【免费下载】猪轮状病毒RV
猪轮状病毒病实验室诊断技术
ＦＴ Ｉ Ｃ荧光抗体 （ ０ ２ 含 ． ％伊 文思蓝染 色液 ）放湿盒 内于 ３ ｑ ０ ， ７Ｃ 染 色 ３ ～ ０ｒｉ 用 ００ ｌ Ｂ ０ ６ ｎ； ．１ ／ Ｐ Ｓ浸 泡 ３次 ， ａ ｍｏ Ｌ 依次 为 ３ ５ ８ ， ， ｍｉ ； 干 ， 加无 荧光 甘 油 ， 盖玻 片封 裱 ， ｎ风 滴 加 检测 。用落射 光 或 透射 光荧光 显 微镜 观察 判定 ：阳性 为细 胞质 内有 颗粒 样 苹 果绿 色荧 光 ： 阴性 为 细胞 质 内无苹 果绿 荧光 出现 ， 且细 胞
关 键 词 ： 轮 状 病 毒 病 ： 断技 术 猪 诊
中 图分 类 号 ：８８２ ５３ ￥５． ． ８
文 献标 识码 ： Ａ
文章 顺 序 编 号 ：６ ２ ５ ９ （ １） — １２ ０ １７ － １０２ ００ ０ ２ — ３ ０ ４
轮状病 毒属 于 呼肠 孤病 毒属 ， 可引起 仔 猪急 性 胃肠 炎 。
下 综述 。 １ 直 接 电 镜 法 观 察
４１ 样 品采集 及 处理 粪 水 （ ． 黏稠 粪便 加 等体 积 Ｐ Ｓ ５ｇ Ｂ ） ， 冻 融 次 ． ０ ～ ０ ｒｉ ４０ ０ ５５ ０ｒ ｎ离心 ４ ｎ ／ ａ ５ｍｉ ，上 清液 冷冻 保存 备用。 细胞 培养物及 其对 照材料离 心除细胞碎 片 ， 冻存 备用 。
取 腹泻 猪粪 水 直接 离 心 ，或用 ００ ｏ／ Ｂ ．１ｍ ｌ Ｐ Ｓ稀 释 ５ Ｌ ～ １ 后 ３００ｒ ｉ 心 ２ ｉ ；取 上 清液 滴 于蜡 盘 上 ， ０倍 ０ ｍ ｎ离 ／ ０ｍ ｎ 将 Ｆ ｒ ａ 膜 铜 网加 于 上 面 ；～ ｎ后 ， 下铜 网 ， 纸 吸 除 ｏｍｖｒ ２ ３ｍｉ 取 滤
多余 液 体 ； 用 ２ 使 ％磷 钨酸 钠 染 色 １ｍｉ。 ｎ 吸去 多余 水分 ， 自
猪轮状病毒G4P[6]重排株具有动物(猪、牛)和人类轮状病毒株的基因特征
![猪轮状病毒G4P[6]重排株具有动物(猪、牛)和人类轮状病毒株的基因特征](https://img.taocdn.com/s3/m/0d6e68d35022aaea998f0fe8.png)
猪轮状病毒Ｇ４Ｐ［６］重排株具有动物（猪、牛）
和人类轮状病毒株的基因特征
Ｅ Ｌｏｒｅｎｚｅｔｔｉ
简介
轮状病毒能导致小孩和许多动物幼仔包括猪的腹泻。
Ｇ４Ｐ［６］是猪Ａ组轮状病毒（ＰｏＲＶ－Ａ）（Ｇｏｔｆｆｒｉｅｄ样）和人Ａ
组轮状病毒（ＨｕＲＶ－Ａ） （Ｍ３７样）毒株的高频重组毒株。
已有许多研究报道人和动物轮状病毒之间的跨种传播和基
因重排。
一种新的分类系统使用了１ １个基因组ＲＮＡ片段而
且建议使用新的命名法。
本研究的目的是确定ＰｏＲＶ－Ａ毒株
Ｇ４谱系Ⅳ的ＮＳＰ１－ＮＳＰ５／６和ＶＰ６基因；如果免疫猪场出现３
周龄仔猪腹泻的样品中检测到了该谱系的毒株，确定其Ｐ亚
谱系。
张丽
猪轮状病毒G4P[6]重排株具有动物(猪、牛)和人类轮状病毒株的基因特征
作者： E Lorenzetti， 张丽
作者单位：
本文链接：/Conference_7941906.aspx。
猪轮状病毒疫苗有哪些？怎么打？.doc
猪轮状病毒疫苗有哪些？怎么打？概述：猪轮状病毒疫苗主要有细胞灭活苗、弱毒苗、油佐剂苗。
其中，弱毒苗与灭活苗的比较试验，结果表明接种弱毒苗能有效阻止发病和排毒，攻毒保护率达95%，而灭活苗不能够提供有效的保护力。
所以目前预防猪轮状病毒感染主要以弱毒苗为主。
建议各位根据自己猪场情况，进行选择适合的疫苗进行有效预防。
猪轮状病毒疫苗有哪些?目前兽医应用中的猪轮状病毒疫苗主要有3种类型:细胞灭活苗和弱毒苗，油佐剂苗，接种方式为口服或肌肉注射。
1.传统疫苗人们早期制作单价减毒口服活疫苗，使用动物轮状病毒毒株如牛轮状病毒RIT4237、恒河猴MMU18006、牛WC3等。
它们的免疫持续时间较灭活疫苗长，但保护力不稳定，在发达国家获得较满意保护率，而在发展中国家未能获得满意保护率。
这种差异可能是因为流行株的血清型不同，交叉保护力差，或者因为宿主差异不能激发保护。
2.亚单位疫苗亚单位疫苗是指利用病原体能诱导机体产生抗体的一种或几种有效成份，制成不含遗传物质的疫苗。
大多数RV亚单位疫苗的研究大多是表达RV的抗原相关蛋白的基因，制备抗原蛋白。
轮状病毒样颗粒(rvLP)是轮状病毒基因表达后的结构蛋白自我组装成病毒颗粒状物质。
rVLP单独使用或作为候选疫苗的一部分均具有免疫原性，动物模型实验己证实了rVLP的免疫原性、保护力以及作为候选疫苗的潜在用途。
Conner等采用重组杆状病毒表达系统表达牛轮状病毒RF株的vPZ、猴轮状病毒SAll株vP4、vP6、vP7，表达产物自动组装成病毒样颗粒(vLP)，用vPZ/4/627或vPZ/6/7周LP免疫均可产生特异的较高滴度血清抗体IgG，能保护同型(G3)轮状病毒的攻击，显示了VLPs良好的免疫原性和保护作用，展示出轮状病毒VLP作为亚单位疫苗具有很好的应用前景。
3.DNA疫苗DNA疫苗是利用基因重组技术将一种或几种目的基因重组到质粒载体上，再注入宿主体内使之表达，从而激发免疫。
猪传染性胃肠炎猪流行性腹泻与猪轮状病毒三联活疫苗使用说明书
猪传染性胃肠炎猪流行性腹泻与猪轮状病毒三联活疫苗使用说明书[兽用名称]猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻与猪轮状病毒三联活疫苗商品名：无英文名：Swine Transmissble Gastroenteritis,Porcine Epidemic Diarrhea and Porcine Rotavirus Vaccine，live汉语拼音：Zhu Chuanranxing Weichangyan、Zhu Liuxingxing Fuxie yu Zhu Lunzhuangbingdu Sanlian Huoyimiao【主要成分与含量】疫苗含猪传染性胃肠炎病毒弱毒化毒株和猪流行性腹泻病毒弱毒CV777株病毒和猪轮状病毒NX株，每头份疫苗病毒含量≥105.0TCID50。
【性状】为黄白色或微粉色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解，无异物。
【作用与用途】用于预防猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻与猪轮状病毒感染。
主动免疫接种后7日产生免疫力，免疫期为6个月。
仔猪被动免疫的免疫期至断奶后7日。
【用法与用量】1、空怀母猪、妊娠母猪：产仔前2-3个月，交巢穴位（即尾根与肛门中间凹陷的小窝部位）免疫接种，猪胃流轮三联活疫苗（猪传染性胃肠炎+流行性腹泻+轮状病毒三联活疫苗）5头份；有条件的产前2-3周二免，5头份。
2、免疫母猪所生仔猪：5-7日龄，接种猪胃流轮三联活疫苗，1头份；3、未免疫母猪所产仔猪1日龄，接种1头份；4、断奶仔猪断奶前2-3天，免疫接种2头份。
5、注：进针深度：3日龄内仔猪为1.5cm，随猪龄增大而加深，成猪为4cm。
【不良反应】无。
【注意事项】1. 产品仅用于控制这三种病毒引起的腹泻，对于细菌、寄生虫和其他因素引起的腹泻无效。
2. 疫苗运输过程中应防止阳光照射。
3. 妊娠母猪接种疫苗时要适当保定，以免引起机械性流产。
4. 疫苗稀释后，限1小时内用完。
5. 进行抗体检测，在抗体水平较低（TGE、PED中和抗体效价≤1:8，PRV中和抗体效价≤1:16）的情况下使用。
猪轮状病毒的分离鉴定及部分特性研究
万方数据第１期陈淑红，等猪轮状病毒的分离鉴定及部分特性研究１．２．３病毒的浓缩与电镜观察：轮状病毒细胞培养物反复冻融３次，７０００ｒ／ｒａｉｎ离心４０ｎｆｉｎ，取上清，４００００ｒ／ｍｉｎ离心１ｈ，以少许的ＰＢＳ溶解沉淀物。
接常规滴膜，２％磷钨酸负染，电镜观察。
１．２，４轮状病毒ＲＮＡ的聚丙酰胺凝胶电泳（ＰＡＧＥ）。
３“Ｊ：取病毒细胞培养物２ｍＬ，反复冻融３次，２（ＤＯｒ／ｎｆｉｎ，离心５ｍｉｎ去碎片，取上清，ＳＤＳ蛋白酶Ｋ裂解，酚氯仿抽提，氯仿复提，取上清，无水乙醇沉淀，１５０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｒｒｆｉｎ，沉淀即为ｄｓＲＮＡ，７０％乙醇洗涤，３０止ＤＥＰＣ水溶解，即为提取的ｄｓＲＮＡ，再加蔗糖及０．２％滇酚蓝液ｌＯ肚，混合后即可上样。
ＰＡＧＥ采用大的垂直板电泳槽，８％分离胶，电流９０ｍＡ，室温１２ｈ电泳，电泳完毕，７０％乙醇固定，水洗，Ａ刚０，染色３０ｍｉｎ，水洗，硼氢化钠、甲醛显色，直至清晰。
１．２．５双层法病毒蚀斑试验：取１酽，１矿，１盯６稀释的病毒液分别与等量的３０扯ｇ／ｍＬ的胰酶混合，３７℃作用１ｈ；取２４ｈＭＡ一１０４单层细胞，用ｅａｒｌｅ液清洗２次，每个稀释度取３瓶细胞，按原培养液的ｌ／１０加人胰酶处理过的病毒液，对照组用ｅａｒｌｅ液代替病毒液，３７℃吸附１ｈ，弃病毒液；覆盖１％的营养琼脂糖，观察病变；２ｄ后，覆盖０．８％的营养琼脂糖，内含有中性红，２—３ｄ后，观察蚀斑形成。
１．２．６病毒血凝和血凝抑制试验１．２．６．１血凝试验：病毒细胞培养物反复冻融３次，４０００ｒ／ｒａｉｎ离心１０ｍｉｎ去碎片，取上清，用０．ＯｌＭｐＨ７．４的ＰＢＳ稀释；红细胞洗涤后，用含０．２５％牛血清白蛋白的ＰＢＳ液稀释，浓度为０．５％；反应温度３７℃，具体方法参照文献［５３进行。
同时以正常的ＭＡ．１０４传代细胞培养物作对照。
１．２．６．２血凝抑制试验：对有凝集现象或凝似凝集现象的动物红细胞作血凝抑制试验，具体方法参照文献［５］进行，所有血清在试验前灭活处理。
猪轮状病毒病的流行病学及防控进展
猪轮状病毒病的流行病学及防控进展
相荣科
【期刊名称】《山东畜牧兽医》
【年(卷),期】2022(43)5
【摘要】猪轮状病毒病是猪感染轮状病毒引发的急性肠道传染性疾病,在猪生产养殖中较为普遍流行,特别是规模化养殖场中易发。
感染后的猪只临床表现为不同程度的腹泻、呕吐、食欲不振、精神不佳,随着病情的发展,还会出现严重的脱水,然后衰竭死亡。
该病严重威胁着猪只的健康生长,对养猪业造成较大的经济损失。
本文介绍了猪轮状病毒病的流行病学、临床症状及防治措施,以期为该病的预防与治疗提供参考。
【总页数】3页(P73-75)
【作者】相荣科
【作者单位】山东省兰陵县南桥畜牧兽医服务站
【正文语种】中文
【中图分类】S858.8
【相关文献】
1.猪轮状病毒病的流行病学、临床症状、诊断和防控
2.猪轮状病毒病的流行病学、临床症状、鉴别诊断和防控
3.猪轮状病毒病的流行病学、临床症状、鉴别诊断和防控
4.猪轮状病毒病的流行病学、临床症状、诊断要点与防控
5.猪轮状病毒病的流行病学、临床症状、诊断要点与防控
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
人畜共患病毒性传染病轮状病毒感染
公共卫生
–可以感染人的轮状病毒有3种，即主要感染婴幼儿的A组 轮状病毒、主要感染青壮年的B组轮状病毒及主要引起散 发病例的C组轮状病毒。
–无论发达国家还是发展中国家，90%以上的婴幼儿在3岁 以前都要受到轮状病毒的感染。世界上儿童的急性胃肠 炎由轮状病毒引起者占50%～60%，每年因感染轮状病毒 而夭折的婴幼儿达上百万。
– 新生仔畜及早吃到初乳，接受母源抗体的保护。 – 用猪源弱毒疫苗免疫母猪。 – 用牛源弱毒疫苗免疫母牛。
治疗
– 除采取一般防制措施外应停止哺乳（在猪则通过限饲减 少排乳），用葡萄糖盐水给病畜自由饮用。
– 对病畜进行对症治疗，如投用收敛止泻剂，使用抗菌药 物以防止继发感染。
– 静脉输液防止脱水和酸中毒等，一般都可获得良好效果。 葡萄糖 20g; KCl 1.5g; NaCl 3.5g; NaHCO3 2.5g； 加水 1000ml
病原
轮状病毒分为A、B、C、D、E、F 6个群。 A群为常见的典型病毒，宿主包括人和各种动物。 B群首先在中国发现，宿主为猪、牛、大鼠和人。 C群首先于1988年在日本发现，C群和E群感染猪，D群感染鸡和
火鸡，F群感染禽。 多数轮状病毒很难在细胞培养中生长繁殖，即使增殖也不产生
细胞病理变化。 新生犊牛腹泻轮状病毒（A组）可在恒河猴胎肾传代细胞株
流行病学
本病广泛分布于世界各地。 成年人、畜血清中轮状病毒病的抗体阳性率高达40%～
100%。 我国从多种患病幼畜体内分离到轮状病毒，证实其是引起
仔猪、犊牛、羔羊腹泻的病因之一。
病原
轮状病毒（Rotavirus）属呼肠孤病毒科、轮状病毒属。 – 由11个双股RNA片段组成，有双层衣壳，因像车轮而得名。 直径70nm。 – 本病毒与同科的其他成员无抗原关系。 – 人和各种动物的轮状病毒在形态上无法区别。 – 各种轮状病毒内衣壳具有共同群特异性抗原，轮状病毒的 外衣壳有型特异抗原。
