三种室内饲养鱼类肠道微生物群落PCR_DGGE指纹分析_李学梅
第35卷 第3期 水生生物学报 Vol. 35, No.3 2011年5月 ACTA HYDROBIOLOGICA SINICA May, 2 0 1 1
收稿日期: 2010-06-28; 修订日期: 2011-01-19 基金项目: 国家重点基础研究发展计划(2007CB109205); 国家自然科学基金(30970358)资助 作者简介: 李学梅(1985—), 女, 河北邯郸人; 博士研究生; 主要从事鱼类肠道微生物研究。E-mail: lanqian1985@163.com 通讯作者: 余育和(1956—), 男, 湖南汨罗人; 研究员; 主要从事原生动物学研究。E-mail: yhyu@ihb.ac.cn
DOI: 10.3724/SP.J.1035.2011.00423 三种室内饲养鱼类肠道微生物群落PCR-DGGE指纹分析 李学梅1,3 余育和1 解绶启2 颜庆云1 陈宇航2,3 董小林2,3
(1. 中国科学院水生生物研究所, 中国科学院水生生物多样性与保护重点实验室, 武汉430072; 2. 中国科学院水生生物研究所, 淡水生态与生物技术国家重点实验室, 武汉 430072; 3. 中国科学院研究生院, 北京100049)
摘要: 以室内饲养的斑点叉尾(Ictalurus punctatus)、银鲫和异育银鲫(中科三号)(Carassius auratus gibelio)幼鱼为对象, 通过PCR-DGGE指纹技术对其肠道微生物群落进行了探索研究。在三种鱼的肠道中检测到不同的PCR-DGGE指纹谱带, 其中斑点叉尾的平均谱带数(7.5)相对于银鲫和异育银鲫的谱带数(分别为15 和14)要少。基于PCR-DGGE指纹谱带及各谱带相对丰度的UPGMA聚类和MDS排序结果显示银鲫和异育银鲫肠道微生物相似性高, 而与斑点叉尾的差异比较大; rank-abundance散点图及回归分析也显示斑点叉尾与银鲫、异育银鲫肠道微生物群落存在显著差异(P<0.05), 而银鲫和异育银鲫之间无显著差异(P= 0.383)。在斑点叉尾肠道中检测到的菌群主要是变形杆菌, 包括γ-变形杆菌和α-变形杆菌; 而银鲫和异育银鲫肠道中菌群主要包括梭杆菌属中的类群, 还包括变形杆菌门中的气单胞菌属, 以及一些未知的类群。以上结果均表明在所研究的三种鱼的幼鱼阶段, 其肠道微生物组成在不同种类鱼中存在差异, 且该差异受基因型的影响可能更大。
关键词: 斑点叉尾; 银鲫; 异育银鲫; PCR-DGGE; 肠道微生物群落 中图分类号: Q145+.2; Q781 文献标识码: A 文章编号: 1000-3207(2011)03-0423-07
肠道微生物是一个复杂多样的群体, 同时也是动物体的重要组成部分。鱼类肠道中每克内含物中大约存在108个异养性微生物和105个厌氧细菌, 它们与宿主相互依存并相互影响[1,2]。肠道菌群在鱼类的生长发育过程中担当非常重要的作用, 它既要参与营养物质的消化和吸收, 同时也要担当机体的防御功能, 维护机体健康。Rawls, et al.[3,4]在对斑马鱼肠道菌群进行研究时发现, 肠道菌群能够促进其上皮细胞增殖, 增强营养物种代谢和免疫反应。同样, 鱼类的各种生理生态特征也会对肠道微生物产生影响: 已有研究报道指出不同生长环境下鱼类的肠道细菌群落有明显的差异[5]; 鱼类生长发育会对肠道微生物组成造成影响[6] ; 另外, 鱼类进食的质量和数量也可影响其肠道微生物群落结构[7]。尽管如此, 关于比较不同种类鱼肠道微生物群落结构的报道还较少。不同种类的鱼, 由于其食性、基因等因素, 它们的肠道细菌组成和结构也不尽相同。Ward, et al. [8]
在研究两种南极抗冻鱼肠道微生物群落特征时发现: 杂食性的N. coriiceps肠道微生物的多样性比肉食性的C. aceratus丰富, 说明同一环境下食性不同的鱼其肠道微生物组成亦不相同。上述研究是以自然环境中的鱼类为研究对象, 那么在同一室内饲养的不同鱼类其肠道微生物群落是否也会存在差异？本研究以室内饲养的斑点叉尾(Ictalurus punctatus)、普通银鲫和异育银鲫(中科三号)(Carassius auratus gibelio) 幼鱼为研究对象, 采用PCR-DGGE指纹法分析其肠道微生物组成, 旨在比较不同种类鱼在室内养殖条件下肠道微生物群落结构特征, 为进一步424 水生生物学报 35卷 研究不同肠道细菌的功能提供基础依据。 1 材料与方法 1.1 样品采集 斑点叉尾、银鲫和异育银鲫(中科三号)饲养于
