发酵工程实验 讲义 2015

酒精沉淀
1.有机溶剂沉淀主要是降低水溶液的介电常数从而使溶液中 的蛋白质溶解度度降低，使大分子物质脱水而相互凝聚析 出。
2.用-20℃预冷的酒精沉淀，后立即冷冻离心（7000rpm 10min），后弃上清，在通风橱内吹干残余乙醇，大约需 要半个小时。
3.后用25%（占沉淀的酶液体积量）的蒸馏水洗下沉淀，测 定该沉淀液的酶活和蛋白质含量。 4.添加乙醇的过程中，注意在冰浴中进行，在磁力搅拌器上 边缓慢添加乙醇，边搅拌，50ml的乙醇在5min左右加完，
干燥器中冷却，后用镊子拿取，电子天平上称量，记录重量）；
3. 酶活（MTG）； 4. 甘油含量
TG酶的测定
试剂：
底物溶液：12.11 gTris，3.475 g盐酸羟胺，1.536 g还原型谷胱甘肽，5.06
gCBZ-Gln-Gly，调至pH 6.0后定容至500 ml，过滤。
终止溶液（显色溶液）：各配制3 mol/l盐酸溶液，5 %三氯化铁，12 %三氯乙 酸500 ml，三者等体积混匀后过滤。
第四天：进行SDS-page电泳，检测TG酶的产生及纯化效果。
1. 配置时，量筒定量；
2. 发酵摇瓶（规格250ml），装液量30ml； 3L发酵罐 2L； 3. 发酵促进剂难溶于水且不影响pH，故先称量0.3g于摇 瓶中；
4. 甘油及K2HPO4用烧杯称量，酵母膏等用称量纸称量；
5. 发酵罐的发酵培养基另加消泡剂：0.01g/100ml。(调 整pH后再加)
发酵罐的取样
发酵罐监测：T、搅拌转速、通气量，记录在发酵批报上 包括取样时间和取样者姓名。 100ml（150ml）的锥形瓶进行取样约20ml 发酵液的测定： pH、酶活力、菌体干重、甘油含量
注：实验需要每次做三个平行对照，即n=3，数据表示成 mean±SD 形式。
摇瓶平行实验
所有摇瓶(250ml)在发酵罐接种时进行接种（2.4ml菌种液 /30ml培养基），以发酵罐的同样条件摇床振荡培养。 发酵罐取样的同时取该组的1个摇瓶，测定相应的指标。
一、 谷氨酰胺转胺酶发酵批报 罐批________ 接种时间____年____月_____日 放罐时间____年____月_____日 取样时间 培养时间 pH 罐温℃ 搅拌转速rpm 通气量L/min
生物量 mg/100ml
甘油含量 酶活性 U 值班签名
TG的成熟过程—（选做实验）
TG酶在发酵过程中经历pro-TG到TG的转化，其中pro-TG的 分子量在45~50KD,而TG的分子量在40KD左右。 TG酶在发酵初期，大部分以pro-TG的形式存在，随着发酵 的进行而转化成成熟的TG酶。 因此，可以检测不同发酵时间TG酶的存在形式，即不同时 间的发酵液，取40ul上清，后用10ul 的5*的蛋白loading buffer混合后，100℃煮沸5min，后-20℃保存，等取样结 束后统一进行SDS-PAGE电泳，根据蛋白条带的位置跟踪TG 酶的成熟。
发酵工程下游实验-酶的提取与纯化
1.实验目的： 对发酵产物进行纯化及浓缩，最终制得高浓度的酶液。 2.酶分离纯化总的原则： 用最少的步骤而能取得最好的纯化效果，因为增加步骤势必增加酶 的丢失。 在低温下操作（在冰浴中），减少酶的变性失活。 3.对纯化步骤评价 收率高且纯化倍数高 4.酶纯度的检测 每个纯化步骤前后必须留2ml的样品，进行最终的SDS-PAGE电泳。
甘油和蛋白含量测定注意事项
1.样品需要稀释适当倍数，比如5，20，50，100等，使其落在标曲之间。 3.发酵液测定甘油含量，酶液测定蛋白浓度需要做适当的稀释倍数。
实验安排
按照学号，每3个人一组，全班分成8个小组，每两个组负责一个发酵罐。
