）规定，只有食品添加剂中才允许有总浓度小于0.05ppm的该类物质。
美国农业部已宣布pde的替代品呋喃代替物即o-3-硝基呋喃将在今后五年内逐步推广使用，并将从2006年开始在农药和杀虫剂中全面禁止使用。
荧光法测双酚A方案
荧光法测双酚A的具体试验方案1.实验目的和参考资料近二十年来研究发现，环境中存在一些干扰人和动物内分泌系统的污染物，这些污染物会影响人体和动物的正常发育与成长，称为内分泌干扰物，该干扰物可分为天然和人工合成两类。
其中双酚A(BPA)是一种典型的人工合成的内分泌干扰物，作为人工合成环氧树脂和聚碳酸树脂的单体，广泛应用于塑料生产领域。
据相关文献报道，在河流、湖泊、自来水、废水等。
水体中均检出双酚A，双酚A的污染问题已引起人们的极大关注，2007年我国已将双酚A列入饮用水卫生标准监测指标之中。
因此，建立一种简单、快速、灵敏度高的双酚A分析方法十分必要。
双酚A在水体中的荧光强度低，而β环糊精（β－CD）能增强水体中双酚A的荧光强度 [1] （见页尾），所以我们用β环糊精来作为荧光增强剂.β环糊精水溶性：18.5 G/L (25℃) 分子式：C42H70O35分子量：1135 [2]2.实验部分2.1试剂与仪器双酚A，β环糊精，蒸馏水，荧光分光光度计，烧杯，玻璃棒，容量瓶2.2.实验步骤1.确定激发波长和发射波长在荧光分光光度计上直接扫描双酚A 的激发波长和发射波长，因为双酚A 本身就有荧光效应，可以直接扫描，这里取双酚A 的浓度为10^-3g/ml确定出双酚A 的激发波长和发射波长。
最大激发波长为291nm，发射波长为315nm2. 荧光增强剂（β环糊精）量的优化在双酚 A 质量浓度为10^-4g/ml的条件下，向溶液中分别加入不同浓度（0.001mol/L 0.01mol/L 0.005mol/L 但体积都为1ml的荧光增强剂（β-环糊精），根据其对双酚A 荧光强度的影响选择出合适的荧光增强剂用量。
所以，β环糊精的物质的量为_______________时，荧光强度最好。
3.溶液PH的优化配制浓度为0.01mol/L的氢氧化钠溶液和0.01mol/L的HCL溶液，在双酚A质量浓度为1.5^-3g/ml，以及确定好了β环糊精最佳浓度的条件下，分别用他们来调节PH，从PH为1到14，根据PH对荧光强度的影响来确定最佳的PH。
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• 检测卵黄蛋白原的方法有多种, 常用的有3 种: 放射性免疫测定法(R IA )、酶联免疫法 (EL ISA ) 和蛋白吸印免疫检测法(W estern B lo t t ing)。
检测方法
• 放射性免疫测定法：使用[ 32P ]和[ 3H ]标 记的亮氨酸; 对不同鱼种类都有效; 灵敏、 定量、特异性; 灵敏检测限为0.001 µmol/mL , 常规检测限为0.01 µmol/mL • 酶联免疫法：使用单克隆或多克隆抗体;不 同鱼种类有特异性; 在适当的稀释范围也允 许定量; 检测限为0.1 µmol/mL • 蛋白吸印免疫检测法：能准确确定蛋白质, 但定量方面较弱
• 环境中大量存在的内分泌干扰物可能危害 人类和野生动物内分泌、神经、免疫等系 统的正常功能并导致内分泌紊乱、生长发 育异常、出生缺陷和肿瘤的发生率增加、 生殖能力下降等，从而严重影响人类的生 存与发展。 • 国内率先开始研究的是1997年中国科学院 生态环境研究中心环境水质学国家重点实 验室。
目的和意义
环境内分泌干扰物的 雌激素效应检测
