【最新】高中生物选修一生物技术实践 知识点总结

【选修一】《生物技术实践》易考知识点

专题一 传统发酵技术的应用

课题一 果酒和果醋的制作

1、发酵：通过微生物技术的培养来生产大量代谢产物的过程。

2、有氧发酵：醋酸发酵 ·无氧发酵：酒精发酵 乳酸发酵

3、酵母菌是兼性厌氧型微生物，真菌 ·酵母菌的生殖方式：出芽生殖(主要) 分裂生殖 孢子生殖

4、在有氧条件下，酵母菌进行有氧呼吸，大量繁殖。 C 6H 12O 6＋6O 2+6H 2O →6CO 2＋12 H 2O+能量

5、在无氧条件下，酵母菌能进行酒精发酵。 C 6H 12O 6→2C 2H 5OH ＋6CO 2+能量

6、20℃左右最适宜酵母菌繁殖，酒精发酵时一般将温度控制在18℃-25℃

7、在缺氧，呈酸性的发酵液中，酵母菌可以生长繁殖，而绝大多数其他微生物都因无法适应这一环境而受到制约。

8、醋酸菌是原核生物,代谢类型是异养需氧型,生殖方式为二分裂。

9、当氧气、糖源都充足时，醋酸菌将葡萄汁中的糖分解成醋酸；当缺少糖源时，醋酸菌将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸。 C 2H 5OH ＋O 2→CH 3COOH ＋H 2O

10、控制发酵条件的作用：①醋酸菌对氧气的含量特别敏感，当进行深层发酵时，即使只是短时间中断通入氧气，也会引起醋酸菌死亡。②醋酸菌最适生长温度为30～35℃，控制好发酵温度，使发酵时间缩短，又减少杂菌污染的机会。③有两条途径生成醋酸：直接氧化和以酒精为底物的氧化。 11、实验流程：挑选葡萄→冲洗→榨汁→酒精发酵→果酒（→醋酸发酵→果醋）

12、酒精检验：果汁发酵后是否有酒精产生，可以用重铬酸钾来检验。在酸性条件下，重铬酸钾与酒精反应呈现灰绿色。

13、·充气口是在醋酸发酵时连接充气泵进行充气用的；·排气口是在酒精发酵时用来排出二氧化碳的；·出料口是用来取样的。·排气口要通过一个长而弯曲的胶管与瓶身相连接，其目的是防止空气中微生物的污染。·开口向下的目的是有利于二氧化碳的排出。·使用该装置制酒时，应该关闭充气口；制醋时，应该充气口连接气泵，输入氧气。 14、疑难解答

（1）你认为应该先冲洗葡萄还是先除去枝梗？为什么？

应该先冲洗，然后再除去枝梗，以避免除去枝梗时引起葡萄破损，增加被杂菌污染的机会。 （2）你认为应该从哪些方面防止发酵液被污染？

如：要先冲洗葡萄，再除去枝梗；榨汁机、发酵装置要清洗干净，并进行酒精消毒；每次排气时只需拧松瓶盖，不要完全揭开瓶盖等。

（3）制葡萄酒时，为什么要将温度控制在18～25℃？制葡萄醋时，为什么要将温度控制在30～35℃？

温度是微生物生长和发酵的重要条件。20℃左右最适合酵母菌的繁殖，因此需要将温度控制在其最适温度范围内。而醋酸菌是嗜温菌，最适生长温度为30～35℃，因此要将温度控制在30～35℃。