中国科学院水生生物研究所鱼类生理生态学学科组的试验系统中, 每种鱼设有三个重复。三种鱼饲养于同一室内的不同循环系统中, 其水源一致, 且投喂的人工配合饲料成分基本相同。试验期间, 水温在23℃—30℃范围内波动, 每天 9:00和 15:00分别投喂人工配合饲料。30d后, 随机从各组选取3尾同规格的个体(平均约15 g), 饥饿 24h后进行解剖取样。鱼体解剖后取整个肠道, 用70%的酒精棉球擦拭肠外壁后分别取前、中、后三段, 用无菌水冲洗各段肠道并收集洗液到无菌的离心管中。最后将来自同一重复的3尾鱼的洗液混合, 收集好的混合液用于肠道细菌群落总DNA的提取[9]。
1.2 肠道微生物群落总DAN提取 向每管混合液中加入1 mL裂解液(0.5% SDS; 10 mmol/L Tris-Cl, pH 8.0; 10 mmol/L EDTA, pH 8.0; 100 mmol/L NaCl; 蛋白酶 K, 100 μg/mL; RNase A, 50 μg/mL), 于55℃水浴裂解12h; 恢复室温后离心取上清液采用常规的酚-氯仿法进行抽提, DNA干燥后重悬于40 µL TE(10 mmol/L Tris-Cl, 1 mmol/L EDTA, pH 8.0), 存于20℃备用。总DNA用0.7%的琼脂糖凝胶(含EB)进行电泳以评估提取效果。 1.3 PCR-DGGE及序列分析 采用针对16S rRNA基因的通用引物(F357-GC和R518)对9个样品中的肠道细菌进行PCR-DGGE指纹分析[10-12], 其中变性剂梯度范围为35%—50%。
并对PCR-DGGE指纹图谱中的部分条带进行序列分析: 首先将切下的胶条用 50 μL TE于4℃重悬过夜洗脱胶中的 DNA, 离心后取上清 1 μL作模板用不含 GC夹板的上述引物重新进行 PCR扩增。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收纯化。将纯化的 DNA 片段连接到pMD18-T载体中, 克隆后筛选阳性克隆送上海桑尼生物科技有限公司测序。将所测得的目的序列在NCBI进行BLAST比对, 并从GenBank下载相似物种的16S rRNA基因序列。通过Clustal X程序进行多序列对位排列[13], 经校对和剪
切后通过MEGA程序采用NJ法建立系统发育树[14]。 1.4 数据分析 PCR- DGGE指纹图谱用Quantity One(Bio-Rad
Laboratories, CA, USA)软件进行分析。不同种类鱼肠道微生物群落结构的相似性通过Dice相似系数来比较, 该系数由公式S=2NAB/(NA + NB)所得, 其中
NAB表示两站点的共有谱带数; NA 和 NB 分别代表
站点A 和 B 特有的谱带数, 进而针对Dice相似系数进行非加权配对算术平均法聚类(UPGMA)和多维尺度分析(MDS)。不同种类鱼肠道微生物群落结构的差异则是通过rank-abundance散点图来分析, 其中x轴表示每个处理样品中DGGE条带的相对丰度大小的排序, y轴表示DGGE条带的相对丰度(经log10转换)。每个样品对应的线性回归模型则由方程
log10y＝a +bx表示, 其中a是截距, b是斜率——群落
结构变化的统计描述[15]。UPGMA和MDS由软件
XLSTAT-Pro来完成, 线性回归分析由软件SPSS 13.0来完成。
2 结果 2.1 肠道微生物群落PCR-DGGE指纹分析 针对三种鱼肠道细菌的16S rRNA基因得到相对简单和稳定的DGGE指纹分析图谱 (图 1)。由图
图1 16S rDNA变性梯度凝胶电泳(DGGE)图谱 Fig. 1 DGGE patterns of 16S rDNA L1-L3表示斑点叉尾; L4-L6表示银鲫; L7-L9表示异育银鲫“中科三号”; B1-B14表示测序条带 L1-L3 indicate the samples collected from channel catfish, L4-L6 and L7-L9 from silver prussian carp and hybridized prussian carp, respectively; B1-B14 indicate the bands sequenced 3期 李学梅等: 三种室内饲养鱼类肠道微生物群落PCR-DGGE指纹分析 425 可以看出斑点叉尾的其中一个重复和另外两个重复稍有差异, 而银鲫和异育银鲫的三个重复所得谱带相对稳定。