猪轮状病毒江西株AY01的分离鉴定
中国畜牧兽医 2022,49(8):3151-3162C h i n aA n i m a lH u s b a n d r y &V e t e r i n a r y Med i c i ne 猪轮状病毒江西株A Y 01的分离鉴定刘小兰1,刘昌锦1,余文洋1,李潇翔1,边彦超1,黄校花1,罗 锋2,邓舜洲1(1.江西农业大学动物科学技术学院,南昌330045;2.江西金伊博生物科技有限公司,南昌330013)摘 要:ʌ目的ɔ确定江西省某猪场哺乳仔猪发生腹泻的病因㊂ʌ方法ɔ对送检的仔猪小肠样品进行猪流行性腹泻病毒(P o r c i n e e p i d e m i c d i a r r h e a v i r u s ,P E D V )㊁猪传染性胃肠炎病毒(T r a n s m i s s i b l e g a s t r o e n t e r i t i sv i r u s ,T G E V )和猪轮状病毒(P o r c i n e r o t a v i r u s ,P o R V )的R T -P C R 检测,将阳性样品接种MA 104细胞传代进行P o R V 的分离;对分离毒株进行电镜观察㊁间接免疫荧光试验㊁P o R V V P 4和V P 7基因序列测序和动物回归等试验㊂ʌ结果ɔ猪小肠病料样品经终浓度15μg /m L 的胰酶处理37ħ孵育2h ,接种MA 104细胞,能在细胞上增殖传代,第6代开始表现稳定的细胞病变;电镜观察可见病毒粒子直径大小为61~70n m ,平均大小为65n m ,呈带有短纤突且外缘光滑的形似车轮状的粒子,具有轮状病毒粒子典型的形态特征;间接免疫荧光试验和R T -P C R 检测均为P o R V 阳性,确定该分离株为P o R V ㊂分离株V P 4和V P 7基因序列分析显示,V P 4基因型与P [23]基因型相似性最高,V P 7基因型与G 5基因型相似性最高,根据A 群轮状病毒最新分类方法,分离株属于G 5P [23]型㊂动物回归试验结果显示,经口感染该分离株的1日龄初生仔猪于感染后24h 左右陆续出现水样腹泻㊁呕吐等临床症状,并能在粪便中检测到P o R V ㊂ʌ结论ɔ通过MA 104细胞连续传代,从江西某猪场的腹泻仔猪小肠样品成功分离到1株P o R V ,该分离株属于G 5P [23]型P o R V ,为哺乳仔猪发生腹泻的病原㊂关键词:猪轮状病毒(P o R V );分离鉴定;动物回归试验中图分类号:S 852.65+1文献标识码:AD o i :10.16431/j.c n k i .1671-7236.2022.08.031 开放科学(资源服务)标识码(O S I D ):收稿日期:2022-02-28基金项目:江西省现代农业产业技术体系建设专项资金(J X A R S -03)联系方式:刘小兰,E -m a i l :2386356391@q q .c o m ㊂邓舜洲,E -m a i l :s h z h d e n g@163.c o m I s o l a t i o na n d I d e n t i f i c a t i o no f P o r c i n eR o t a v i r u s J i a n gx i S t r a i nA Y 01L I U X i a o l a n 1,L I U C h a n g j i n 1,Y U W e n y a n g 1,L IX i a o x i a n g 1,BI A N Y a n c h a o 1,HU A N G X i a o h u a 1,L U OF e n g 2,DE N GS h u n z h o u 1(1.C o l l e g e o f A n i m a lS c i e n c e a n dT e c h n o l o g y ,J i a n g x i A g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y ,N a n c h a n g330045,C h i n a ;2.J i a n g x i J i n y i b oB i o t e c h n o l o g y C o m p a n y ,N a n c h a n g 330013,C h i n a )A b s t r a c t :ʌO b j e c t i v e ɔT h e s t u d y w a s a i m e d t od e t e r m i n e t h e e t i o l o g y o f d i a r r h e a p i g l e t s i na p i gf a r mi n J i a ng x i p r o v i n c e .ʌM e th o d ɔT h e s m a l li n t e s t i n e s a m p l e s o f p i gl e t sw e r e t e s t e d f o rP o r c i n e e p i d e m i c d i a r r h e a v i r u s (P E D V ),po r c i n e T r a n s m i s s i b l e g a s t r o e n t e r i t i s v i r u s (T G E V )a n d P o r c i n er o t a v i r u s (P o R V )b y R T -P C R .P o s i t i v es a m pl e w a si n o c u l a t e di n t o MA 104c e l l sf o r p a s s a g et oi s o l a t eP o R V .T h e i s o l a t e ds t r a i n w a sd e t e c t e db y e l e c t r o n m i c r o s c o p eo b s e r v a t i o n ,i n d i r e c t i m m u n o f l u o r e s c e n c et e s t ,P o R V V P 4a n d V P 7g e n e ss e q u e n c i n g a n da n i m a l r e g r e s s i o n t e s t .ʌR e s u l t ɔT h e r e s u l t s s h o w e d t h a t p o r c i n e i n t e s t i n a l d i s e a s e s a m pl e sw e r e i n c u b a t e d a t 37ħf o r2h w i t hf i n a l c o n c e n t r a t i o no f15μg /m Lt r y p s i na n di n o c u l a t e d w i t h MA 104c e l l s ,w h i c h c o u l d p r o l i f e r a t ea n d p a s s a g eo nc e l l s ,a n dt h e6t h -g e n e r a t i o nb e g a nt os h o w s t a b l ec y t o pa t h i c e f f e c t .E l e c t r o n m i c r o s c o pi c o b s e r v a t i o n s h o w e dt h a tt h e v i r u s p a r t i c l e s w e r e 61-70n m i n d i a m e t e r ,t h e a v e r a g e s i z ew a s 65n m ,w i t h s h o r t f i b r i l s a n d s m o o t ho u t e r e d ge s ,s i m i l a r t ow h e e l -l i k e p a r t i c l e s ,w h i c h h a dt y p i c a l m o r p h o l o gi c a lc h a r a c t e r i s t i c s o f P o R V v i r u s p a r t i c l e s .B o t h中国畜牧兽医49卷i n d i r e c t i m m u n o f l u o r e s c e n c e a s s a y a n dR T-P C R w e r e p o s i t i v e f o rP o R V,a n dt h e i s o l a t e ds t r a i n w a s d e t e r m i n e d t o b e P o R V.S e q u e n c e a n a l y s i s o f V P4a n d V P7g e n e s r e v e a l e d t h a t V P4g e n o t y p e h a d t h eh i g h e s th o m o l o g y w i t hP[23]g e n o t y p e,a n d V P7g e n o t y p eh a dt h eh i g h e s th o m o l o g y w i t hG5g e n o t y p e,a c c o r d i n g t o t h e l a t e s t c l a s s i f i c a t i o nm e t h o do f g r o u p A R o t a v i r u s,t h e i s o l a t e w a s c l a s s i f i e da sG5P[23]g e n o t y p e.T h e r e s u l t so f a n i m a l r e g r e s s i o nt e s t s h o w e dt h a t t h eo n e-d a y-o l dn e w b o r n p i g l e t sw i t ho r a l i n f e c t i o no f t h e i s o l a t e h a dw a t e r y d i a r r h e a,v o m i t i n g a n do t h e r c l i n i c a l s y m p t o m sa b o u t24ha f t e r i n f e c t i o n,a n dc o u l dd e t e c tP o R Vi nt h e f e c e s.