课题二 腐乳的制作

1、多种微生物参与了豆腐的发酵，如青霉、酵母、曲霉、毛霉等，其中起主要作用的是毛霉。毛霉是一种丝状真菌。代谢类型是异养需氧型。生殖方式是孢子生殖，营腐生生活。

2、原理：毛霉等微生物产生的蛋白酶能将豆腐中的蛋白质分解成小分子的肽和氨基酸；脂肪酶可将

脂肪水解为甘油和脂肪酸。

3、实验流程：让豆腐上长出毛霉→加盐腌制→加卤汤装瓶→密封腌制

4、酿造腐乳的主要生产工序是：将豆腐进行前期发酵和后期发酵。

前期发酵：①创造条件让毛霉生长。②使毛霉形成菌膜包住豆腐使腐乳成型。

后期发酵：酶与微生物协同参与生化反应的过程。通过各种辅料与酶的缓解作用，生成腐乳的香气。 5、所用豆腐的含水量为70％左右，水分过多则腐乳不易成形。

6、毛霉的生长条件：将豆腐块平放在笼屉内，将笼屉中的控制在15～18℃，并保持一定的温度。 来源：①来自空气中的毛霉孢子，②直接接种优良毛霉菌种 时间：5天

7、加盐腌制：将长满毛霉的豆腐块分层整齐地摆放在瓶中，同时逐层加盐，随着层数的加高而增加盐量，接近瓶口表面的盐要铺厚一些。加盐腌制的时间约为8天左右。

8、用盐腌制时，注意控制盐的用量：盐的浓度过低，不足以抑制微生物的生长，可能导致豆腐腐败变质；盐的浓度过高会影响腐乳的口味

·食盐的作用：①抑制微生物的生长，避免腐败变质②析出水分，是豆腐变硬，在后期制作过程中不易酥烂③调味作用，给腐乳以必要的咸味④浸提毛酶菌丝上的蛋白酶。

·配制卤汤：卤汤直接关系到腐乳的色、香、味。卤汤是由酒及各种香辛料配制而成的。卤汤中酒的含量一般控制在12%左右。

·酒的作用：①防止杂菌污染以防腐②与有机酸结合形成酯，赋予腐乳风味③酒精含量的高低与腐乳后期发酵时间的长短有很大关系：酒精含量越高，对蛋白酶的抑制作用也越大，使腐乳成熟期延长；酒精含量过低，蛋白酶的活性高，加快蛋白质的水解，杂菌繁殖快，豆腐易腐败，难以成块。 ·香辛料的作用：①调味作用②杀菌防腐作用③参与并促进发酵过程

·防止杂菌污染：①用来腌制腐乳的玻璃瓶，洗刷干净后要用沸水消毒。②装瓶时，操作要迅速小心。整齐地摆放好豆腐、加入卤汤后，要用胶条将瓶口密封。封瓶时，最好将瓶口通过酒精灯的火焰，防止瓶口被污染。 9、疑难解答

（1）利用所学的生物学知识，解释豆腐长白毛是怎么一回事？

豆腐生长的白毛是毛霉的白色菌丝。严格地说是直立菌丝，在豆腐中还有匍匐菌丝。 （2）为什么要撒许多盐，将长毛的豆腐腌起来？

盐能防止杂菌污染，避免豆腐腐败。

（3）我们平常吃的豆腐，哪种适合用来做腐乳？

含水量为70%左右的豆腐适于作腐乳。用含水量高的豆腐制作腐乳，不易成形。

（4）吃腐乳时，你会发现腐乳外部有一层致密的“皮”。这层“皮”是怎样形成的呢？它对人体有害吗？它的作用是什么？

“皮”是前期发酵时在豆腐表面上生长的菌丝（匍匐菌丝），对人体无害。它能形成腐乳的“体”，使腐乳成形。 课题三 制作泡菜

1、 制作泡菜所用微生物是乳酸菌 ，其代谢类型是异养厌氧型。在无氧条件下，将糖分解为乳酸 。

分裂方式是二分裂。反应式为：C 6H 12O 6?→?

酶

2C 3H 6O 3+能量 2、测定亚硝酸盐含量的原理：是在盐酸酸化条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发生重氮化反应后，

与 N-1-萘基乙二胺盐酸盐结合形成玫瑰红色染料，与已知浓度的标准显色液目测比较，估算泡菜中亚硝酸盐含量。

专题二 微生物的培养与应用

课题一微生物的实验室培养

1、培养基：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质，是进行微生物培养的物质基础。

2、·培养基按照物理性质可分为液体培养基、半固体培养基和固体培养基。

·按照成分培养基可分为人工合成培养基和天然培养基。

·按照培养基的用途，可将培养基分为选择培养基和鉴定培养基。

选择培养基是指在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物生长，促进所需要的微生物的生长。

鉴别培养基是根据微生物的特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品配制而成的，用以鉴别不同类别的微生物。

3、培养基的化学成分包括：水、无机盐、碳源、氮源、生长因子等。

·碳源：能为微生物的代谢提供碳元素的物质。如CO2、NaHCO3等无机碳源；糖类、石油、花生粉饼等有机碳源。异养微生物只能利用有机碳源。单质碳不能作为碳源。

·氮源：能为微生物的代谢提供氮元素的物质。如N2、NH3、NO3-、NH4+（无机氮源）、蛋白质、氨基酸、尿素、牛肉膏、蛋白胨（有机氮源）等。只有固氮微生物才能利用N2。