三种鱼分别平均检测到7.5、15和14条清晰的谱带, 这些谱带代表不同的分类单元(OTU)。另外, 银鲫和异育银鲫检测到的共有谱带较多, 与斑点叉尾的共有谱带较少。 2.2 肠道微生物群落结构比较 依据DGGE指纹谱带的丰富度(由1/0矩阵表示)和细菌分类单元的丰度(每个条带的相对亮度), 分别对三种鱼类肠道微生物群落结构相似性进行比较。基于Dice相似系数的UPGMA聚类和MDS排序均显示银鲫的3个重复(L4-L6)和异育银鲫(L7-L9)聚为一大枝, 而斑点叉尾的3个重复(L1-L3)聚为另外一枝(图2)。这说明银鲫和异育银鲫的肠道微生物群落结构相似性高于它们与斑点叉尾的相似性。 为了能更清晰地了解群落结构的变化, 用rank- abundance回归直线图来表示不同处理样品中细菌类群的丰度, 而平均斜率则是对其细菌类群均度的统计性描述(图3)。对平均斜率进行方差分析, 结果显示: 三种鱼的肠道微生物群落结构存在显著差异(F=16.620, P<0.05)。不同种类鱼之间的比较分析发现, 斑点叉尾与银鲫、异育银鲫的群落结构有显
图2 16S rDNA指纹图谱的相似性比较 Fig. 2 Comparison of similarity based on DGGE fingerprints of 16S rDNA (a) 基于16S rDNA谱带的UPGMA聚类; (b) 基于16S rDNA谱带的MDS排序; L1-L9标记同图1 (a) UPGMA clustering on the basis of 16S rDNA bands; (b) MDS ordination on the basis of 16S rDNA bands; L1-L9 follow as Fig. 1
利用RAPD指纹分析技术分析三种鲤科鱼群体的遗传变异
利用RAPD指纹分析技术分析三种鲤科鱼群体的遗传变异张金洲;项智锋;李学斌;王清华;张廷虎;赵海涛;郭玉娇【期刊名称】《生命科学仪器》【年(卷),期】2008(006)005【摘要】利用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术对鲤鱼、鳙鱼、武昌鱼种群间的亲缘关系进行分析.结果显示:武昌鱼与鳙鱼、武昌鱼与鲤鱼的遗传距离(D)相近,分别为0.6547、0.6522,而鲤鱼与鳙鱼之间的遗传距离为0.5873.这表明,鲤鱼、鳙鱼间的亲缘关系比武昌鱼、鳙鱼,武昌鱼、鲤鱼之间的亲缘关系都近.【总页数】3页(P58-60)【作者】张金洲;项智锋;李学斌;王清华;张廷虎;赵海涛;郭玉娇【作者单位】河南科技学院动物科学学院,河南新乡,453003;河南科技学院动物科学学院,河南新乡,453003;河南科技学院动物科学学院,河南新乡,453003;河南科技学院动物科学学院,河南新乡,453003;河南科技学院动物科学学院,河南新乡,453003;河南科技学院动物科学学院,河南新乡,453003;河南科技学院动物科学学院,河南新乡,453003【正文语种】中文【中图分类】Q95【相关文献】1.利用RAPD标签分析3种鲤科鱼群体的遗传变异 [J], 张金洲;项智锋;王清华;李学斌;赵海涛;张廷虎;郭玉娇2.利用RAPD指纹分析技术分析3种鲤科鱼群体的遗传变异 [J], 张金洲;项智锋;李学斌;王清华;张延虎;赵海涛;郭玉娇3.草鱼和鲤群体遗传变异的RAPD指纹分析 [J], 章怀云;刘荣宗4.中国鲤科鱼类染色体组型的研究Ⅺ．裂腹鱼亚科二种鱼和鳅鮀亚科三种鱼的染色体组型 [J], 李渝成;李康;桂建芳;周暾5.异源四倍体鲫鲤及其原始亲本遗传变异的RAPD分析 [J], 李建中;鲁双庆;刘少军;刘正华;张轩杰;刘筠因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
3种淡水鱼病原菌多重PCR检测方法的建立与应用
3种淡水鱼病原菌多重PCR检测方法的建立与应用胡宗云;杨培民;闫有利【期刊名称】《水产科学》【年(卷),期】2022(41)4【摘要】根据辽宁地区常见淡水鱼病原菌嗜水气单胞菌、迟钝爱德华氏菌、蜡样芽孢杆菌的相关毒力因子,选择特异性较强的嗜水气单胞菌的溶血素(hlyA)基因、迟钝爱德华氏菌的效应蛋白(eseD)基因、蜡样芽孢杆菌非溶血性肠毒素(nheA)基因为分子靶标,分别设计1对特异性引物,建立可同步检测3种菌的多重PCR检测体系。
研究结果显示,在3个毒力基因引物浓度均为0.4μmol/L,模板质量浓度为2.5ng/μL,dNTP和酶添加量分别为2.5μL和0.3μL,退火温度为55℃时,各目的片段均可较好地扩增。
