中国海洋大学生物化学实验报告

实验一蛋白质含量测定本实验的目的是学会各种蛋白质含量的测定方法。

了解各种测定方法的基本原理和优缺点。

蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。

目前常用的有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩尿法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。

另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝法（Bradford法）。

其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10～20倍，比Biuret法灵敏100倍以上。

定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。

值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。

每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。

在选择方法时应考虑：①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时间。

考马斯亮蓝法（Bradford法），由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。

（一）实验原理双缩脲法（Biuret法）和Folin—酚试剂法（Lowry法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。

1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。

这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。

这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。

考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（λmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。

经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。

在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。

Bradford法的突出优点是：（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1μg。

这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。

（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。

完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。

由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。

因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。

（3）干扰物质少。

如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。

此法的缺点是：（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用γ—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。

（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH。

（如同0.1N的酸干扰Lowary法一样）。

（3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。

（二）试剂与器材1. 试剂：（1）标准蛋白质溶液，用γ—球蛋白或牛血清清蛋白(BSA)，配制成 1.0mg/ml 和0.1mg/ml的标准蛋白质溶液。

（2）考马斯亮兰G—250染料试剂：称100mg考马斯亮兰G—250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀释至1升。

2. 器材：（1）可见光分光光度计（2）旋涡混合器（3）试管16支（三）操作方法1. 标准方法（1）取16支试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分为两组按表中顺序，分别加入样品、水和试剂，即用1.0mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用无离子水补充到0.1ml。

最后各试管中分别加入5.0ml考马斯亮兰G—250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）。

未知样品的加样量见下表中的第8、9、10管。

（2）加完试剂2~5分钟后，即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值A595，空白对照为第1号试管，即0.1mlH2O加5.0mlG—250试剂。

注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。

塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。

考马斯亮兰法实验表格：（3）用标准蛋白质量（μg）为横座标，用吸光度值A595为纵座标，作图，即得到一条标准曲线。

由此标准曲线，根据测出的未知样品的A595值，即可查出未知样品的蛋白质含量。

0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.50。

2. 微量法当样品中蛋白质浓度较稀时（10－100μg/ml）,可将取样量（包括补加的水）加大到0.5ml或1.0ml, 空白对照则分别为0.5ml或1.0ml H2O, 考马斯亮蓝G－250试剂仍加5.0ml, 同时作相应的标准曲线，测定595nm的光吸收值。

0.05mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.29。

实验二SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法—蛋白质的分子量测定【实验目的】1.掌握SDS—聚丙烯酰胺电泳法的原理。

2.学会用此种方法测定蛋白质的分子量。

【实验原理】SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)是对蛋白质进行量化，比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。

该法主要依据蛋白质的分子量对其进行分离。

SDS与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并使其稳定地存在于一个广泛均一的溶液中。

SDS—蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。

由于在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，而电荷因素可以被忽略。

SDS—PAGE因易于操作和广泛的用途，使它成为许多研究领域中一种重要的分析技术。

SDS是十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate）的简称，它是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与SDS的结合比为1.4gSDS/1g蛋白质），使各种蛋白质—SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。

这样就使电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，于是根据标准蛋白质分子量的对数和迁移率所作的标准曲线，可求得未知物的分子量。

【实验材料】1.实验器材微型凝胶电泳装置；电源（电压200V，电流500mA）；100℃沸水浴；Eppendorf 管；微量注射器（50μl或100μl）；干胶器、真空泵或水泵；带盖的玻璃或塑料小容器；摇床。

2.实验试剂⑴2mol/L Tris-HCl (pH8.8):取24.2g Tris, 加50ml蒸馏水，缓慢的加浓盐酸至pH8.8（约加4ml）；让溶液冷却至室温，pH将会升高，加蒸馏水至100ml。

⑵1mol/L Tris-HCl (pH8.8):取12.1g Tris, 加50ml蒸馏水，缓慢的加浓盐酸至pH6.8（约加8ml）；让溶液冷却至室温，pH将会升高，加蒸馏水至100ml。