·培养基还要满足微生物生长对PH、特殊营养物质以及氧气的要求。例如，培养乳酸杆菌时需要在培养基中添加维生素，培养霉菌时须将培养基的pH调至酸性，培养细菌是需要将pH调至中性或微碱性，培养厌氧型微生物是则需要提供无氧的条件。

4、消毒与灭菌的区别

·消毒指使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物（不包括芽孢和孢子）。消毒方法常用煮沸消毒法，巴氏消毒法（对于一些不耐高温的液体）还有化学药剂（如酒精、氯气、石炭酸等）消毒、紫外线消毒。

·灭菌则是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌。

5、灭菌方法：

①接种环、接种针、试管口等使用灼烧灭菌法；

②玻璃器皿、金属用具等使用干热灭菌法，所用器械是干热灭菌箱；

③培养基、无菌水等使用高压蒸汽灭菌法，所用器械是高压蒸汽灭菌锅。

④表面灭菌和空气灭菌等使用紫外线灭菌法，所用器械是紫外灯。

比较项理化因素的作用强度消灭微生物的数量芽孢和孢子能否被消灭

消毒较为温和部分生活状态的微生物不能

灭菌强烈全部微生物能

6、制作牛肉膏蛋白胨固体培养基方法步骤：计算、称量、溶化、灭菌、倒平板（季凉花均倒）。

7、倒平板操作的讨论

①培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？答：可用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。

②为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？

答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。

③平板冷凝后，为什么要将平板倒置？

答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。④在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？

答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。纯化大肠杆菌

8、微生物接种的方法最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法。

9、用平板划线法和稀释涂布平板法接种的目的是：使聚集在一起的微生物分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落，以便于纯化菌种。

10、平板划线操作的讨论：

①为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？

答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。

②在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？

答：以免接种环温度太高，杀死菌种。

③在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？

答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。

11、涂布平板操作的讨论

涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？

提示：应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围；等等。

12、菌种的保存

（1）对于频繁使用的菌种，可以采用临时保藏的方法。

①临时保藏方法

将菌种接种到试管的固体斜面培养基上，在合适的温度下培养。当菌落长成后，将试管放入4℃的冰箱中保藏。以后每3～6个月，都要重新将菌种从旧的培养基上转移到新鲜的培养基上。

②缺点：这种方法保存的时间不长，菌种容易被污染或产生变异。

（2）对于需要长期保存的菌种，可以采用甘油管藏的方法。

在3mL的甘油瓶中，装入1mL甘油后灭菌。将1mL培养的菌液转移到甘油瓶中，与甘油充分混匀后，放在－20℃的冷冻箱中保存。

13、疑难解答

（1）微生物的营养物质：水、无机盐、碳源、氮源及特殊营养物质五类。

（2）确定培养基制作是否合格的方法：将未接种的培养基在恒温箱中保温1～2天，无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。

课题二土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

1、尿素：是一种重要的农业氮肥，尿素并不能直接被农作物吸收。只有当土壤中的细菌将尿素分解成氨之后，才能被植物利用。土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为他们能合成脲酶，尿素最初是从人的尿液中发现的。

2、筛选菌株

（1）实验室中微生物的筛选应用的原理

人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。

（2）选择性培养基

在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。

（3）配制选择培养基的依据

根据选择培养的菌种的生理代谢特点加入某种物质以达到选择的目的。例如，培养基中不加入有机物可以选择培养自养微生物；培养基中不加入氮元素，可以选择培养能固氮的微生物；加入高浓度的食盐可选择培养金黄色葡萄球菌等。

3、统计菌落数目

（1）测定微生物数量的常用方法有稀释涂布平板法和显微镜直接计数。

（2）采用稀释涂布平板法计数的注意事项：①一般选取菌落数在30~300之间的平板进行计数②为了防止菌落蔓延，影响计数，可在培养基中加入TTC ③本法仅限于形成菌落的微生物。

（3）设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。对照实验是指除了被测试的条件以外，其他条件都相同的实验，其作用是比照试验组，排除任何其他可能原因的干扰，证明确实是所测试的条件引起相应的结果。