ʌC o n c l u s i o nɔT h r o u g hc o n t i n u o u s p a s s a g e o fMA104c e l l s,a s t r a i no f P o R V w a s s u c c e s s f u l l y i s o l a t e d f r o mt h e s m a l l i n t e s t i n e s a m p l e so fd i a r r h e a p i g l e t s i na p i g f a r mi nJ i a n g x i p r o v i n c e,t h e i s o l a t e ds t r a i n b e l o n g e d t oG5P[23]g e n o t y p eP o R V,w h i c hw a s t h e p a t h o g e no f d i a r r h e a i n p i g l e t s.K e y w o r d s:P o r c i n e r o t a v i r u s(P o R V);i s o l a t i o na n d i d e n t i f i c a t i o n;a n i m a l r e g r e s s i o ne x p e r i m e n t猪轮状病毒(P o r c i n e r o t a v i r u s,P o R V)是导致哺乳仔猪和断奶仔猪腹泻的常见病原之一,属呼肠孤病毒科轮状病毒属成员[1]㊂感染P o R V后,发病猪主要表现厌食㊁呕吐㊁水样腹泻等特征,P o R V在世界范围的流行非常普遍,各种年龄㊁性别的猪均可感染,主要危害1~4周龄仔猪,尤其1~10日龄仔猪感染后发病率可超过80%,死亡率为50%~ 100%[2-3],成年猪多为隐性感染,该病潜伏期短㊁传染性强㊁流行范围广,给养猪业造成巨大的经济损失㊂P o R V为无囊膜正链R N A病毒,具有二十面体立体对称的双层衣壳,直径在65~75n m之间,在电镜下,可观察到形似 车轮状 的病毒粒子[4]㊂病毒核酸由11个双股R N A基因片段组成,每一基因片段各编码一种蛋白,其中V P1~V P4㊁V P6㊁V P7为结构蛋白,N S P1~N S P6为非结构蛋白[5]㊂V P6是数量最多的结构蛋白,是病毒的群抗原,根据V P6可将轮状病毒分为10个基因群(A~J),其中A群轮状病毒(R V A)是最典型的轮状病毒㊂轮状病毒的基因型主要根据病毒表面的V P4和V P7蛋白分型,分别为P㊁G血清型,目前在人和动物的R V A 中发现35个P血清型和27个G血清型[6]㊂1969年轮状病毒在犊牛中首次被报道[7],随后1975年R o d g e r等[8]在猪粪便中分离到P o R V,中国于1982年由庞其方等[9]在腹泻仔猪粪便中分离出该病毒,随后陆续有学者在马㊁羊㊁鸡等多种动物的腹泻粪便中发现轮状病毒㊂P o R V在全球范围内广泛分布,以猪R V A最为常见,其复杂的流行病学㊁遗传多样性被广泛研究,在猪群中的患病率在3.3%~67.3%之间,猪场阳性感染率为61%~ 74%[10-11],此病毒的感染传播高发季为早春㊁冬季和晚秋这些温度较低时节[12]㊂P o R V常与多种猪源性传染病混合感染仔猪,导致P o R V的流行很复杂㊂本试验从疑似P o R V感染的猪场采集病料,对此病毒的分离培养条件进行探究,利用MA104细胞分离获得1株P o R V,观察该分离株人工感染新生仔猪后的临床表现和剖检病理学变化,以期为P o R V的流行情况提供理论参考㊂1材料与方法1.1材料1.1.1病料㊁细胞系和试验动物病料为江西南昌某规模化猪场腹泻仔猪的小肠样品,-80ħ保存备用;MA104细胞(C R L-2378.1)㊁V e r o细胞(C C L-81)㊁P K15细胞(C C L-33)㊁MA R C-145细胞(C R L-12231)㊁M c C o y细胞(C R L-1696)㊁S T细胞(C R L-1746)㊁I E C-18细胞(C R L-1589)㊁I P E C-J2细胞均由江西农业大学预防兽医室保存;1日龄未吃初乳初生仔猪购自江西省某规模化猪场㊂1.1.2主要试剂高糖D M E M细胞培养液㊁胎牛血清(G i b c o公司);反转录酶M-M L V㊁R R I试剂(T a K a R a公司);胰酶㊁羊抗鼠F I T C-I g G抗体(S o l a r b i o公司);鼠抗轮状病毒V P6蛋白高免血清(效价1ʒ5.12ˑ105至1ʒ10.24ˑ105)由江西农业大学预防兽医教室制备保存;一步法反转录实时荧光定量检测试剂盒(G e n S t a r公司)㊂1.2病料处理取小肠组织用无菌匀浆器匀浆后,按比例制成1ʒ10的D M E M悬液,反复冻融3次,4ħ㊁12000r/m i n离心15m i n,用0.22μm细菌滤器过滤上清液,-80ħ保存备用㊂1.3引物设计与合成参考G e n B a n k中收录的轮状病毒V P4基因序列(登录号:K C113250.1)设计1对V P4基因全长25138期刘小兰等:猪轮状病毒江西株A Y01的分离鉴定的测序引物;参考G e n B a n k上收录的A型轮状病毒的V P7基因序列(登录号:MT025938.1)设计2对引物,分别作为检测引物和V P7基因全长的测序引物;参考C V777毒株的O R F1基因序列(登录号: L T906581.1)设计猪流行性腹泻病毒(P o r c i n e e p i d e m i cd i a r r h e av i r u s,P E D V)的检测引物;参考H E-1毒株的N基因序列(登录号:K X083668.1)设计猪传染性胃肠炎病毒(T r a n s m i s s i b l e g a s t r o e n t e r i t i s v i r u s,T G E V)的检测引物,引物序列见表1㊂引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成㊂表1引物信息T a b l e1P r i m e r i n f o r m a t i o n引物P r i m e r s引物序列P r i m e r s e q u e n c e s(5'ң3')产物大小P r o d u c t l e n g t h/b p退火温度A n n e a l i n g t e m p e r a t u r e/ħP o R V-F G T A T G G T A T T G A A T A T A C C A C A G T T C50350 P o R V-R C C A T T G G A T T A C A T A G C C A T T C AV P4-F A T G G C T T C T C T A A T T T A C A G233147 V P4-R T T A T A A T C T A C A T T G T A G T A T A A G T T G T TV P7-F C G A C T G G C T A T C G G A T A G C T C C T T103552 V P7-R G G T C A C A T C A T A C A A T T C T A A CP E D V-F T G A C T G G C A A C T G G T T C G T T132450 P E D V-R C G C A G G T C C G G T T T A T C T G AT G E V-F C A A A C T C G C T A T C G C A T G G52950 T G E V-R T C T T G T C A C A T C A C C T T T A C C T G C1.4R T-P C R扩增采用T R I z o l法提取病毒总R N A,按照反转录试剂盒说明书将R N A反转录为c D N A,以其为模板进行P C R扩增㊂P C R反应体系50μL:c D N A模板2μL,H i F i B u f f e r5μL,d N T P s4μL,H i F i酶0.5μL,上㊁下游引物(20μm o l/L)各0.5μL,d d H2O37.5μL㊂P C R反应程序:94ħ预变性5m i n;94ħ变性30s,50ħ退火30s,72ħ延伸1m i n,共37个循环;72ħ延伸8m i n㊂P C R产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定㊂1.5病毒分离培养在病毒滤液中加入终浓度为15μg/m L的胰酶,37ħ处理1.5h㊂取出汇合度约90%的MA104细胞,弃去培养液,并用无血清的D M E M洗3遍,将处理好的样品接种于细胞,37ħ吸附2h,加入含终浓度为7.5μg/m L胰酶的D M E M维持液,继续培养48h后收集病毒液,反复冻融3次,即为第1代P1分离株,收集培养液进行下一代在MA104细胞上盲传,直至产生细胞病变,同时收集每代的细胞培养物进行R T-P C R扩增鉴定㊂1.6病毒鉴定1.6.1病毒V P4㊁V P7基因R T-P C R鉴定提取分离毒株的第5(P5)和第10代(P10)细胞培养物的R N A,将其反转录为c D N A,以此为模板,分别用V P4㊁V P7基因特异性引物进行P C R扩增,扩增产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测,并将产物送至湖南擎科生物技术有限公司测序㊂将测序结果在N C B I上进行B L A S T比对分析,从G e n B a n k中查找到P o R V V P4和V P7各型的参考毒株,利用M e g a7.0软件构建V P4㊁V P7基因的系统进化树,确定分离株的基因型㊂1.6.2病毒间接免疫荧光试验鉴定将MA104细胞接种于96孔细胞培养板,细胞长成单层后接种病毒液,37ħ培养48h后弃上清,预冷甲醇固定,以鼠抗V P6蛋白多克隆抗体(1ʒ2000)为一抗㊁羊抗鼠F I T C-I g G(1ʒ500)为二抗对病毒进行染色检测,于倒置荧光显微镜下观察检测结果㊂1.6.3病毒电镜观察收集分离株细胞培养物,病毒液反复冻融3次,12000r/m i n离心10m i n,离心上清经蔗糖浓缩后透析,过0.22μm细菌滤器,收集滤液经磷钨酸负染后用日立H T7700透射电镜观察病毒形态㊂1.7病毒部分生物学特性检测1.7.1病毒增殖曲线绘制取出汇合度约90% MA104细胞,用无血清培养液洗3次,以感染复数(MO I)为0.05的病毒量感染,置于37ħ㊁5%3513中国畜牧兽医49卷C O2培养箱中培养2h后,弃病毒液,每孔补加含5μg/m L胰酶的无血清D ME M维持液,每隔4h刮取细胞,收集病毒液㊂将各时间点收集的病毒液分别按照10倍倍比稀释,从10-1稀释至10-8,接种于已铺满MA104细胞的96孔细胞培养板,并设正常细胞作为对照,置于37ħ㊁5%C O2培养箱中培养2d后㊂利用间接免疫荧光试验进行荧光染色观察,按照R e e d-M u e n c h法计算各时间点的50%组织细胞感染量(T C I D50),并以时间为横坐标㊁各时间点的T C I D50为纵坐标,绘制病毒的增殖曲线㊂1.7.2分离毒株对不同细胞的易感性将MA104㊁V e r o㊁I P E C-J2㊁P K15㊁MA R C-145㊁M c C o y㊁S T㊁I E C-18细胞分别接种于96孔细胞培养板中培养,待细胞铺满培养板后,用无血清的D M E M培养液洗3次,以MO I为0.05的病毒量感染分离毒株,置于37ħ㊁5%C O2培养箱中吸附2h,弃病毒液,每孔补加含5μg/m L胰酶的无血清D M E M维持液,同时设置相应的正常细胞作为对照,置于37ħ㊁5%C O2培养箱中培养2d后弃培养液,固定,进行间接免疫荧光检测㊂1.8动物回归试验将4头1日龄未吃初乳的新生仔猪随机分组,其中试验组3头,对照组1头,试验组仔猪经人工口服分离株第20代细胞培养液,1m L/头(病毒含量106.0 T C I D50/m L),对照组仔猪口服等体积D M E M㊂每隔2h饲喂仔猪专用猪奶粉,每隔4h采集粪便拭子,并记录试验仔猪的食欲及精神状况,攻毒后48h剖杀㊂参考许梦怡等[13]建立的P E D V㊁T G E V㊁P o R V的多重荧光定量P C R检测方法,应用一步法反转录实时荧光定量检测试剂盒检测粪便排毒情况㊂上游引物:5'-C G C G G A G C T A A A C G T G A A A A-3';下游引物:5'-T T A C T C T C C A T A A T T G C G T C T A T G T T C-3';探针:5-(R O X)-C C A C A A C A G A A T G A A C G T C T G C-A A G A A A A A-(B H Q2)-3'㊂P C R反应体系20μL: 2ˑS t a r S c r i p tⅡP r o b eO n e-S t e pq R T-P C RB u f f e r 10μL,S t a r S c r i p tⅡP r o b eO n eS t e p E n z y m e M i x 2μL,探针(10μm o l/L)0.5μL,上㊁下游引物(10μm o l/L)各0.5μL,R N A模板2μL,D E P C水补至20μL㊂P C R反应程序:50ħ15m i n;94ħ2m i n;94ħ15s,60ħ30s,共40个循环㊂试验结束后,剖检,收集仔猪小肠样品,用4%多聚甲醛固定,用于H E病理切片染色和免疫组织化学检测㊂2结果2.1病料R T-P C R检测对处理好的病料样品进行R T-P C R,经1.0%琼脂糖凝胶电泳分析,结果表明P o R V-F/R引物扩增产物电泳后可见约503b