第一天：配发酵培养基（包括发酵罐和摇瓶），然后进行灭菌。下午4:00进行接种，培养。 取样：0h，20:00(4h). 第二天：取样：完成发酵批报。取样时间如下：8:00(16h), 12:00(20h), 16:00(24h), 20:00(28h). 第三天： 8:30(40h)下罐。同时进行菌体离心、超滤、酒精沉淀操作。完成纯化步骤的评价表。
超滤浓缩示意图
超滤注意事项
1. 超滤桶中加入冷冻瓶保持低温。 2. 控制超滤压力在1 bar以内，否则超滤膜容易毁坏。
1.超滤浓缩 浓缩倍数=（浓缩液+滤出液）/超滤原液 滤筒中加冰降温，测定滤出液，超滤原液和浓缩液的酶活。 2.浓缩倍数对超滤影响大，比较不同的浓缩倍数(浓缩2倍，3倍， 4倍，5倍)对超滤的影响。 3.超滤系统较大，需用0.8L的发酵液进行超滤。
发酵工程模块—上游实验
贾彩凤 2015.5
实验目的
进一步理解微生物生产过程的工艺原理， 熟悉生产过程。
掌握微生物发酵罐的结构和操作方法。
学习发酵过程中指标的意义及控制，对微 生物生产过程有总体的认识。
实验材料
轮枝链霉菌（Streptoverticillium mobaraense）； 菌种特性：好氧菌；以无性孢子或菌丝片断进 行繁殖；
酒精沉淀参数选择
有机溶剂的添加量对纯化影响大，比较不同的乙醇添加量的影 响。可选用2倍，3倍，4倍，5倍体积的乙醇。
TG酶的纯度鉴定
1.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，采用12％分离胶，5％浓缩胶，配制 0.75mm厚的胶，插15孔样品梳。 2.测定每个步骤前后的酶液，后以等体积上样，进行SDS-PAGE电 泳。 3.根据蛋白浓度取每个步骤前后的酶液，加1/4体积的5*蛋白上样 缓冲液，置于沸水浴中煮10min， 10000g，离心5min后，每孔上 样10μL，100V恒压电泳。将电泳好的凝胶用考马斯亮蓝染色 40min，显示酶蛋白的电泳全条带。
实验操作—发酵液指标测定
1. pH：发酵罐在线测定，或者发酵液用pH计测定。 2. 生物量（DCW）：2ml离心管取2ml发酵液，4℃下 10000rpm离心3min，上清用来测定酶活，沉淀用 Tris-Hcl复溶重悬，再次离心，后重复一次操作，沉 淀烘干至恒重（离心管事先编号，在烘箱80℃烘干过夜，拿出到
TG酶纯化步骤评价指标
样品 发酵上清液 酶 活 总活 力 总体 积 蛋白质浓 度 比酶 活 收 率 纯化倍 数
粗滤后/（超滤前）
超滤后
乙醇沉淀后
实验报告 以小论文形式
• • • • • • • 摘要 1. 前言 2. 材料与方法 3. 结果与分析 4. 讨论 参考文献 实验结束一周内上交（6.10日前）
测定未知样品甘油浓度（标准曲线甘油浓度在0-40 µg/ml之间） 1. 将样品用蒸馏水做适当倍数的稀释。 2. 在各孔中加入25 μl样品 3. 重复标曲制作中的步骤2-6的操作。 4. 根据样品稀释液A412值的平均值，在标准曲线上确定出该样品稀释液的甘油浓度。 5. 根据下式计算样品的甘油浓度。 样品甘油浓度（µg/ml）=样品稀释液的甘油浓度*样品稀释倍数
5.混匀后各孔加入Nash试剂100 μl，放入自封袋中，53℃水浴15 min。
6. 15 min后，以未加稀释的甘油标准液的孔作为空白对照，在酶标仪上测各孔A412的平 均值。 7. 以各孔的A412平均值为纵坐标，对应的甘油浓度为横坐标，在坐标纸上或Microsoft Excel软件中绘制标准曲线。
粗滤
超滤 酒精沉淀