4、实验设计

（1）土壤取样：同其他生物环境相比，土壤中的微生物，数量最大，种类最多。在富含有机质的土壤表层，有更多的微生物生长。从富含有机物、潮湿、pH≈7的土壤中取样。铲去表层土，在距地表约3～8cm的土壤层取样。

（2）样品的稀释：样品的稀释程度将直接影响平板上生长的菌落数目。在实际操作中，通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数在30～300之间、适于计数的平板。

·测定土壤中细菌的数量，一般选用104、105 、106

·测定放线菌的数量，一般选用103、104 、105

·测定真菌的数量，一般选用102、、103、 104

（3）微生物的培养与观察

不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。

5、疑难解答：如何从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数？

统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计3个平板，计算出平板菌落数的平均值。

每克样品中的菌落数=（C/V）×M 其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积（ml），M代表稀释倍数

课题三分解纤维素的微生物的分离

1、纤维素与纤维素酶

（1）棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物，木材、作物秸秆等也富含纤维素。

（2）纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。纤维素最终被水解成葡萄糖，为微生物的生长提供营养。

2、纤维素分解菌的筛选

（1）筛选方法：刚果红染色法。能够通过颜色反应直接对微生物进行筛选。

（2）刚果红染色法筛选纤维素分解菌的原理

刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红－纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。这样，我们就可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。

3、分离分解纤维素的微生物的实验流程

土壤取样→选择培养（此步是否需要，应根据样品中目的菌株数量的多少来确定）→梯度稀释→将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上→挑选产生透明圈的菌落

（1）土壤采集：选择富含纤维素的环境。

（2）刚果红染色法分离纤维素分解菌的步骤：倒平板操作、制备菌悬液、涂布平板

（3）刚果红染色法种类

一种是先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应；另一种是在倒平板时就加入刚果红。

4、课题延伸

对分解纤维素的微生物进行了初步的筛选后，只是分离纯化的第一步，为确定得到的是纤维素分解菌，还需要进行发酵产纤维素酶的实验，纤维素酶的发酵方法有液体发酵和固体发酵两种。纤维素酶的测定方法，一般是对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量的测定。

5、疑难解答

（1）为什么要在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌？

由于生物与环境的相互依存关系，在富含纤维素的环境中，纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土样中获得目的微生物的几率要高于普通环境。

（2）将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋进土壤多深？

将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对聚集，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一般应将纸埋于深约10cm左右腐殖土壤中。

（3）两种刚果红染色法的比较

方法一是传统的方法，缺点是操作繁琐，加入刚果红溶液会使菌落之间发生混杂；其优点是这样显示出的颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用。

方法二的优点是操作简便，不存在菌落混杂问题，缺点是由于纤维素和琼脂、土豆汁中都含有淀粉类物质，可以使能够产生淀粉酶的微生物出现假阳性反应。但这种只产生淀粉酶的微生物产生的透明圈较为模糊，因为培养基中纤维素占主要地位，因此可以与纤维素酶产生的透明圈相区分。方法二的另一缺点是：有些微生物具有降解色素的能力，它们在长时间培养过程中会降解刚果红形成明显的透明圈，与纤维素分解菌不易区分。

（4）为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物？

在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“浓缩”的作用。

专题三植物的组织培养技术

课题一菊花的组织培养

1、植物组织培养的基本过程

脱分化再分化

外植体————→愈伤组织————→丛芽（试管苗）

★愈伤组织的细胞：排列疏松而无规则，是一种高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞。

2、植物组织培养技术的应用有：实现优良品种的快速繁殖；培育脱毒作物；制作人工种子；培育作物新品种以及细胞产物的工厂化生产等。

3、影响植物组织培养的条件

①材料：不同的植物组织，培养的难易程度差别很大。植物材料的选择直接关系到试验的成败。植物的种类、材料的年龄和保存时间的长短等都会影响实验结果。菊花组织培养一般选择未开花植物的茎上部新萌生的侧枝作材料。一般来说，容易进行无性繁殖的植物容易进行组织培养。选取生长旺盛嫩枝进行组培的是嫩枝生理状态好，容易诱导脱分化和再分化。

②营养：离体的植物组织和细胞，对营养、环境等条件的要求相对特殊，需要配制适宜的培养基。常用的培养基是MS培养基，其中含有的大量元素是N、P、S、K、Ca、Mg，微量元素是Fe、Mn、B、Zn、Cu、Mo、I、Co，有机物有甘氨酸、烟酸、肌醇、维生素、蔗糖等。

③激素：植物激素中生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键性激素。在生长素存在的情况下，细胞分裂素的作用呈现加强趋势。在培养基中需要添加生长素和细胞分裂素等植物激素，其浓度、使用的先后顺序、用量的比例等都影响结果。

④环境条件：PH、温度、光等环境条件。

不同的植物对各种条件的要求往往不同。进行菊花的组织培养，一般将pH控制在5.8左右，温度控制在18~22℃，并且每日用日光灯照射12h.