p的扩增条带,与预期大小相符,而使用P E D V和T G E V特异性引物未扩增出特异性条带(图1),表明该病料样品含P o R V㊂M,D L2000D N A M a r k e r;1㊁4㊁7,病料样品;2,P o R V阳性对照;5,P E D V阳性对照;8,T G E V阳性对照;3㊁6㊁9,阴性对照M,D L2000D N A M a r k e r;1,4a n d7,S i c k m a t e r i a l s a m p l e s; 2,P o R V p o s i t i v e c o n t r o l;5,P E D V p o s i t i v e c o n t r o l;8,T G E V p o s i t i v e c o n t r o l;3,6a n d9,N e g a t i v e c o n t r o l图1样品P o R VR T-P C R检测结果F i g.1R T-P C Rd e t e c t i o n r e s u l t s o f s a m p l e s f o rP o R V2.2病毒分离病料滤液经胰酶处理后接种MA104单层细胞,盲传细胞第1~3代无明显变化;第4~5代细胞在48h脱落细胞增多;传至第6代时,16~24h时产生明显的细胞病变,具体表现为细胞变圆皱缩,出现拉网现象并逐渐脱落(图2A),未感染的MA104细胞正常生长(图2B)㊂继续传代后,分离毒株逐渐适应MA104细胞,将该毒株命名为P o R V A Y01株㊂2.3分离株鉴定结果2.3.1V P4和V P7基因检测结果提取分离株的P5和P10代细胞培养液进行R T-P C R,R T-P C R产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳的检测结果见图3㊁4㊂结果显示在约2331和1035处出现目的条带,分别与预期V P4㊁V P7基因片段大小相符㊂2.3.2分离株基因型鉴定及基因进化树分析对分离株V P4基因测序结果经B L A S T在线比对,结果显示,分离株与P o R V的V P4基因相似性达96.65%,确定分离株V P4基因为P[23]型㊂系统进化树结果显示,A Y01株的V P4基因与四川的猪轮状病毒S C Y B-C3株(MT198752.1)的亲缘关系45138期刘小兰等:猪轮状病毒江西株A Y 01的分离鉴定最近(图5)㊂分离株V P 7基因测序结果经B L A S T 在线比对,结果显示,分离株与P o R V V P 7基因相似性达97.78%,确定分离株V P 7基因为G 5型㊂系统进化树结果显示,A Y 01株的V P 7基因与黑龙江的猪轮状病毒Z j h 3-2株(J X 498961.1)的亲缘关系最近,同时与中国流行血清型G 5型的代表毒株O S U 在进化关系上构成一个分支(图6)㊂因此分离毒株的基因型为G 5P [23]型㊂A ,A Y 01毒株感染的MA 104细胞;B ,正常MA 104细胞A ,MA 104c e l l s i n f e c t e dw i t hA Y 01s t r a i n ;B ,N o r m a lMA 104c e l l s 图2 分离株感染M A 104细胞时的细胞病变(100ˑ)F i g .2 C y t o pa t h i c e f f e c t o f t h e i s o l a t e d s t r a i no n M A 104c e l l s (100ˑ)M ,D N A M a r k e r Ⅳ,1,阳性对照;2,P 5代细胞培养物;3,P 10代细胞培养M ,D N A M a r k e r Ⅳ;1,P o s i t i v ec o n t r o l ;2,P 5g e n e r a t i o n c e l l c u l t u r e ;3,P 10g e n e r a t i o n c e l l c u l u r e图3 A Y 01株V P 4基因R T -P C R 扩增结果F i g .3 R T -P C R a m p l i f i c a t i o nr e s u l to f V P 4g e n eo fA Y 01s t r a inM ,D L 2000D N A M a r k e r ;1,阳性对照;2,P 5代细胞培养物;3,P 10代细胞培养物M ,D L 2000D N A M a r k e r ;1,P o s i t i v e c o n t r o l ;2,P 5c e l l c u l t u r e ;3,P 10c e l l c u l u r e图4 A Y 01株V P 7基因R T -P C R 扩增结果F i g .4 R T -P C Ra m p l i f i c a t i o n r e s u l t o f V P 7g e n e o f t h eA Y 01s t r a i n5513中 国 畜 牧 兽 医49卷图5 A Y 01株V P 4基因核苷酸序列系统进化树F i g .5 P h y l o g e n e t i c t r e e b a s e do n t h e n u c l e o t i d e s e qu e n c e o f V P 4g e n e o fA Y 01s t r a in 图6 A Y 01株V P 7基因核苷酸序列系统进化树F i g .6 P h y l o g e n e t i c t r e e b a s e do n t h e n u c l e o t i d e s e qu e n c e o f V P 7g e n e o fA Y 01s t r a i n 2.3.3 间接免疫荧光试验结果 将分离毒株的细胞培养液接种MA 104细胞,以鼠抗V P 6蛋白多克隆抗体为一抗㊁羊抗鼠F I T C -I g G 为二抗进行间接免疫荧光试验,结果显示,感染病毒的孔内细胞胞浆内可见特异性绿色荧光(图7A ),正常MA 104细胞孔内未见荧光(图7B )㊂2.3.4 病毒电镜观察结果 P o R V A Y 01株细胞培养物经超速离心纯化,负染后进行透射电镜观察,电镜下可看到形态呈球形,具有明显的双层衣壳结构,似车轮状的病毒颗粒,直径大小为61~70n m ,平均大小65n m (图8)㊂65138期刘小兰等:猪轮状病毒江西株A Y 01的分离鉴定A ,A Y 01毒株感染的MA 104细胞;B ,正常MA 104细胞A ,MA 104c e l l s i n f e c t e dw i t hA Y 01s t r a i n ;B ,N o r m a lMA 104c e l l s图7 P o R VA Y 01株感染M A 104细胞间接免疫荧光试验检测结果(100ˑ)F i g.7 I F At e s t r e s u l t s o fM A 104c e l l s i n f e c t e dw i t hP o R VA Y 01s t r a i n (100ˑ)图8 P o R VA Y 01株病毒粒子电镜观察(20000ˑ)F i g .8 E l e c t r o n m i c r o g r a pho fv i r u s p a r t i c l eo fP o R V A Y 01s t r a i n (20000ˑ)2.4 分离毒株的部分生物学特性检测结果2.4.1 分离毒株增殖曲线的绘制 由图9可知,分离株A Y 01在接毒后8~12h 就可达到病毒滴度峰值,随后进入病毒增殖稳定期(图9)㊂图9 P o R VA Y 01株的增殖曲线F i g.9 P r o l i f e r a t i o n c u r v e o fP o R VA Y 01s t r a i n 2.4.2 分离毒株对不同细胞的易感性 间接免疫荧光试验结果显示,分离毒株对试验所用细胞有感染,可用免疫荧光方法检测P o R V ㊂在可见光下,分离株在MA 104㊁V e r o ㊁I P E C -J 2㊁P K 15细胞中产生细胞病变,在S T ㊁M c C o y㊁I E C -18细胞中无细胞病变;经免疫荧光检测,分离株在MA 104㊁V e r o 细胞中可检测到大面积的荧光,其中毒株在MA 104细胞的胞浆内可见特异性绿色荧光,在V e r o 细胞的细胞核中能检测到特异性绿色荧光,在I P E C -J 2㊁P K 15细胞中的荧光较少,在S T ㊁M c C o y 细胞中只有零星的荧光,在MA R C -145㊁I E C -18细胞中无荧光(图10)㊂综上得出,分离毒株在所用细胞中的易感性排序为MA 104>V e r o>I P E C -J 2>P K 15>S T>M c C o y >MA R C -145>I E C -18细胞,表明P o R V 分离株在MA 104细胞上的易感性最好㊂2.5 动物回归试验2.5.1 临床症状及剖检变化 试验组3头仔猪接种A Y 01株后,8~24h 时3头猪排软粪,24~48h 时均陆续由黄色软粪转为水样腹泻,具体表现为精神沉郁㊁嗜睡,饮食量严重下降,排黄色水样稀粪便,并伴有腥臭味,48h 时剖检攻毒组仔猪可见胃内有未消化的凝乳,小肠肠壁变薄㊁出血,肠内有黄色液体㊂试验期间,对照组仔猪未出现上述症状㊂表明分离毒株A Y 01株攻毒可致使仔猪持续排毒,并产生典型腹泻症状㊂2.5.2 P o R V 感染后排毒检测 试验期间每4h收集2组仔猪肛门拭子,利用一步法实时荧光定量P C R 方法监测排毒情况,结果显示,在24~48h 时C t 值变化明显,36~44h 降到最低(图11),此时仔猪临床表现为饮食量下降,精神萎靡,腹泻严重,排黄色水样粪便㊂2.5.3 病理组织及免疫组化切片观察 病理组织切片观察结果显示,试验组仔猪小肠绒毛呈弥漫性萎缩㊁绒毛减少,脱落(图12A ),对照组肠道结构7513中 国 畜 牧 兽 医49卷完整,未见坏死脱落(图12C )㊂免疫组化检测结果显示,试验组仔猪肠绒毛及黏膜层处分散有褐色点状物(图12C ),为P o R V 阳性;对照组仔猪肠道均正常(图12D )㊂图10 分离毒株A Y 01对不同细胞的易感性(100ˑ)F i g .10 S u s c e p t i b i l i t y of i s o l a t e d s t r a i nA Y 01t od i f f e r e n t c e l l s (100ˑ)85138期刘小兰等:猪轮状病毒江西株A Y 01的分离鉴定图11 仔猪接种P o R VA Y 01株后粪便排毒检测F i g .11 D e t e c t i o no f f e c a l d e t o x i f i c a t i o n i n p i gl e t s i n o c u l a t e dw i t hP o R VA Y 01s t r a in ①A ㊁B ,分别为试验组和对照组仔猪空肠切片H E 染色结果(100ˑ);C ㊁D ,分别为试验组和对照组仔猪空肠切片免疫组化染色结果(200ˑ)㊂②图A 中箭头表示肠绒毛脱落;图C 中箭头表示P o R V 抗原①Aa n dB ,H Es t a i n i n g r e s u l t s o f j e j u n u ms e c t i o n s o f i n f e c t e d p i g l e t s i n t h e t e s t a n dc o n t r o l g r o u p s ,r e s p e c t i v e l y (100ˑ);Ca n dD ,I m m u n o h i s t o c h e m i c a l s t a i n i n g r e s u l t s o f j e j u n u ms l i c e s o f p i g l e t s i n t h e t e s t a n d c o n t r o l g r o u p s ,r e s p e c t i v e l y (200ˑ).