敏感性试验结果表明,建立的多重PCR对嗜水气单胞菌、迟钝爱德华氏菌和蜡样芽孢杆菌的最低检测量分别为4.8、3.0ng和2.6ng。
对临床分离的菌株样本进行检测,与16SrDNA分子鉴定结果的符合率为100%。
建立的多重PCR体系检测方法特异、灵敏、快速,可同步完成淡水鱼源的嗜水气单胞菌、迟钝爱德华氏菌和蜡样芽孢杆菌的检测。
【总页数】9页(P605-613)【作者】胡宗云;杨培民;闫有利【作者单位】辽宁省淡水水产科学研究院【正文语种】中文【中图分类】S917.1【相关文献】1.阴道感染三种病原菌多重PCR检测方法的建立及其应用研究2.同步检测海水养殖动物5种病原菌的扩增子拯救多重PCR(Arm-PCR)方法的建立与应用3.检测奶牛乳房炎主要病原菌的多重PCR方法的建立与应用4.淡水鱼中3种吸虫囊蚴多重PCR检测方法的建立5.奶牛乳房炎4种常见病原菌多重PCR检测方法的建立及初步应用因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
肉鸭肠道微生物空间异质性分析
中国畜牧兽医 2024,51(4):1329-1338C h i n aA n i m a lH u s b a n d r y &V e t e r i n a r y Me d i c i n e肉鸭肠道微生物空间异质性分析牟启铭,刘大鹏,于思梦,鲁美希,刘 同,王 真,唐贺贺,侯水生,周正奎(中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,农业农村部动物遗传育种与繁殖(家禽)重点实验室,北京100193)摘 要:ʌ目的ɔ本试验旨在通过宏基因组测序㊁物种注释和功能注释比较肉鸭不同肠段的微生物群落多样性㊁种类㊁相对丰度差异,探究肉鸭肠道微生物的空间异质性㊂ʌ方法ɔ选取饲养于相同环境的6周龄北京鸭和连城白鸭共6个个体,依次采集其十二指肠㊁空肠㊁回肠和盲肠内容物,基于宏基因组测序方法获得肠道微生物的种类和相对丰度㊂基于微生物丰度表,利用w i l c o x o n 秩和检验进行不同肠段的优势微生物㊁微生物种类数㊁微生物相对丰度㊁微生物群落多样性和微生物功能多样性差异比较,并利用t 检验筛选了北京鸭和连城白鸭各肠段的显著差异菌属㊂ʌ结果ɔ本试验共鉴定到45个菌门㊁84个菌纲㊁186个菌目㊁418个菌科㊁1400个菌属和3467个菌种㊂其中4个肠段的优势菌门均为厚壁菌门(F i r m i c u t e s )㊁拟杆菌门(B a c t e r o i d e t e s )㊁变形菌门(P r o t e o b a c t e r i a )和放线菌门(A c t i n o b a c t e r i a ),四大菌门在不同肠段之间分布存在差异㊂4个肠段的优势菌属均为拟杆菌属(B a c t e r o i d e s )和P h o c a e i c o l a 等10个相同菌属,而且优势菌属的种类和丰度在不同肠段存在组间差异㊂从十二指肠到盲肠,微生物的组成㊁相对丰度和群落多样性变化显著(P <0.05),其中十二指肠㊁空肠和回肠的微生物组成相似性很高,与盲肠微生物存在明显分离;同时,盲肠微生物的群落多样性也极显著高于其他肠段(P <0.01)㊂与十二指肠㊁空肠㊁回肠相比,盲肠微生物的细菌趋化性㊁氨基糖㊁核苷酸糖代谢脂肪酸的生物合成等代谢通路均上调,且盲肠富集到31个北京鸭和连城白鸭差异菌属,数量高于十二指肠㊁空肠㊁回肠㊂ʌ结论ɔ肉鸭盲肠富集的微生物数量㊁相对丰度㊁群落多样性均高于十二指肠㊁空肠和回肠㊂本研究结果为解析肉鸭肠道微生物调控机制和精准调控肉鸭的能量代谢水平和免疫机能提供理论依据,为肉鸭肠道微生物的进一步研究提供借鉴㊂关键词:鸭;肠道微生物;宏基因组;空间异质性中图分类号:S 834文献标识码:AD o i :10.16431/j .c n k i .1671-7236.2024.04.001 开放科学(资源服务)标识码(O S I D ):收稿日期:2023-09-20基金项目:中国农业科学院科技创新工程重大科研任务(C A A S -Z D RW 202104)联系方式:牟启铭,E -m a i l :m y s m q m 1027@126.c o m ㊂通信作者周正奎,E -m a i l :z h o u z h e n gk u i @c a a s .c n S p a t i a lH e t e r o g e n e i t y A n a