4、操作流程：

配制MS固体培养基—→外植体的消毒—→接种—→培养—→移栽—→栽培

·MS培养基：大量元素和微量元素提供植物细胞所必需的无机盐；蔗糖提供碳源，维持细胞渗透压；甘氨酸、维生素等物质主要是为了满足离体植物细胞在正常代谢途径受到一定影响后所产生的特殊营养需求。

·对外植体进行表面消毒时，就要考虑药剂的消毒效果，又要考虑植物的耐受能力。

·接种过程中插入外植体时形态学上端朝上，每个锥形瓶接种7～8个外植体。外植体接种与细菌接种相似，操作步骤相同，而且都要求无菌操作。

·将幼苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境中生活一段时间，进行壮苗。

专题二月季的花药培养

1、被子植物的花粉发育：花粉是由花粉母细胞经过减数分裂而形成的，因此，花粉是单倍体的生殖细胞。被子植物花粉的发育要经历小孢子四分体时期、单核期（单核居中期→单核靠边期）和双核期等阶段。

2、产生花粉植株的两种途径（即通过花药培养产生花粉植株单倍体植株）：①一种是花粉通过脱分化形成胚状体，然后分化发育为植物；②另一种是花粉在诱导培养基上脱分化先形成愈伤组织，再将其再分化成植株。这两种途径之间并没有绝对的界限，主要取决于培养基中激素的种类及其浓度配比。

注意：①无论哪种产生方式，都要先诱导生芽，再诱导生根②胚状体：植物体细胞组织培养过程中，诱导产生的形态与受精卵发育成的胚非常类似的结构，其发育也与受精卵发育成的胚类似，有胚芽、胚根、胚轴等完整结构，就像一粒种子，又称为细胞胚。

③影响花药培养的因素，诱导花粉能否成功及诱导成功率的高低，受多种因素影响，其中材料的选择与培养基的组成是主要的影响因素

·亲本的生理状况：花粉早期是的花药比后期的更容易产生花粉植株，选择月季的初花期。

·合适的花粉发育时期：一般来说，在单核期，细胞核由中央移向细胞一侧的时期，花药培养成功率最高

·花蕾：选择完全未开放的花蕾

·亲本植株的生长条件、材料的低温预处理以及接种密度等对诱导成功率都有一定影响

3、实验操作：

·①材料的选取：选择花药时，一般要通过镜检来确定其中的花粉是否处于适宜的发育期。确定花粉发育时期的最常用的方法是醋酸洋红法。但是，某些植物的花粉细胞核不易着色，需采用焙花青-铬矾法，这种方法能将花粉细胞核染成蓝黑色。

·②材料的消毒

·③接种和培养：·灭菌后的花蕾，要在无菌条件下除去萼片和花瓣，并立即将花药接种到培养基上。·在剥离花药时，要尽量不损伤花药（否则接种后容易从受伤部位长生愈伤组织），同时还要彻底去除花丝，因为与花丝相连的花药不利于愈伤组织或胚状体的形成，通常每瓶接种花药7～10个,培养温度控制在25℃左右,不需要光照.幼小植株形成后才需要光照.一般经过20～30天培养后,会发现花药开裂,长出愈伤组织或形成胚状体。将愈伤组织及时转移到分化培养基上，以便进一步分化出再生植株。如果花药开裂释放出胚状体，则一个花药内就会产生大量幼小植株，必须在花药开裂后尽快将幼小植株分开，分别移植到新的培养基上，否则这些植株将很难分开。还需要对培养出来的植株做进一步的鉴定和筛选。

4、植物组织培养技术与花药培养技术的相同之处是：培养基配制方法、无菌技术及接种操作等基本相同。两者的不同之处在于：花药培养的选材非常重要，需事先摸索时期适宜的花蕾；花药裂开后释放出的愈伤组织或胚状体也要及时更换培养基；花药培养对培养基配方的要求更为严格。这些都使花药培养的难度大为增加。