②A r r o w s i n p a n e lAi n d i c a t e s h e d d i n g o f i n t e s t i n a l v i l l i ;A r r o w s i n p a n e l C i n d i c a t eP o R Va n t i g e n s 图12 肠道组织病理及免疫组化切片观察F i g .12 P a t h o l o gi c a l a n d i m m u n o h i s t o c h e m i c a l s e c t i o n s o b s e r v a t i o no f i n t e s t i n a l t i s s u e 3 讨 论P o R V 在猪群中的感染非常普遍,在中国规模化猪场仔猪腹泻粪便中的阳性率为7.69%~28.76%[14-17],早期分离的P o R V 很难适应细胞,直到1984年B o h l 等[18]首次用胰酶处理样品,感染MA 104细胞,开启了P o R V 的体外分离培养进程,B e n u r e a u [19]证实胰酶能结合轮状病毒颗粒,溶解其外壳蛋白,从而增强病毒的感染能力㊂随着现代生物科技的发展,对P o R V 的分离培养技术逐渐成熟,目前的轮状病毒体外培养是否成功主要由细胞种类㊁胰酶浓度以及粪液中病毒粒子的完整性等因素决定,其中胰酶在轮状病毒增殖时有重要作用,时洪艳等[20]在处理病料时加入20μg/m L 胰酶消化,从MA 104细胞上分离到1株P o R V ㊂陈淑红等[21]9513中国畜牧兽医49卷则使用30μg/m L胰酶消化处理才从MA104细胞上分离到P o R V毒株㊂杨娟[22]仅加入0.1μg/m L 胰酶消化处理病料便从V e r o细胞上分离到P o R V S WU-1C/2018株㊂本研究将病料滤液经终浓度15μg/m L胰酶预处理,在维持液中添加终浓度7.5μg/m L胰酶为分离培养P o R V的条件,成功分离到1株P o R V,将该毒株命名为P o R V A Y01株㊂A Y01株在MA104细胞上盲传至第6代后表现稳定的细胞病变,具体表现为细胞折光性增强㊁拉网脱落等,这与张贺伟等[23]㊁黄小波等[24]结果一致㊂P o R V在体内只感染肠绒毛的上皮细胞,在体外能感染肾或肠道上皮细胞,其中最敏感的是MA104细胞,随后发现用胰酶处理的轮状病毒也能在S T㊁MA R C-145㊁P K15㊁V e r o等细胞上增殖[25-27],本试验分离株能够在MA104㊁V e r o㊁I P E C-J2㊁P K15㊁S T㊁M c C o y㊁M A R C-145细胞中增殖,其易感性排序为M A104>V e r o>I P E C-J2>P K15>S T>M c C o y> MA R C-145>I E C-18细胞,进一步验证MA104细胞是分离轮状病毒的最佳选择㊂轮状病毒基因型和血清型很多,且在自然界中还存在着人与动物㊁动物与动物之间的基因片段重组现象[28-30],R V A的基因型众多,且G型与P型之间会产生不同的组合,不同组合型的R V A毒株的交叉保护性很低[31-32]㊂目前,R V A中与猪相关的轮状病毒G血清型有12种,P血清型16种,其中在中国流行的P o R V G血清型为G3㊁G4㊁G5㊁G9㊁G11和G26,通常会与P[5]㊁P[6]㊁P[7]㊁P[13]㊁P[23]组合的形式流行[33-34]㊂在本试验中,分离株的V P4基因与P[23]型的P o R V S C Y B-C3株亲缘关系最近,相似性为96.65%,V P7基因与G5型的P o R V Z j h z l3-2株和O S U/U S A株相似性分别为97.78%和93.8%,据M a t t h i j n s s e n s等[6]提出的 轮状病毒V P4编码区核苷酸序列相似性>90%,即为同一基因型,轮状病毒V P7编码区核苷酸序列相似性> 80%,即为同一基因型 的划分方法,确定A Y01株属于G5P[23]型P o R V㊂在众多P o R VG/P组合型中,G5P[7]型P o R V是全球流行最广泛的组合型,占所有P o R V的37.3%[35],但随着R V A基因片段间重组频繁,近年来在中国陆续报道了G11P[13]㊁G9P[23]㊁G9P[7]㊁G4P[13]㊁G26P[13]等新型组合的P o R V[36-38],本试验报道了一种新组合型P o R V A Y01株,丰富了国内P o R V的资料,有利于对国内P o R V的监测㊂目前,国内关于P o R V分离的报道越来越多,但关于P o R V对猪致病性的相关报道较少㊂本试验开展P o R V A Y01毒株人工感染仔猪的致病性研究,为防止仔猪母源抗体对试验的影响,选择1日龄新生未吃初乳的仔猪为试验对象,仔猪经口感染分离毒株,在攻毒后24~48h期间,仔猪表现呕吐㊁腹泻㊁排黄色水样并伴有腥臭的稀粪的症状,剖检可见各肠段胀气明显,小肠肠壁变薄,肠系膜充血肿胀,小肠绒毛萎缩,肠上皮细胞脱落㊁坏死㊂黄小波等[24]使用3日龄仔猪感染P o R V O S U株,在感染10h后,仔猪开始腹泻,拉黄色水样稀粪,感染42h 后仔猪脱水死亡㊂N a r i t a等[39]通过对8头口服P o R V的新生仔猪的肠道病变进行研究时,发现感染P o R V的仔猪在接种后18~24h表现腹泻,肠绒毛脱落㊁萎缩,特别是空肠和回肠的变性,这与本试验分离株感染仔猪的症状和病理切片观察结果一致㊂此外,在整个试验过程中,使用实时荧光定量P C R方法对试验组仔猪粪便排毒情况进行检测,发现试验组仔猪均在24~48h期间C t值变化明显, 36~44h降到最低,此时仔猪临床表现为腹泻㊁呕吐㊁排黄色水样粪便等典型的P o R V症状,表明此时是仔猪粪便排毒的高峰期㊂因此,初步得出P o R V在进行动物致病性研究时,可结合仔猪临床与实时荧光定量P C R方法,对试验过程进行监测,当发病症状表现明显及C t值最低时处死仔猪,能最大程度得到病毒含量高的病料样品㊂4结论本试验成功分离到1株基因型为G5P[23]型的P o R V,为了解江西地区P o R V的流行变异情况及有效防治P o R V感染提供了参考依据㊂参考文献(R e f e r e n c e s):[1] Z I MM E R MA NJ J.猪病学[M].赵德明,译.10版.北京:中国农业大学出版社,2014.Z I MM E R M A NJ J.D i s e a s e s o f S w i n e[M].Z H A OD M,t r a n s l a t i o n.10t h e d.B e i j i n g:C h i n a A g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y P r e s s,2014.(i nC h i n e s e)[2] F L E W E E T T H,WO O D EG N.T h eR o t a v i r u s e s[J].A r c h i v e s o f V i r o l o g y,1978,57(1):1-23.[3]任文华,崔志洪.猪轮状病毒概述[J].畜牧兽医杂志,2005,24(5):21-25.R E N W H,C U I ZH.P r o g r e s s o nP o r c i n e r o t a v i r u s[J].J o u r n a l o f A n i m a lS c i e n c ea n d V e t e r i n a r y M e d i c i n e,2005,24(5):21-25.(i nC h i n e s e)[4] P R A S A D B,WA N G G J,C L E R X J,e ta l.T h r e e-d i me n s i o n a ls t r u c t u r e of R o t a v i r u s[J].J o u r n a lo f06138期刘小兰等:猪轮状病毒江西株A Y01的分离鉴定M o l e c u l a rB i o l o g y,1988,199(2):269-275. [5] L O P E Z T,C AMA C H O M,Z A Y A S M,e t a l.S i l e n c i n g t h em o r p h o g e n e s i s o fR o t a v i r u s[J].J o u r n a lo f V i r o l o g y,2005,79(1):184-192.[6] MA T T H I J N S S E N SJ,C I A R L E T M,R A HMA N M.R e c o m m e n d a t i o n sf o rt h ec l a s s i f i c a t i o n o f g r o u p AR o t a v i r u s e su s i n g a l l11g e n o m i cR N As e g m e n t s[J].A r c h i v e s o f V i r o l o g y,2008,153(8):1621-1629.[7] M E B U SCA,U N D E R D A H LN R,R H O D E S M B,e t a l.F u r t h e rs t u d i e so n N e o n a t a lc a l fd i a r r h e av i r u s[J].P r o c e e d i n g s,A n n u a l M e e t i n g o f t h e U n i t e d S t a t e sA n i m a lH e a l t hA s s o c i a t i o n,1969,73:97-99.[8] R O D G E R S M,C R A V E N J A,W I L L I AM S L.L e t t e r:D e m o n s t r a t i o n o f R e o v i r u s-l i k e p a r t i c l e si ni n t e s t i n a l c o n t e n t s o f p i g l e t s w i t h d i a r r h o e a[J].A u s t r a l i a nV e t e r i n a r y J o u r n a l,1975,51(11):536.[9]庞其方,丘福禧,俞富荣,等.秋季婴幼儿急性胃肠炎病源 轮状病毒的研究[J].医学研究杂志,1979,7:26-27.P A N G Q F,Q I U F X,Y U F R,e ta l.S t u d y o fR o t a v i r u sa st h ee t i o l o g y o fa c u t e g a s t r o e n t e r i t i si ni n f a n t s a n d c h i l d r e n i n a u t u m n[J].J o u r n a l o fM e d i c a lR e s e a r c h,1979,7:26-27.(i nC h i n e s e) [10] V L A S O V A A N,AM I MOJO,S A I FLJ.P o r c i n er o t a v i r u s e s:E p i d e m i o l o g y,i m m u n e r e s p o n s e s a n dc o n t r o l s t r a t e g i e s[J].V i r u s e s,2017,9(3):48.[11] P A P P H,L A S Z L O B,J A K A BF,e t a l.R e v i e wo fg r o u p A R o t a v i r u s s t r a i n s r e p o r t e d i n s w i n e a n dc a t t l e[J].V e t e r i n a r y M i c r o b i o l o g y,2013,165(3-4):190-199.[12]乔成鹏.2015~2016年中国部分地区猪轮状病毒感染检测及病毒分离与鉴定[D].大庆:黑龙江八一农垦大学,2019.Q I A OCP.D e t e c t i o n,i s o l a t i o na n d i d e n t i f i c a t i o no fP o r c i n er o t a v i r u si n f e c t i o ni n s o m ea r e a s o f C h i n af r o m2015t o2016[D].D a q i n g:H e i l o ng j i a n g B a y iA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y,2019.