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SDS-PAGE电泳
相关知识介绍
1. 培养基 孢子培养基、种子培养基、发酵培养基 2.种子的制备 孢子的制备，种子的制备，菌龄，接种量
3 2
4
1
茂原链霉菌生长曲线
1.调整期 2.对数期 3.稳定期 4.衰亡期
相关知识介绍
3. 液体深层培养的几个关键点 a. 灭菌 b. 温度控制 c. 通气和搅拌
TG酶的测定
发酵液酶活的检测
1.待测样品用蒸馏水稀释合适的倍数。
2. 分别取待测样品0.15 ml于试管中，准确加入1.5 ml底物溶液于各试管，振荡混合均匀，37℃水浴 10 min。
3. 加入1.5 ml终止溶液。
4. 空白管：顺序加入1.5 ml底物溶液，终止溶液1.5 ml。 5. 去除沉淀，在525 nm处以空白管为对照，测定上清液的吸收值。
实验要求
1.小组长负责本小组的实验安排、协调。
3.注意保存好本小组的玻璃器皿，实验结束后 清点交回，打碎丢失要赔偿！
4.实验用到高压电流、蒸汽、仪器高的压力、 水压不稳定，注意安全！
MTG酶的特性
1.水溶性 2.胞外酶 3.分子量4万Da左右，为球状构型 ，单聚链 ， 由331个氨基酸构成。 4.PI= 8.9
几个概念
酶活=U/ml 总酶活U=酶活（U/ml ）×体积（ ml ）
蛋白浓度=ug/ml
比酶活（U/g）=酶活/蛋白浓度×106
收率=步骤后总酶活/步骤前总酶活
纯化倍数=步骤后比酶活/步骤前比酶活
发酵液 冷冻离心，取上清，冰箱保存 粗滤 0.22um膜过滤 超滤 30000Da的膜
酒精沉淀
SDS-PAGE电泳
•注:每个步骤都要进行蛋白质浓度和酶活等的测定。
粗滤
1.用0.22um的膜过滤，去除大分子的蛋白，进行初步的纯化， 也方便下面超滤操作。 2.尽量在低温下进行，冰浴进行。
超滤
用截留分子量为30000Da的超滤膜浓缩，收集浓缩液。按滤 出液体积记录浓缩倍数。
制作甘油浓度的标准曲线 1. 用蒸馏水稀释甘油标准液至0.04 g/l待用，在一96孔板中取若干孔，分别加入 0,5,10,15,20,25 μl稀释的甘油标准液，然后用蒸馏水补足各孔至25 μl。
2. 再在各孔中加入25 µl 高碘酸钠溶液，迅速震荡混匀。
3. 混匀后，室温静置10 min，期间震荡混匀1-2次。 4. 10 min后，各孔加入L-鼠李糖50 μl，迅速震荡混匀。
6. 根据上述酶活公式计算酶活。
EnzymeActi vity (U / ml )
注意：OD值范围控制在0.2-1.2之间，方能使用该公式
9.1965 OD 0.0055 2
酶活测定注意事项
1. 2. 3.
反应温度37℃； 反应时间10min（精确计时）； 反应时每支管振荡混匀
甘油含量的测定
发酵生产微生物谷氨酰胺转胺酶(MTGase) 。
TG 酶 的 应 用
发酵实验流程图
斜面菌种 菌种活化
三角瓶扩大培养 发酵罐和培养基的灭菌 发酵培养基的配制 发酵罐清洗与检查 加入到发酵罐中
接种
取样 发酵罐发酵的同时，用完全相同的条件，在摇瓶中做平行对照实验。
发酵液 冷冻离心，取上清，冰箱保存
相关知识介绍
4. 四联罐介绍
3L 的发酵罐，由罐体、空压机、主机、水源组成。
本实验用的发酵罐
谷氨酰胺转胺酶(MTGase)的发酵
轮枝链霉菌接种量：5～10％（v：v） 培养条件：温度，30℃；搅拌转速为200rpm；通 气量，3vvm（通气量与发酵液体积比-VVM）；培 养时间：40h左右 。 监测发酵罐的T、通气量、搅拌转速等状态，按照 一定时间取样。 测定发酵液的pH、酶活、甘油含量和生物量。