专题五ＤＮＡ和蛋白质技术

课题一ＤＮＡ的粗提取与鉴定

1、提取DNA的溶解性原理包括哪些方面？

答：①DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；②DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性不同

③DNA不溶于酒精。

2、DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度有何特点？要使DNA溶解，需要使用什么浓度？要使DNA析出，又需要使用什么浓度？

答：DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度特点（如右图）；较高浓度

（2mol/L）可使DNA溶解；0.14mol/L可使DNA析出。

3、在溶解细胞中的DNA时，人们通常选用2mol/LNaCl溶液；将DNA分子

析出的方法是向溶有DNA的NaCl溶液中缓慢注入蒸馏水，以稀释NaCl溶

液。

4、酒精是一种常用有机溶剂，但DNA却不能溶于酒精（特别是95％冷却

酒精），但细胞中蛋白质可溶于酒精。

【从理论上分析，预冷的乙醇溶液具有以下优点。一是抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解；二是降低分子运动，易于形成沉淀析出；三是低温有利于增加DNA分子柔韧性，减少断裂。】

5、采用DNA不溶于酒精的原理，可以达到什么目的？答：将DNA和蛋白质进一步分离。

6、提取DNA还可以利用DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性原理。利用该原理时，应选用怎样的酶和

使用顺序实验结果

先生长素，

后细胞分裂素

有利于分裂但不分化先细胞分裂素，

后生长素

细胞既分裂也分化同时使用分化频率提高生长素／细胞分裂素比值与结果比值高时

促根分化，

抑芽形成

比值低时

促芽分化，

抑根形成

比值适中促进愈伤组织生长

怎样的温度值？

答：蛋白酶，因为酶具有专一性，蛋白酶只水解蛋白质而不会对DNA 产生影响。

温度值为60～80℃，因为该温度值蛋白质变性沉淀，而DNA 不会变性。

【补充：DNA 的变性是指DNA 分子在高温下解螺旋，其温度在80℃以上，如在PCR 技术中DNA 变性温度在95℃。】

7、洗涤剂在提取DNA 中有何作用？

答：洗涤剂将破坏细胞膜上的蛋白质，从而瓦解细胞膜。

8、当鉴定提取出的物质是否是DNA 时，需要使用什么指示剂进行鉴定？ 答：在沸水浴条件下，DNA 遇二苯胺呈现蓝色。

9、原理总结：通过利用不同浓度NaCl 溶液溶解或析出DNA ，可以从细胞中提取和提纯DNA ；再利用酒精进一步将DNA 与蛋白质分离开来，达到提纯的目的；最后利用二苯胺试剂鉴定提取的物质是否是DNA 。

10、步骤：

①实验材料的选取

不同生物的组织中DNA 含量不同。在选取材料时，应本着DNA 含量高、材料易得、便于提取的原则。 ·本实验用鸡血细胞做实验材料有两个原因：一是因为鸡血细胞核的DNA 含量丰富，材料易得；二是鸡血细胞极易吸水胀破，而用动物肝脏细胞作实验材料常常需要匀浆和离心，对设备要求较高，操作繁琐，历时较长。

·鸡血细胞破碎以后释放出的DNA ，容易被玻璃容器吸附，所以在提取过程中为了减少DNA 的损失，最好使用塑料的烧杯和试管盛放鸡血细胞液。 ②破碎细胞，获取含DNA 的滤液

·若选用鸡血和洋葱作实验材料，则怎样获取含DNA 的滤液？

答：在鸡血细胞液中加入一定量蒸馏水并用玻棒搅拌，过滤后收集滤液；

切碎洋葱，加入一定量洗涤剂和食盐，搅拌研磨，过滤后收集滤液。 ·为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？

答：蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA 。

·在以上实验中，加入蒸馏水、洗涤剂和食盐的作用分别是什么？过滤时应当选用（滤纸、尼龙布）。

答：血细胞在蒸馏水中大量吸水而张裂；洗涤剂瓦解细胞膜；食盐溶解DNA 物质；选用尼龙布进行过滤。

·在处理植物组织时需要进行研磨，其目的是什么？研磨不充分产生什么结果？

答：破碎细胞壁，使核物质容易溶解在NaCl 溶液中；研磨不充分会使DNA 的提取量减少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。 ③去除滤液中的杂质