(i nC h i n e s e)[13]许梦怡,王彦红,薛峰.猪传染性胃肠炎病毒猪流行性腹泻病毒猪轮状病毒多重荧光R T-P C R检测方法的建立[J].中国兽医科学,2020,50(12):1500-1508.X U M Y,WA N G Y H,X U E F.E s t a b l i s h m e n ta n da p p l i c a t i o n o f m u l t i p l e x R T-P C R p r o c e d u r e f o rd e t e c t i o n o f t h r e e v i r u s f r o m s w i n e[J].C h i n e s eV e t e r i n a r y S c i e n c e,2020,50(12):1500-1508.(i nC h i n e s e)[14]曹恭貌,张斌,岳华,等.四川部分猪场P E D V㊁T G E V㊁G A R V和P K V感染状况调查[J].动物医学进展,2016,37(1):118-122.C A O G M,Z HA N G B,Y U E H,e ta l.S u r v e y o ni n f e c t i o nw i t hP E D V,T G E V,G A R Va n dP K Vi n p i gf a r m s o f S i c h u a n p r o v i n c e[J].P r og r e s s i nV e t e r i n a r yM e d i c i n e,2016,37(1):118-122.(i nC h i n e s e)[15]杨文宇,周远成,韩燕,等.猪A群轮状病毒和C群轮状病毒以及猪星状病毒多重R T-P C R同时检测方法的建立及应用[J].中国兽医科学,2014,44(4):394-400.Y A N G W Y,Z H O U Y C,HA N Y,e t a l.E s t a b l i s h m e n t a n dc l i n i c a la p p l i c a t i o no fa m u l t i p l e xr e v e r s e t r a n s c r i p t i o nP C Rf o rs i m u l t a n e o u sd e t e c t i o no f P o r c i n e g r o u p A r o t a v i r u s,P o r c i n e g r o u p Cr o t a v i r u s a n d P o r c i n e a s t r o v i r u s[J].C h i n e s eV e t e r i n a r y S c i e n c e,2014,44(4):394-400.(i nC h i n e s e)[16] X U E R,T I A N Y,Z HA N G Y,e ta l.D i v e r s i t y o fg r o u p A R o t a v i r u so fP o r c i n er o t a v i r u s i nS h a n d o n gp r o v i n c e C h i n a[J].A c t a V i r o l o g i c a,2018,62(3):229-234.[17]周玲,陈桂华,伍子娴,等.广东地区2016-2017年规模化猪场腹泻病原调查分析[J].中国兽医杂志,2017,53(10):3-5.Z H O U L,C H E N G H,WU Z X,e ta l.I n v e s t i g a t i o na n da n a l y s i so fd i a r r h e a l p a t h o g e n s i nl a r g e-s c a l e p i gf a r m s i nG u a ng d o n g r e g i o n i n2016-2017[J].Chi n e s eJ o u r n a l o f V e t e r i n a r y M e d i c i n e,2017,53(10):3-5.(i nC h i n e s e)[18] B O H L E H,T H E I L K W,S A I F LJ.I s o l a t i o na n ds e r o t y p i n g o f P o r c i n e r o t a v i r u s e s a n d a n t i g e n i cc o m p a r i s o n w i t h o t h e r R o t a v i r u s e s[J].J o u r n a lo fC l i n i c a lM i c r o b i o l o g y,1984,19(2):105-111.[19] B E N U R E A U Y.T r y p s i n i s a s s o c i a t e d w i t h t h eR o t a v i r u s c a p s i da n di sa c t i v a t e db y s o l u b i l i z a t i o no fo u t e r c a p s i d p r o t e i n s[J].J o u r n a l o f G e n e r a lV i r o l o g y,2005,86(11):3143-3151.[20]时洪艳,陈建飞,王承宝,等.猪轮状病毒R o t a v i r u sAp i g/C h i n a/N M T L/2009/G9P[23]株的分离与鉴定[J].中国预防兽医学报,2011,33(9):681-684.S H IH Y,C H E NJF,WA N GCB,e t a l.I s o l a t i o n a n di d e n t i f i c a t i o n o f R o t a v i r u s A p i g/C h i n a/NM T L/2009/G9P[23]s t r a i n[J].C h i n e s e J o u r n a l o fP r e v e n t i v e V e t e r i n a r y M e d i c i n e,2011,33(9):681-684.(i nC h i n e s e)[21]陈淑红,王新生,师东方,等.猪轮状病毒的分离鉴定及部分特性研究[J].中国预防兽医学报,2004,26(1):42-44.C H E NS H,WA N G X S,S H ID F,e ta l.I s o l a t i o n,i d e n t i f i c a t i o na n d p a r t i a lc h a r a c t e r i z a t i o n o fP o r c i n er o t a v i r u s[J].C h i n e s e J o u r n a l o f P r e v e n t i v eV e t e r i n a r y M e d i c i n e,2004,26(1):42-44.(i nC h i n e s e)[22]杨娟.猪轮状病毒G D-01-2015的全基因序列分析及双夹心E L I S A方法的建立[D].扬州:扬州大学,2017.Y A N G J.W h o l e g e n es e q u e n c ea n a l y s i so fP o r c i n er o t a v i r u s G D-01-2015a n d t h e e s t a b l i s h m e n t o f ad o u b le s a n d w i c h E L I S A m e t h o d[D].Y a n g z h o u:1613中国畜牧兽医49卷Y a n g z h o uU n i v e r s i t y,2017.(i nC h i n e s e) [23]张贺伟,王鑫,夏铭崎,等.猪A群轮状病毒L N-01-2013株的分离与鉴定[J].中国兽医科学,2014,44(5):470-475.Z HA N G H W,WA N G X,X I A M Q,e ta l.I s o l a t i o na n d i d e n t i f i c a t i o no fP o r c i n e g r o u p Ar o t a v i r u ss t r a i nL N-01-2013[J].C h i n e s eV e t e r i n a r y S c i e n c e,2014,44(5):470-475.(i nC h i n e s e)[24]黄小波,徐璐,曹三杰,等.猪轮状病毒O S U株的培养特性与致病性研究[J].中国人兽共患病学报,2012,28(2):120-123.HU A N G X B,X U L,C A O S J,e t a l.C u l t u r ec h a r a c t e r i s t i c s a nd p a t h o ge n i c i t y o fP o r c i n er o t a v i r u sO S Us t r a i n[J].C h i n e s eJ o u r n a lo f Z o o n o s e s,2012,28(2):120-123.(i nC h i n e s e)[25] W E L T E R M W,W E L T E R CJ,C HAM B E R SD M,e t a l.A d a p t a t i o na n ds e r i a l p a s s a g eo fP o r c i n e g r o u pCr o t a v i r u si nS T-c e l l s,a ne s t a b l i s h e dd i p l o i ds w i n et e s t i c u l a rc e l ll i n e[J].A r c h i v e so f V i r o l o g y,1991,120(3-4):297-304.[26]杨文宇,朱玲,周远成,等.猪轮状病毒四川株的分离鉴定及增殖规律[J].中国兽医学报,2014,34(2):192-198.Y A N G W Y,Z HU L,Z H O U YC,e t a l.I s o l a t i o na n di d e n t i f i c a t i o n o f t h e S i c h u a n s t r a i n o f P o r c i n er o t a v i r u s a n d i t s p r o l i f e r a t i o n p a t t e r n[J].C h i n e s eJ o u r n a l o f V e t e r i n a r y S c i e n c e,2014,34(2):192-198.(i nC h i n e s e)[27]魏锁成,冯若飞,巩转娣,等.牛轮状病毒的分离与细胞培养特性[J].西北民族大学学报(自然科学版),2010,31(4):71-75.W E I SC,F E N G RF,G O N GZD,e t a l.I s o l a t i o na n dc e l lc u l t u r e c h a r a c t e r i s t i c s o f B o v i n e r o t a v i r u s[J].J o u r n a l o f N o r t h w e s t M i n z u U n i v e r s i t y(N a t u r a lS c i e n c e),2010,31(4):71-75.