l ys i s o fG u tM i c r o b i o t a i n M e a tD u c k s MU Q i m i n g ,L I U D a p e n g ,Y US i m e n g ,L U M e i x i ,L I U T o n g,WA N GZ h e n ,T A N G H e h e ,H O US h u i s h e n g ,Z H O UZ h e n gk u i (S t a t eK e y L a b o r a t o r y o f A n i m a lG e n e t i c s ,B r e e d i n g a n dR e p r o d u c t i o n (P o u l t r y ),M i n i s t r y o f A g r i c u l t u r e a n dR u r a lA f f a i r s ,I n s t i t u t e o f A n i m a lS c i e n c e o f CA A S ,B e i j i n g 100193,C h i n a )A b s t r a c t :ʌO b j e c t i v e ɔT h e p u r p o s e o f t h i s s t u d y w a s t o c o m p a r e t h e d i v e r s i t y ,s pe c i e s a n d r e l a t i v e a b u n d a n c e o fm i c r o b i a l c o m m u n i t y i nd if f e r e n t i n t e s t i n a l s eg m e n t s o fm e a t d u c k s b y m e t a ge n o m e s e q u e n c i n g ,s p e c i e s a n n o t a t i o n a n df u n c t i o n a l a n n o t a t i o n ,s o a s t o e x p l o r e t h e s p a t i a l h e t e r og e n e i t y o f g u tm i c r o b i o t a i nm e a t d u c k s .ʌM e th o d ɔT h e c o n t e n t s o f d u o d e n u m ,j e ju n u m ,i l e u ma n dc e c u m w e r e c o l l e c t e df r o m 6-w e e k -o l d B e i j i n g d u c k sa n d L i a n c h e n g W hi t ed u c k sr a i s e di nt h es a m e e n v i r o n m e n t i n t u r n ,a n dt h es p e c i e sa n dr e l a t i v ea b u n d a n c eo f g u tm i c r o b i o t aw e r eo b t a i n e db y m e t a g e n o m e s e q u e n c i n g.B a s e d o n t h em i c r o b i a l a b u n d a n c e t a b l e ,w i l c o x o n r a n k s u mt e s tw a s u s e d t oc o m p a r et h e d i f f e r e n c e s o fd o m i n a n t m i c r o o r g a n i s m s ,m i c r o b i a ls pe c i e s ,m i c r o b i a lr e l a t i v e中国畜牧兽医51卷a b u n d a n c e,m i c r o b i a l c o m m u n i t y d i v e r s i t y a n dm i c r o b i a l f u n c t i o n a l d i v e r s i t y i nd i f f e r e n t i n t e s t i n a l s e g m e n t s,a n d t t e s tw a su s e dt os c r e e nt h es i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n tb a c t e r i a l g e n e r a i nd i f f e r e n t i n t e s t i n a l s e g m e n t s o f P e k i nd u c k s a n dL i a n c h e n g W h i t e d u c k s.