⑶ 10% (w/v) SDS: 取10g的SDS，加蒸馏水至100ml。

⑷ 50% (v/v) 甘油: 取50ml 100%甘油，加入50ml蒸馏水。

⑸ 1% (w/v) 溴酚蓝:取100mg溴酚蓝，加蒸馏水至10ml，搅拌,直到完全溶解，过滤除去聚合的染料。

⑹ A液--丙烯酰胺储备液（配制含30% (w/v) 丙烯酰胺和0.8% (w/v) 甲叉双丙烯酰胺的溶液100ml）在通风柜中操作，取29.2g丙烯酰胺，0.8g甲叉双丙烯酰胺，加蒸馏水至100ml，缓慢搅拌直至丙烯酰胺粉末完全溶解，用石蜡膜封口，可在4℃存放数月。

⑺ B液--4×分离胶缓冲液：取75ml 2mol/L Tris-HCl (pH8.8)，加入4ml 10% SDS, 加21ml蒸馏水，混匀，可在4℃存放数月。

⑻ C液--4×浓缩胶缓冲液:取50ml 1mol/L Tris-HCl (pH6.8)，加入4ml 10% SDS, 加46ml蒸馏水，混匀，可在4℃存放数月。

⑼10%过硫酸铵：取0.5g过硫酸铵，加入5ml蒸馏水，可保存在密封的管内，于4℃存放数月。

⑽电泳缓冲液：取3g Tris，14.4g甘氨酸，1g SDS，加蒸馏水至1L, pH约为8.3, 也可配制成10×的储备液，在室温下长期保存。

⑾ 5×样品缓冲液：取0.6ml 1mol/L Tris-HCl (pH6.8)，加入2ml 10% SDS, 5ml 50%的甘油，0.5ml 2-巯基乙醇，1ml 1%溴酚蓝，0.9ml的蒸馏水混匀，可在4℃保存数周，或在-20℃保存数月。

⑿考马斯亮蓝染液：1.0g 考马斯亮蓝R-250，加入450ml甲醇，450ml蒸馏水及100ml冰醋酸即成。

⒀考马斯亮蓝脱色液：将100ml甲醇，100ml冰醋酸，800ml蒸馏水混匀备用。

（14）标准蛋白：牛血清白蛋白：Mw=67,000（上海生化所）鸡卵清清蛋白：Mw=45,000（美国SIGMA公司）胰凝乳蛋白酶原A：Mw=24,000（美国SIGMA公司）溶菌酶：Mw =14,300（15）未知蛋白质样品：由实验室准备【实验操作】1.灌制分离胶⑴组装凝胶模具: 可按照使用说明书装配好灌胶用的模具。

对于Bio-Rad的微型凝胶电泳系统，在上紧螺丝之前，必须确保凝胶玻璃板和隔片的底部与一个平滑的表面紧密接触，有细微的不匹配就会导致凝胶的渗漏。

⑵将A液、B液及蒸馏水在一个小烧瓶或试管中混合，丙烯酰胺(A液中)是神经毒素，操作时必须戴手套。

加入过硫酸铵和TEMED后，轻轻搅拌使其混匀(过量气泡的产生会干扰聚合)。

凝胶很快会聚合，操作要迅速。

小心将凝胶溶液用吸管沿隔片缓慢加入模具内，这样可以避免在凝胶内产生气泡。

⑶当加入适量的分离胶溶液时(对于小凝胶，凝胶液加至约距前玻璃板顶端1.5cm或距梳子齿约0.5cm)，轻轻在分离胶溶液上覆盖一层1mm～5mm的水层，这使凝胶表面变得平整。

当凝胶聚合后，在分离胶和水层之间将会出现一个清晰的界面。

2.灌制浓缩胶⑴吸尽覆盖在分离胶上的水后将A液、C液和蒸馏水在三角烧瓶或小试管中混合。

加入过硫酸铵和TEMED，并轻轻搅拌使其混匀。