(i nC h i n e s e)[28] M A T T I J N S S E N SJ,T A R A P O R E W A L A ZF,Y A N G H,e t a l.S i m i a n r o t a v i r u s e s p o s s e s s d i v e r g e n t g e n ec o n s t e l l a t i o n s t h a t o r i g i n a t ed f r o m i n te r s p e c i e st r a n s m i s s i o n a n d r e a s s o r t m e n t[J].J o u r n a l o fV i r o l o g y,2010,84(4):2013-2026.[29] G H O S HS,K O B A Y A S H IN,N A G A S H I MAS,e t a l.F u l l g e n o m i c a n a l y s i s a n d p o s s i b l e o r i g i no f aP o r c i n eG12r o t a v i r u ss t r a i n R U172[J].V i r u s G e n e s,2010,40(3):382-388.[30] MA T T H I J N S S E N SJ,R A HMA N M,R A N S T M V.T w oo u t o f t h e11g e n e s o f a nu n u s u a lH u m a nG6P[6]r o t a v i r u s i s o l a t e a r eo f b o v i n eo r i g i n[J].T h e J o u r n a lo f G e n e r a lV i r o l o g y,2008,89(10):2630-2635.[31] H O S H I N O Y,S E R E N O M M,M I D T HU N K,e t a l.I n d e p e n d e n t s e g r e g a t i o no f t w oa n t i g e n i cs p e c i f i c i t i e s(V P3a n d V P7)i n v o l v e d i n n e u t r a l i z a t i o n o fR o t a v i r u s i n f e c t i v i t y[J].P r o c e e d i n g s o f t h eN a t i o n a lA c a d e m y o f S c i e n c e s o f t h e U n i t e d S t a t e s o fA m e r i c a,1985,82(24):8701-8704.[32] G R E E N B E R G H,M C A U L I F F E V,V A L D E S U S OJ,e t a l.S e r o l o g i c a l a n a l y s i sof t h es u bg r o u pp r o t e i no fR o t a v i r u s,u s i n g m o n o c l o n a la n t i b o d i e s[J].I n f e c t i o na n dI m m u n i t y,1983,39(1):91-99.[33] A N A S T A S I A V,J O S HU A A,L I N D A S.P o r c i n er o t a v i r u s e s:E p i d e m i o l o g y,i m m u n e r e s p o n s e s a n dc o n t r o l s t r a t e g i e s[J].V i r u s e s,2017,9(3):47-48.[34] X U E R,T I A N Y,Z HA N G Y,e ta l.D i v e r s i t y o fg r o u p A R o t a v i r u so fP o r c i n er o t a v i r u s i nS h a n d o n gp r o v i n c e C h i n a[J].A c t a V i r o l o g i c a,2018,62(3):229-234.[35]原霖.猪轮状病毒G4P[6]株的分离鉴定及新型检测方法的建立与应用[D].北京:中国农业大学,2018.Y U A N L.I s o l a t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n o f P o r c i n er o t a v i r u ss t r a i n G4P[6]a n dt h ee s t a b l i s h m e n ta n da p p l i c a t i o no fan o v e ld e t e c t i o n m e t h o d[D].B e i j i n g:C h i n aA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y,2018.(i nC h i n e s e)[36]库旭钢,张坤,刘羽茜,等.猪A群轮状病毒的分离与鉴定[J].畜牧兽医学报,2012,43(2):275-281.K U X G,Z HA N G K,L I U Y X,e ta l.I s o l a t i o na n di d e n t i f i c a t i o no f g r o u p A P o r c i n er o t a v i r u s[J].A c t aV e t e r i n a r i a e t Z o o t e c h n i c a S i n i c a,2012,43(2):275-281.(i nC h i n e s e)[37]李玉,穷达,张敏,等.猪A群轮状病毒R V A/P i g-t c/C HN/S WU-1C/2018/G9P[13]株的分离与鉴定[J].中国预防兽医学报,2019,41(11):1170-1173.L IY,Q I O N G D,Z HA N G M,e ta l.I s o l a t i o n a n di d e n t i f i c a t i o no f t h eP o r c i n e g r o u p Ar o t a v i r u ss t r a i no fR V A/P i g-t c/C HN/S WU-1C/2018/G9P[13][J].C h i n e s e J o u r n a l o f P r e v e n t i v eV e t e r i n a r y M e d i c i n e,2019,41(11):1170-1173.(i nC h i n e s e) [38]周群,陈小飞,阚蕊慈,等.2017-2019年四川地区猪A群轮状病毒的分子流行病学调查[J].中国农业科学,2021,54(5):1063-1072.Z H O U Q,C H E N X F,K A N R C,e ta l.M o l e c u l a re p i d e m i o l o g i c a li n v e s t i g a t i o n of R o t a v i r u si n s w i n eh e r d A i n S i c h u a n2017-2019[J].S c i e n t i aA g r i c u l t u r a S i n i c a,2021,54(5):1063-1072.(i nC h i n e s e)[39] N A R I T A M,F U K U S H O A,K O N N O S,e t a l.I n t e s t i n a l c h a n g e s i n g n o t o b i o t i c p i g l e t se x p e r i m e n t a l l y i n o c u l a t e d w i t hP o r c i n er o t a v i r u s[J].N a t i o n a l I n s t i t u t eo f H e a l t h Q(T o k y o),1982,22(2):54-60.(责任编辑董晓云)2613。
猪轮状病毒的中医治疗研究
临症资料20233256猪轮状病毒的中医治疗研究张子微（长江学院，湖北荆州 434000）摘要：近几年基层养殖产业发展速度逐渐加快，从事该行业的人员数量也不断增加，养殖规模以及养殖密度都有了较大提升，但在发展过程中所暴露出的问题也越来越多，尤其是疫病的频繁导致养殖产业的健康发展受到较大的威胁。
在生猪养殖中，猪轮状病毒病就是常发的一种病毒性传染性疾病，其主要影响猪的肠道，使病猪出现严重的腹泻症状，由于仔猪的机体发育不完善，因此极易受到该病毒的影响，一旦发病还会迅速蔓延全群，严重威胁猪群的健康。
目前在该并的治疗中主要采用中医治疗方法，其使用的是天然的中草药物，无毒副作用以及药物残留，应用价值较高，有力的保障了养殖场的健康。
基于此，针对猪轮状病毒的中医治疗方法进行分析，提出相关的预防措施，以期为养殖户在猪轮状病毒病防治上提供参考，促进我国生猪养殖产业的可持续发展。
关键词：猪轮状病毒病；中医治疗；预防中图分类号： S858.28 文献标志码：B 文章编号：1003-8655（2023）03-0073-03中医在兽病治疗中也有着较长的研究与应用，在治疗过程中会结合病猪发病机理选择一定功效的中草药进行合理配伍，有效缓解病猪症状，且不会产生药物残留，能够满足现代人们对猪肉产品的健康要求。
同时，为了减少猪轮状病毒病的影响，养殖户自身也要加强学习，了解疾病的流行特点，以便更好地做好预防工作，进一步提高养殖水平。
1 猪轮状病毒病概述1.1 流行特点猪轮状病毒主要存在于猪的胃肠消化当中，一般会随着猪的粪便进入到自然界中，并逐渐扩散到周围环境，尤其是带毒猪活动所接触的饲料、器具等都会带有大量的病毒，健康猪接触后就会受到感染，一般会呈现隐性感染，但是仔猪的自身免疫力较差，因此在受到猪轮状病毒的侵袭后极易会发生感染，一般在患病后24 h 出现症状，再加上猪轮状病毒的传染速度较快，因此一旦发病就会出现大规模的流行，在春冬较为很冷的季节更容易发生。
猪轮状病毒的分离与鉴定
猪 轮状 病毒 （ Ｐ ｏ ｒ ｃ ｉ ｎ ｅ ｒ ｏ ｔ ａ ｖ ｉ ｒ ｕ ｓ ， Ｐ Ｒ Ｖ） 与猪 传染 性
Ｃ ＨＥ Ｎ Ｘｉ ａ ｏ—ｃ ｈ ｕ ｎ， ＷＵ Ｈｕ ａ—ｗ ｅ ｉ ， Ｚ ＨＡＮＧ Ｇ ｕ ａ ｎ ｇ—ｃ ｈ ｕ ａ ｎ ， ＤＥ Ｎ Ｇ Ｙｏ ｎ ｇ ，Ｇ ＡＯ Ｊ ｉ ｎ—ｙ ｕ ａ ｎ， Ｌ ＡＮＧ Ｈｏ ｎ ｇ—Ｗ Ｕ
（ Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ Ｉ ｎ ｓ ｔ ｉ ｔ ｕ ｔ ｅ ｏ ｆ Ｖ ｅ ｔ ｅ ｒ ｉ ｎ ａ ｒ ｙ Ｄ ｒ ｕ ｇ Ｃ ｏ ｎ ｔ ｒ ｏ ｌ ， Ｂ ｅ ｉ ｊ ｉ ｎ ｇ １ ０ ０ ０ ８ １ ， Ｃ ｈ ｉ ａ） ｎ
［ 摘
要］ 将 疑似 感染猪轮状病 毒 的内蒙古 某猪场 的腹 泻仔 猪粪便 样 品在 Ｍ Ａ １ 一株 能产生 明显细胞 病变 的毒株 （ 命 名为 Ｐ Ｒ Ｖ Ｌ １ 株） 。经纯 净 性检测 ， 该毒株 无 菌 生长 、 无支 原 体污染及 外源病毒污 染。特异性检测结 果显示该 Ｐ Ｒ Ｖ Ｌ １ 株 能被 猪 轮状病毒 单特异 性血 清 中和 ， 并可 被 猪轮状病毒单 克隆抗体识别 ， 其Ｖ Ｐ ７基 因序列 与 ｃ ５型猪轮状病 毒 Ｖ ｆ ｙ ７ 基 因序列 同源性为 ９ ９ ％ 。动
Ａｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ：Ａ ｓ ｔ ｒ ａ ｉ ｎ ｏ ｆ ｐ ｏ ｒ ｃ ｉ ｎ ｅ ｒ ｏ ｔ ａ ｖ ｉ ｒ ｕ ｓ ｉ ｓ ｏ ｌ ａ ｔ ｅ ｄ ｆ ｒ ｏ ｍ ｔ ｈ ｅ ｆ ｅ ｃ ｅ ｓ ｏ ｆ ｄ ｉ ａ ｒ ｒ ｈ ｅ ａ ｌ ｐ ｉ ｇ ｌ ｅ ｔ ｓ ｉ ｎ ｉ ｎ ｎ ｅ ｒ Ｍｏ ｎ ｇ ｏ ｌ ｉ ａ ｗａ ｓ ｒ ｅ ｐ ｌ ｉ ｃ ａ ｔ ｅ ｄ ｓ ｅ ｉａ ｒ ｌ ｌ ｙ ｉ ｎ ＭＡ１ ０ ４ ｃ ｅ ｌ ｌ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ｅ ｓ ，ｎ ａ ｍｅ ｄ ＰＲＶ Ｌ１ ．Ｔｈ ｅ ｐ ｕ ｉｔ ｒ ｙ ｔ ｅ ｓ ｔ ｉ ｎ ｄ ｉ ｃ ａ ｔ ｅ ｄ ｔ ｈ ａ ｔ ｎ ｏ ｓ ｔ ｅ ｉｌ ｒ ｅ，ｎ ｏ ｍｙ ｃ ｏ ｐ ｌ ａ ｓ ｍａ ａ ｎ ｄ ｎ ｏ ｅ ｘ ｔ ｒ ａ ｎ ｅ ｏ ｕ ｓ—ａ ｇ ｅ ｎ ｔ ｓ ｗｅ ｒ ｅ ｄ ｅ ｔ ｅ ｃ ｔ ｅ ｄ．Ｔｈ ｅ ｓ ｐ ｅ ｃ ｉ ｉｃ ｆ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｔ ｅ ｓ ｔ ｍａ ｎ ｉ ｆ ｅ ｓ ｔ ｅ ｄ ｔ ｈ ａ ｔ ｔ ｈ ｅ ｉ ｓ ｏ ｌ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｃ ｏ ｕ ｌ ｄ ｂｅ ｎ ｅ ｕ ｔ ｒ ａ ｌ ｉ ｚ ｅ ｄ ｂ ｙ ａ ｎ ｔ ｉ— ｒ ｏ ｔ ａ ｖ ｉ ｒ ｕ ｓ ａ ｎ ｔ ｉ ｓ ｅ ｒ ｕ ｍ ａ ｎ ｄ ｒ ｅ ｃ ｏ ｇ ｎ ｉ ｚ ｅ ｄ ｂ ｙ ａ ｎ ｔ ｉ—ｒ ｏ ｔ ａ ｖ ｉ ｒ ｕ ｓ ｍｏ ｎ ｏ ｃ ｌ ｏ ｎ ａ ｌ ａ ｎ ｔ ｉ ｂｏ ｄ ｙ．ｔ ｈ ｅ Ｖｆ ｙ ７ ｇ ｅ ｎ ｅ ｈ ａ ｄ ｎ ｕ ｃ ｌ ｅ ｏ ｔ ｉ ｄ ｅ ｉ ｄ ｅ ｎ ｔ ｉ ｔ ｉ ｅ ｓ ｏ ｆ ９ ９％ ｃ ｏ ｍｐ ａ ｒ ｅ ｄ ｔ ｏ Ｇ５ ｇ ｅ ｎ ｏ ｔ ｙ ｐ ｅ ＰＲＶ．Ｔｈ ｅ ａ ｎ ｉ ｍａ ｌ ｒ ｅ ｇ ｒ ｅ ｓ ｓ ｅ ｘ ｐ ｅ ｉｍｅ ｒ ｎ ｔ ｉ ｎ ｄ ｉ ｃ ａ ｔ ｅ ｄ ｔ ｈ ａ ｔ ｔ ｈ ｅ ３ ｄａ ｙ ｓ ｏ ｌ ｄ ｐ ｉ ｇ ｌ ｅ ｔ ｓ ｆ ｅ ｄ ｗｉ ｔ ｈ ｔ ｈ ｅ ｆ ａ ｅ ｃ ｅ ｓ ｈ ａ ｄ ｓ ｈ ｏ ｗｅ ｄ ｔ ｙ ｐ ｉ ｃ ａ ｌ ｓ ｙ ｎ ｄ ｒ ｏ ｍｅ ｏ ｆ ｐ ｏ ｒ ｃ ｉ ｎ ｅ ｒ ｏ ｔ ａ ｖ ｉ ｒ ｕ ｓ ｄ ｉ ｓ ｅ ａ ｓ ｅ，ａ ｎ ｄ ｒ ｏ ｔ ａ ｖ ｉ ｒ ｕ ｓ ａ ｎ ｔ ｉ ｇ ｅ ｎ ｃ ｏ ｕ ｌ ｄ ｂ ｅ ｄ ｅ ｔ ｅ ｃ ｔ ｅ ｄ ｒｏ ｆ ｍ
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
1 病原学 猪轮状病毒(RV)属于呼肠弧病毒科轮状病毒属的A、B、C、E 群[4]。
成熟完整的病毒粒子略呈圆形，没有囊膜，具有双层表壳，直径为65～75nm的二十面体对称。
电镜观察，病毒的中央为一个电子致密的六角形棱心，直径37～40nm，即芯髓;周围有一电子透明层，壳粒由此向外呈辐射状排列，构成中间层衣壳;外周为一层光滑薄膜构成的外层衣壳，厚约20nm，形成一个轮状结构，RV由此而得名[5]。
在感染的粪样和细胞培养物中均存在两种形式的病毒粒子：具有双层表壳的光滑型(S型)双层颗粒，有感染性，直径为75nm;没有外表壳的粗糙型(R型)单壳颗粒，无感染性，直径为65nm。
有关RV的超微结构，学者们的意见尚不一致，Martin等(1975年)认为RV与环状病毒一样，也有32个大的环形壳粒，且其180个三联亚单位按T=9的、方式组成20个三角面体。
每个三联亚单位包含3个结构单位，所以一共有540个结构单位。
但据Esparza(1978年)报道，RV表面有162个孔，由320个三联亚单位按T=9方式组成20个三角面体。
因每个三联亚单位包含三个结构单位，所以一共有960个结构单位。
出现上述不同的观察结果，也许是标本制作方法不同的缘故。
Stannard氏等(1977年)对乳鼠流行性腹泻轮状病毒和猴RVSA11株进行了细致的电子显微镜观察，发现其内衣壳有180个形态亚单位，排列成晶格状。
12个顶各为一个空隙，由5个壳粒围绕，另外80个空隙各由6个壳粒围绕。
外衣壳由蜂窝样的晶格组成，且与内衣壳的晶格排列相符。
1.1 分子生物学特性 通过X-射线晶体结构研究发现，完整的病毒粒子具有复杂的结构。
最外层核衣壳由结构蛋白VP7和VP4组成，中间层衣壳由VP6组成，最内层衣壳由VP2和少量的VP1、VP3组成。
VP7是构成外衣壳最丰富的外壳蛋白，是分子量为37KD的糖蛋白。
VP4是88KD的红血球凝集素纤突蛋白，沿VP7形成的光滑表面向外突出。
不完整的病毒粒子是完整的病毒粒子在进入被感染细胞过程当中外衣壳蛋白VP4和VP7被溶解掉而形成的两层核衣壳结构(DLP)。
除了VP4、VP7、VP6、VP2、VP1和VP3这6种结构蛋白以外，还有5种非结构蛋白，分别是NSPl、NSP2、NSP3、NSP4和NSP5。
病毒的基因组由11个独立片段的双股正链RNA组成。
除了片段11具有两个开放阅读框(0RD)外，其他的片段只有1个ORF。
在各个ORF的5’端和3’端都有非编码区(UTRs )，不同毒株的UTRs高度保守，而ORF的差异比较大。
轮状病毒的mRNA分子具有5’端m7GpppGn帽子结构，而3’没有Poly(A)尾。
ORF的基因编码结构蛋白和非结构蛋白，两端的UTRs可能与调节蛋白的结合以及核酸的复制、表达有关。
早期的研究结果认为VP7与病毒的附着有关，但现在越来越多的证据表明VP7具有稳定VP4结构的作用。
在病毒侵入细胞的过程当中VP4起到关键作用。
VP4能被胰蛋白酶(Trypsin) 分解为VP5(60KD) 和VP8(26KD) 两个结构部分，与病毒附着、聚集有重要关系，可以数倍提高轮状病毒的感染性[7]。
VP5含有一个与有膜病毒如流感病毒类似的区域，它能增加细胞膜的渗透性，加强病毒进入细胞的能力。
VP8含有唾液酸附着(Sialic acid binding)的区域，这一区域对于需要硅酸进行感染的轮状病毒亚单位来说至关重要。
VP6与内衣壳蛋白VP1和VP3的转录活性有关[8]。
VP4和VP7被溶解掉之后，VP1和VP3的转录酶活性被激活，转录产物被合成和排出。
最内层的病毒粒子衣壳由包裹基因组的VP2、VP1、VP3组成，基因组核酸通过VP1、VP3与VP2紧密相连。
VP1和VP3具有RNA转录酶和修饰酶的潜在活性。
非结构蛋白NSP1、NSP2、NSP3、NSP5都是RNA结合蛋白，与病毒的复制，合成和表达有关。
NSP5可与VP2作用，进而影响VP1/2/3的核心结构，同时也能影响VP6的稳定性。
而NSP4是一种糖蛋白，与病毒粒子从内质网出芽有关，在病毒的复制以及致病机理方面具有重要作用。
NSP4的突变可以影响病毒的毒力。
1.2 病毒分型 轮状病毒具有不同的群型和血清型。
将轮状病毒的核酸进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，可以将病毒的11个双链RNA片段分离，形成特定的电泳带模型。
这11条带可以分为4个区段，常见的人和动物的电泳带的排列位置为4：2：3：2，统称为A群，又叫典型RV。
根据第1O和11节段之间的距离，又分为长型和短型。
其他的轮状病毒的电泳型与A群不同，分别为B、C、D、E、F和G群，统称为非典型RV。
在发生腹泻的动物中最常见的是A群，感染猪的轮状病毒有A群、B群、C群和E群。
病毒粒子表面共有三种抗原，分别为群抗原，中和抗原和血凝素抗原。
群抗原是VP6，中和抗原是VP7，而血凝素抗原是VP4。
根据群抗原VP6可以分为不同的亚群。
大多数动物的A群轮状病毒为I亚群，而人类大多数A群轮状病毒为Ⅱ亚群。
VP4和VP7在病原的检测和产生中和抗体以及免疫性保护过程中具有重要意义，可以根据VP4和VP7分为不同的血清型系统。
根据VP4形成的血清型叫P(protease sensitive)型，根据VP7形成的血清型叫G(glycoprotein)型。
轮状病毒不同血清型之间的交叉反应性较差，免疫反应主要是针对特异血清型的，但现在也有报道利用交叉免疫保护的。
目前已经知道至少有14个G型和18个P型。
通过轮状病毒的分子流行病学调查发现，在世界广泛流行的A组RV主要有4种G、P血清型组合，分别是G1P8、G2P4、G3P8和G4P8。
从各大洲分离的仔猪的基因型主要有以下两种：类OSU型和类Gotfield型。
1.3 理化特性 RV对理化因素的作用有较强的抵抗力，所以清洗和消毒猪舍时必须注意此特点。
它耐乙醚、氧仿、去氧胆酸钠、次氯酸盐;反复冻融，声波处理。
以及37℃下1h仍不失活；pH3.5～10.0范围内病毒保持感染力，对胰蛋白酶稳定，1moL/LMgCL2不能增高其对56℃30min的稳定性;粪便中的RV在18～20℃室温中经7个月仍有感染性;能耐10mL/L甲醛1h 以上;氯、臭氧、碘、酚等可灭活病毒；100g/L聚维酮碘、950mL/L乙醇和670g/L氯胺T 是有效的消毒剂[4～5]。
1.5 抗原性 RV与呼肠孤病毒和环状病毒无抗原关系，但用补反结合试验、免疫荧光试验和免疫扩散试验和免疫电镜技术检测各种动物的RV，发现具有共同抗原---出现交叉反应。
这种共同抗原与内衣壳有关,也就是说,内衣壳具有各种RV共有的属抗原。
外衣壳内糖蛋白抗原有种特异性，交叉保护试验或中和试验可区别各种动物RV，但Thouless氏等(1977年)对人、牛、猪、小白鼠、狗、羊、马和兔的RV作交叉中和试验，发现高浓度的抗血清可能引起一定程度的种间交叉现象，但同源血清的中和效价通常都比异源血清高8—10倍以上。
1976年Woode氏等应用免疫电镜技术测人、牛、猪、小白鼠、马等RV抗原性关系，发现抗人RV免疫血清以外，其余四种血清能对四种动物RV呈现交叉凝集现象，人的R型也可以被四中抗血清凝集，但S型只能被人抗RV血清凝集。
证明动物感染RV后产生两中抗体：抗内衣壳的群特异性抗体，产生种间交叉反应。
抗外衣壳的种特异性抗体，中和抗体或保护性抗体作用。
1.4 培养特性 1980年美国的Waytt将人的Wa株首次利用非洲绿猴肾原代细胞培养成功。
轮状病毒在体外不易培养。
轮状病毒在培养的过程中需要用胰酶处理，病毒接种前用终浓度为10ug/ml的胰酶处理。
病毒接种24h后就可出现细胞病变，表现为细胞肿大变圆、边缘模糊、细胞聚集、萎缩，有的细胞间有胞浆相连，最后细胞死亡脱落。
随着传代次数的增加，病变程度加深，出现病变的时间也越来越快。
病毒接种后一般用不含血清的维持液培养。
但是黄旭雯等人在研究鸡血清对轮状病毒增殖的影响中发现，鸡血清(CS)能增加单层细胞的活力，延迟细胞衰老2～3d，但细胞对病毒的易感性降低。
同时添加4%的CS和10mg/L 的胰蛋白酶效果最好，细胞病变明显，细胞单层能维持到被病毒破坏为止，有利于RV的复制。
轮状病毒感染细胞具有特定的趋向性。
在体内只感染肠绒毛的上皮细胞，在体外尽管可以吸附许多细胞，但是只感染肾或肠道上皮细胞来源的细胞。
轮状病毒可以在MA-104、CV-1、MARC-145等细胞系培养，但最适合用MA-104培养。
Carlos A.Guerrero等人通过不同的方法处理MA-104细胞，然后用RRV，SA11，SA感染来检验细胞上的受体，结果发现N-多聚糖(N-glycans)、神经节苷脂(gangliosides)、胆固醇类(cholestero1)及其相关的蛋白质是不同基因型的轮状病毒侵入细胞的不同受体。
2 流行病学 2.1 传染源 病猪、隐性感染及带病毒者是本病的传染源，由于后两者不易被发现，因而起着重要的传染源作用。
2.2 传播途径 RV通过密切接触尤其是粪-口途径引起传播或流行;呼吸道传播和垂直传播也已被证实。
2.3 易感动物 自然情况下，多发于2～56日龄仔猪，成年猪感染不会发生严重的临床症状。
KaminjoIo JS等的实验表明RV检出率最高的仔猪周龄为2～8周龄(91.1%)，检出率峰值为8周龄仔猪。
Gelerg等发现仔猪体内排出RV的峰值周龄是3～4周龄。
Morilla认为非典型RV感染仔猪的日龄要小于A型，因母猪不能通过被动免疫保护其仔猪口。
RV感染具有明显的季节性，高峰在晚秋及冬季，步数地区季节性不明显而呈终年流行。
散发，偶见爆发。
一旦发生本病，随后将每年连续发生，因为RV在体外有较强的抵抗力，且隐性感染的成年动物不断向外排毒。
3 临床症状 病初，病猪精神不振，食欲不良，不愿活动。
随后出现呕吐和腹泻。
腹泻是本病的主要症状，粪便呈黄色、灰色或黑色，水样或糊样，严重者带有黏液和血液。
腹泻3～4d后，部分病例出现严重脱水。
此病多在2～3d内恢复，死亡率一般为10%。
如继发其他疾病，使病情恶化，死亡率可达10%～20%。