·为什么反复地溶解与析出DNA ，才能够去除杂质？

答：用高浓度的盐溶液溶解DNA ，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低浓度的盐溶液使DNA 析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA ，就能够除去与DNA 溶解度不同的多种杂质。

·最初获得的DNA 滤液含有蛋白质、脂质等杂质，需要进一步提纯DNA 。

方案一的原理是DNA 在不同浓度NaCl 溶液中溶解度不同；方案二的原理是蛋白酶分解蛋白质，不分解DNA ；方案三的原理是蛋白质和DNA 的变性温度不同

·方案二与方案三的原理有什么不同？

答：方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA 与蛋白质分开；方案三利用的是DNA 和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA 分离。 ④析出与鉴定

·在滤液中仍然含有一些杂质，怎样除去这些杂质呢？得到的DNA 呈何颜色？

答：滤液与等体积的冷却酒精混合均匀，静置2～3分钟，析出的白色丝状物就是DNA 。DNA 呈白色。 ·怎样鉴定析出的白色丝状物就是DNA 呢？

答：具体做法。试管2支，编号甲乙→各加等量5mLNaCl 溶液→甲中放入少量白色丝状物，使之溶解→各加4mL 二苯胺，混合均匀→沸水浴5min →观察颜色变化 11、实验操作

制备鸡血细胞液…………加柠檬酸钠，静置或离心 ↓

破碎细胞，释放DNA … 加蒸馏水，同一方向快速通方向搅拌 ↓→过滤，除去细胞壁、细胞膜等。

溶解核内DNA ………… 加入NaCl 至2mol/L ，同一方向缓慢搅拌 ↓

DNA 析出……………… 加蒸馏水至0.14mol/L ，过滤，在溶解到2mol/L 溶液中 ↓→除去细胞质中的大部分物质。

DNA 初步纯化………… 与等体积95％冷却酒精混合，析出白色丝状物 ↓→除去核蛋白、RNA 、多糖等。

DNA 鉴定……………… 二苯胺，沸水浴，呈现蓝色

12、注意事项：在鸡血中加入柠檬酸钠防止凝固；鸡血静置或离心以提高细胞悬液浓度；使用塑料烧杯；使用尼龙布过滤；玻棒沿同一方向搅拌；玻棒搅拌要缓慢（细胞破裂快速搅拌）；玻棒不要碰到烧杯壁；二苯胺试剂要现用现配等。

专题六 植物有效成分的提取

课题一 植物芳香油的提取

1、芳香油的提取方法：蒸馏、压榨、萃取等。

2、芳香油的性质：挥发性强，成分复杂，以萜类化合物及其衍生物为主。

3、水蒸气蒸馏法：

原理：水蒸汽可将挥发性较强的芳香油携带出来形成油水混合物，冷却后水油分层。 方法：水中蒸馏：原料放在沸水中加热蒸馏。

水上蒸馏：原料隔放在沸水上加热蒸馏。 水汽蒸馏：利用外来高温水蒸气加热蒸馏。

不足：有些原料不适宜于水中蒸馏，如柑橘、柠檬等易焦糊，有效成分容易水解。通常用压榨法（通过机械压缩力将液相物从液固两相混合物中分离出来的一种简单操作） 4、萃取法：

原理：芳香油易溶于有机溶剂，溶剂挥发后得到芳香油。如石油醚、酒精、乙醚等。 方法：原料浸泡在溶剂中→得到浸泡液→有机溶剂挥发→芳香油。 不足：有机溶剂中的杂质影响芳香油的品质 5、玫瑰精油的提取实验步骤：

①采集玫瑰花：采集盛花期（5月中上旬）的玫瑰花，清水清洗沥干。

②装入蒸馏原料：称取50g 玫瑰花放入蒸馏瓶，添加200mL 蒸馏水。

③安装蒸馏装置：按照从左向右、自下到上次序安装水蒸气蒸馏装置。

④加热蒸馏：控制蒸馏时间和速度（1～2滴/秒），获得乳白色乳浊液；拆卸装置。

⑤分离油层：向乳浊液加入NaCl 溶液后，利用分液漏斗分离出上面的油层。

⑥除去水分：向油层中加入无水硫酸钠，24h 后过滤，得到玫瑰油。 ＊注意事项：蒸馏时间不能过短，温度不能过高。 6、橘皮精油的提取

·橘皮精油的主要成分：柠檬烯，主要分布在橘皮中。

·石灰水：防止压榨时滑脱，提高出油率，降低压榨液黏稠度，过滤不堵塞筛眼。 ·小苏打、硫酸钠：促进油和水的分离（用量分别为橘皮质量的0.25％和5％）。 ·实验步骤：