ʌR e s u l tɔ45p h y l a,84c l a s s e s,186 o r d e r s,418f a m i l i e s,1400g e n e r aa n d3467s p e c i e s w e r ei d e n t i f i e di nt h i se x p e r i m e n t.T h e d o m i n a n t p h y l ao f t h e f o u r i n t e s t i n a l s e g m e n t sw e r eF i r m a c u t e s,B a c t e r o i d e s,P r o t e o b a c t e r i aa n d A c t i n o m y c e t e s,a n d t h e d i s t r i b u t i o n o ft h ef o u r p h y l ai n d i f f e r e n ti n t e s t i n a ls e g m e n t s w a s d i f f e r e n t.B a c t e r o i d e s a n d P h o c a e i c o l a w e r e t h e d o m i n a n t g e n e r a i n t h e f o u r i n t e s t i n a l s e g m e n t s, a n dt h es p e c i e sa n da b u n d a n c eo ft h ed o m i n a n t g e n e r a w e r ed i f f e r e n ta m o n g t h e g r o u p so f d i f f e r e n t i n t e s t i n a l s e g m e n t s.F r o m d u o d e n u mt oc e c u m,t h ec o m p o s i t i o n,r e l a t i v ea b u n d a n c ea n d c o m m u n i t y d i v e r s i t y o f m i c r o b i o t a c h a n g e d s i g n i f i c a n t l y(P<0.05),a n d t h e m i c r o b i a l c o m p o s i t i o no fd u o d e n u m,j e j u n u m a n di l e u m w a sh i g h l y s i m i l a ra n do b v i o u s l y s e p a r a t e df r o m c e c u m m i c r o b i o t a.A tt h es a m et i m e,t h ec o m m u n i t y d i v e r s i t y o fc e c u m m i c r o b i o t a w a sa l s o s i g n i f i c a n t l y h i g h e r t h a n t h a t o f o t h e r i n t e s t i n a l s e g m e n t s(P<0.01).C o m p a r e dw i t hd u o d e n u m, j e j u n u ma n d i l e u m,t h em e t a b o l i c p a t h w a y s s u c ha sb a c t e r i a l c h e m o t a x i s,a m i n os u g a r,n u c l e o t i d e s u