植物基因的图位克隆

#综述与专论#

植物基因的图位克隆¹

M ap-based Cloning for Pla nts Ge ne

王泽立1戴景瑞2王斌3

WA N G Ze-li1DA I Jing-ru i2WAN G Bin3

1山东农业大学,泰安271018;2中国农业大学,北京100094;3中国科学院遗传所,北京100101

1Shandong Agr icultur al Universit y,Tai-an271018;2China Agr icultur al University,Beijing100094;3Institute of Genetics of Chinese Academy of Science,Beijing100101,China

摘要:图位克隆是分离基因的有效方法,本文概述了植物基因图位克隆的研究进展,主要包括图位克隆的一般策略、相关技术、发展前景和其它基因组领域研究于其带来的有益借鉴。

关键词:分离群体;分子标记;基因;图位克隆

A bstra ct:Map-based cloning has already become a valuable method for gene isolation.This paper summarized the pro2

gresses of the map based cloning and described the strategies in which should be adopted to clone a gene in plant.And,the main steps for map based cloning are di scussed also.

K e y word:Segr egate population;molecular marker;gene;map-based cloning

中图分类号:Q943.2文献标识码:A文章编码:1002-5464(2000)04-021-07

随着作物遗传水平的不断提高和对生物新技术的渴求,研究者对诸如育种材料的遗传多样性、亲本选择指标、后裔评价方法等提出了更高的要求。因此从表现型选择到基因型鉴别,特别是对有益基因定位、克隆、转移和累加,是人们为获取高产、优质、多抗新品种(系)而应该关注的研究工作。然而无论对于控制质量性状的单(寡)基因还是与大多数农艺性状有关的微效多基因来说,对其进行克隆都需要建立和发展相关的技术和方法。现代遗传学的发展为建立基因克隆新技术提供了理论指导。从遗传学的观点来看,克隆基因的途径可概括为正向遗传学和反向遗传学两种。正向遗传学途径指的是通过被克隆基因的产物或表现型突变去进行;反向遗传学途径则指的是依据被克隆基因在染色体上的位置来实现。由于绝大多数控制重要农艺性状的基因产物及调控机制尚不清楚,走正向遗传学之路困难较多,而反向遗传学途径则显示出较好的前景。

循反向遗传学途径克隆基因有三种主要方法可资利用,分别是转座子示踪法、随机突变体筛选法和图位克隆法。其中,转座子受其种类、活性、数量的制约,随机突变体筛选法则随机性较大且不能控制失活基因的种类和数量,也限制了其使用。比较而言,图位克隆法随着相关配套技术的日渐成熟,数十个与农业生产密切相关的作物基因已被成功的克隆[1,2,3,4,17,18,19](表1)。本文拟对图位克隆的研究进展做一介绍,以期对植物遗传育种和分子生物学研究有所助益。

1图位克隆的一般策略

图位克隆(Map-based cloning)又称定位克隆(positional cloning),1986年首先由剑桥大学的Alan coulson提出[5],用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的,无需预先知道基因的DNA顺序,也无需预先知道其表达产物的有关信息,但应有以下两方面的基本情况:一是有一个根

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¹作者简介:王泽立,1957年生,男,博士,教授。主要研究方向:玉米遗传育种。

收稿日期:2000-01-20

据目的基因的有无建立起来的遗传分离群体,如F、DH、BC、RI等。二是开展以下几项工作:1)首先找到与目标基因紧密连锁的分子标记;2)用遗传作图和物理作图将目标基因定位在染色体的特定位置;

3)构建含有大插入片段的基因组文库(BAC库或YAC);4)以与目标基因连锁的分子标记为探针筛选基因组文库;5)用获得阳性克隆构建目的基因区域的跨叠群;6)通过染色体步行、登陆或跳跃获得含有目标基因的大片段克隆;7)通过亚克隆获得含有目的基因的小片段克隆;8)通过遗传转化和功能互补验证最终确定目标基因的碱基序列。下面将对其中几个关键环节予以叙述。

表1迄今已发表的用图位克隆法克隆到的植物基因

基因植物突变表型基因同源序列文献

AB13拟南芥脱落酸不敏感玉米转录子Girandat,et al.1992 FID3拟南芥降低亚油酸饱和度细菌去饱和酸酶Arondel,et al.1992

Bent,et al.1994 AXR1拟南芥生长素抗性泛素N端活性酶Leyser,et al.1993 ETR1拟南芥乙烯抗性双因子调节子Chang,et al.1993 ABI1拟南芥脱落酸不敏感钙调蛋白磷酸化酶Leung,et al.1994 DET1拟南芥黄化损伤反应新核蛋白Pepper,et al.1994 RPS2拟南芥抗病新型富含亮氨酸的蛋白酶Mindrino s,et al.1994 RPM1拟南芥抗病激酶Grant.1995

RSW1拟南芥纤维素合成酶细胞色素P450家系Arioli,et al.1998 ZLL拟南芥调节中茎分生细胞胚胎发育蛋白Motuschak,et al.1998 PRT1拟南芥抑制胞间蛋白降解控制植物N端代谢Potuschak,et al.1998 Tornadol拟南芥短化Cnops,et al.1996

Cf-2番茄抗软腐病亮氨酸重复蛋白Dixon,et al.1996

Pto番茄抗霜霉病丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶Mart in,et al.1993 CHLO-番茄铁吸收香素合成酶Ling HQ,et al.1997 Rpg1,Rpg4大麦抗虫未知Kilian,et al.1997 Mlo大麦抗黄矮病膜定位蛋白及络蛋白激酶Bilschges,et al.1997 Rarl大麦抗黄矮病蛋白激酶Lahage,et al.1997 Xa21水稻抗白叶枯病受体激酶Song,et al.1995

Grant1995

Xal水稻抗白叶枯病NBS-LRR Yoshimura et al.,1998 I2C水稻抗枯萎病蛋白激酶Cri N,et al.1997

Pi-b水稻抗稻瘟病蛋白激酶Monna et al.,1997

2图位克隆的技术环节

2.1构建遗传作图群体

用于作图群体的类型可有多种。一般说来,在这类群体中,异花授粉植物分子标记的检出率较自花授粉植物的高。但是对于基因的图位克隆而言,培育特殊的遗传群体是筛选与目标基因紧密连锁的分子标记的关键环节。这些遗传材料应该满足这样的条件:即除了目标基因所在座位的局部区域外,基因组DNA序列的其余部分都是相同的,在这样的材料间找到的多态性标记才可能与目标基因紧密连锁。

目标基因的近等基因系(NILs)是符合条件的一类群体。近等基因系是指几乎仅在目标性状上存在差异的两种基因型个体,这可通过连续回交的途径获得。由于NILs的遗传组成特点,一般凡是能在近等基因系间揭示多态性的分子标记就极有可能位于目标基因的两翼附近。Martin等(1993)就是用RAPD技术分析番茄Pto基因的近等基因系而获

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