①橘皮的处理：将新鲜橘皮用清水清洗沥干。

②石灰水浸泡：用7～8％石灰水浸泡橘皮10h 以上（如为24h ）。 ③清水漂洗：浸泡好的橘皮用流水彻底漂洗干净，沥干。

④粉碎和压榨：将橘皮粉碎，加入小苏打和硫酸钠后，用压榨机压榨得到压榨液。 ⑤过滤压榨液：用布袋过滤，滤液再高速离心处理，分离出上层橘皮油。

⑥静置处理：将橘皮油在5～10℃冰箱中静置5～7d ，分离出上层澄清橘皮油。 ⑦再次过滤：将下层橘皮油用滤纸过滤，滤液与上层橘皮油合并，得到橘皮精油。 ·分析：静置处理目的：除去果蜡和水分。 课题二 胡萝卜素的提取

1、胡萝卜素性质：橘黄色结晶，化学性质比较稳定，不溶于水，微溶于乙醇，易溶于石油醚等有机溶剂。依据碳碳双键的数目划分为α、β、γ 三类。其中最主要的组成成分为β-胡萝卜素。

作用：①治疗夜盲症、幼儿生长发育不良、干皮症等疾病；②常用于食品色素；③使癌变细胞恢复成正常细胞。

2、实验步骤：①粉碎（使原料与有机溶剂充分接触，增大溶解度。）②干燥（脱水温度太高，干燥时间太长会导致胡萝卜素分解）③萃取④过滤（除去萃取液中的不溶物）⑤浓缩（蒸发出有机溶剂）

3、萃取剂的选择：条件是具有较高的沸点，能够充分溶解胡萝卜素，并且不与水混溶——石油醚

4、影响萃取的因素：

·主要因素：萃取剂的性质和使用量

·次要因素：原料颗粒的大小、紧密程度、含水量、萃取的温度和时间等

一般来说，原料颗粒小，萃取温度高，时间长，需要提取的物质就能够充分溶解，萃取效果就好。萃取前，要将胡萝卜进行粉碎和干燥 5、胡萝卜素提取

·装置的设计：萃取过程应该避免明火加热，采用水浴加热，这是因为有机溶剂都是易燃物，直接使用明火加热容易引起燃烧爆炸。

·为防止加热时有机溶剂挥发，还要在加热瓶口安装回流冷凝装置。

·萃取液的浓缩可直接使用蒸馏装置。在浓缩之前，还要进行过滤，除去萃取液中的不溶物。 6、鉴定：纸层析法

其他色素杂质

7、疑难解答：

①乙醇和丙酮能够用于胡萝卜素的萃取吗？为什么？

答：胡萝卜素可溶于乙醇和丙酮，但它们是水溶性有机溶剂，因萃取中能与水混溶而影响萃取效果，所以不用它们作萃取剂。

②在石油醚、醋酸乙酯、乙醚、苯和四氯化碳这几种有机溶剂中，哪种最适宜用来提取胡萝卜素？ 答：在这五种有机溶剂中，石油醚的沸点最高，在加热萃取时不易挥发，所以石油醚最适宜用作萃取剂。

8、蒸馏法、压榨法和萃取法的比较： 提取方法

实验原理

方法步骤

适用范围

水蒸气蒸馏 利用水蒸气将挥发性较强的芳香油携带出来 1.水蒸气蒸馏

2.分离油层

3.除水过滤

适用于提取玫瑰油、薄荷油等挥

发性强的芳香油

压榨法

通过机械加压，压榨出果皮中的芳香油 1.石灰水浸泡、漂洗

2.压榨、过滤、

静置

3.再次过滤

适用于柑橘、柠檬等易焦糊原料

的提取

有机溶剂萃取

使芳香油溶解在有机溶中，

蒸发溶剂后就可获得芳香油 1.粉碎、干燥

2.萃取、过滤

3.浓缩

适用范围广，要求原料的颗粒要尽

可能细小，能充分浸泡在有机溶液中