内分泌干扰物简介
• 内分泌干扰物：天然动物性雌激素雌酮(E1)、 雌二醇(E2)、雌三醇(E3)和作为药物使用的人 工合成雌激素己烯雌(DES)、乙炔基雌二醇 (EE2)、戊酸雌二醇(EV)。 • 分子结构 具有苯环结构的居多, 分子量150～ 400之间。分子结构和分子大小与生物体内的 激素相似。 • 性质 大多数是脂溶性化合物, 分子中不含有 强的水溶性基因, 因此较易溶于油脂类物质中, 水中溶解度较小。性质比较稳定，具有难分解 性, 不易生物降解, 可通过食物链进入体内并富 集。
实验鱼种
• 目前已经有资料表明选用的鱼类主要有以 下几种: 鲤科(carp)、鲽类(flounder)、罗非 鱼( tilapia)、日本青鳉(Japane semedaka)、 大西洋鲑(Atlantic salmon)、虹鳟( rainbow trout)、呆头鲦(fatheadm innows)、剑尾鱼 ( swordtail fish ) 和白鲑(chub)。由于不同的 鱼种类自身的生物学特点不同, 所以就决定 了不同的环境激素类物质一般要选用不同 的鱼种进行检测。 • 我们实验室选用的是日本青鳉
反应式及计算公式
OD 420 OD420 U D t V OD 600
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酵母双杂交法
• 重组基因酵母法仅仅把人类雌激素受体 (hER) 的DNA片段整合到酵母的基因组中; 而酵母双杂交法则在此基础之上, 把辅激活 蛋白同时转入酵母细胞中。
雌激素浓度的分析
• 雌激素效应的检测是有利于对其浓度的检 测，通过检测其效应，判断环境水里的雌 激素分布，然后对每一物质进行浓度检测 • 对其浓度的分析而达到对水域的生态风险 评估
重组基因酵母检测法
• 原理：酵母细胞一般不含雌激素受体(ER )。重组基因酵 母检测法是将人类雌激素受体(hER) 的DNA 片段整合到 酵母基因组中的雌激素应答表达子(ERE) 质粒上。这个表 达质粒上还带有能编码β-半乳糖苷酶的报告基Lac2Z。在 这个系统中,hER 以一种能够与ERE 结合的形式被表达。 ERE序列位于表达质粒上的一个强启动子序列之中。在结 合一个活性配体之后, 与雌激素结合的受体就会与转录因 子和其他转录成分反应来调节基因的转录, 这就引起了报 告基因Lac2Z 的表达,产生的β-半乳糖苷酶就会分泌到介 质中(图1)。在介质里, β-半乳糖苷酶使能发色的酶作用物 β-D-吡喃半乳糖苷氯酚红(CPRG, 通常为黄色) 产生代谢 变化, 变成红色, 能在540nm测吸光率。通过检测β-半乳糖 苷酶的量就可以定量检测出化学品的类雌激素活性。
• 本研究目的在于了解水体中内分泌干扰物 DES、E1、E2、EE2、E3和EV 6种雌激 素的存在及含量，以期为该类物质的进一 步生态风险评价提供基础数据
研究方法
• 鱼类卵黄蛋白原诱导实验法 • 重组基因酵母检测法 • 酵母双杂交法
鱼类卵黄蛋白原诱导实验法
• 原理：卵黄蛋白原(vitellogenin) 是存在于性成熟 卵生脊椎动物血清中的一种糖脂磷蛋白，是一种 雌性特有的血清蛋白，已被确认是大多数卵生脊 椎动物的卵黄前体物质。 • 雄性个体和幼体在大剂量的人工雌激素作用下， 以及在低剂量的类雌激素长期作用下，都能诱导 体内卵黄蛋白原的生成。卵黄蛋白原作为鱼类等 卵生动物雌激素的一种生物标志物，这种方法不 仅可以检测类雌激素物质，而且可通过其代谢检 测类雌激素物质的前体物质。