g a rm e t a b o l i z i n g f a t t y a c i db i o s y n t h e s i s o f c e c u m m i c r o b i o t aw e r e u p-r e g u l a t e d,a n d31d i f f e r e n t b a c t e r i a g e n e r a o f B e i j i n g d u c k s a n dL i a n c h e n g W h i t ed u c k sw e r e e n r i c h e d i nc e c u m,w h i c hw e r e h i g h e r t h a n t h a t o f d u o d e n u m,j e j u n u ma n d i l e u m.ʌC o n c l u s i o nɔT h e q u a n t i t y,r e l a t i v e a b u n d a n c e a n dc o m m u n i t y d i v e r s i t y o f m i c r o b i o t ai n c e c u m o f m e a td u c k s w e r e h i g h e rt h a n t h o s ei n d u o d e n u m,j e j u n u m a n di l e u m,w h i c h p r o v i d e dt h e o r e t i c a lb a s i sf o ra n a l y z i n g t h er e g u l a t i o n m e c h a n i s mo f g u tm i c r o b i o t a i n m e a td u c k s,a c c u r a t e l y r e g u l a t i n g e n e r g y m e t a b o l i s ml e v e l a n d i m m u n e f u n c t i o n o fm e a t d u c k s,a n d p r o v i d e d r e f e r e n c e f o r f u r t h e r s t u d y o f g u tm i c r o b i o t a i nm e a t d u c k s.K e y w o r d s:d u c k;g u tm i c r o b i o t a;m e t a g e n o m e;s p a t i a l h e t e r o g e n e i t y肠道是重要的消化器官,从胃部的幽门端开始,一直延伸到肛门,构成了动物消化系统中最长的一段[1]㊂小肠上皮黏膜和黏膜下层向肠腔处伸出大量的微绒毛,增大了营养素的吸收面积;且肠道中有丰富的淀粉酶㊁蛋白酶㊁脂肪酶等,参与水分㊁微量矿物元素㊁脂肪㊁淀粉和蛋白质等物质的消化㊁吸收[2]㊂畜禽的肠道分为十二指肠㊁空肠㊁回肠㊁盲肠等肠段,其作用机制有明显差异[3-4]㊂更重要的是,肠拥道中栖息着大量微生物,它们和宿主消化系统构成了一个统一的整体,参与宿主的营养素消化吸收,并且和宿主的免疫调控㊁生长调控㊁能量代谢等各种生理生化功能有着密切的关系[3]㊂由于肠道微生物对生理生化功能存在重要的作用,近年来,肠道微生物研究受到了广泛的关注,在水禽肠道微生物的研究中也取得了相应的进展,特别是在肠道微生物免疫作用以及饲粮养分如何调节肠道微生物进而影响机体生理代谢等方面取得了较多成果㊂研究发现,蛋鸭盲肠中产甲烷类细菌的相对丰度与卵巢重呈正相关,乳酸菌属相对丰度与脾脏重呈显著正相关[5],这些发现为提高肉鸭的繁殖性能和免疫能力提供了崭新的思路;而且其他研究发现,随着光照时间的增加,鹅各个肠段拟杆菌门的相对丰度上升,其中拟杆菌门和畜禽消化吸收能力有密切关系[6],这对畜禽生产性能的提升提供了重要参考㊂但是,肉鸭不同肠段的空间分布差异目前研究较少,选择哪个肠段进行微生物研究仍然处于未知阶段㊂因此,肉鸭不同肠段的微生物群落结构的差异性和微生物种类㊁相对丰度的差异性需要进一步探究㊂随着宏基因组测序技术快速兴起,为微生物物种注释提供了更加精确的研究方法[7]㊂为了探究肉鸭肠道微生物的空间异质性差异,本研究以北京鸭和连城白鸭为研究对象,通过采集十二指肠㊁空肠㊁回肠㊁盲肠的内容物进行微生物宏基因组测序和物种注释,分析肉鸭肠道不同肠段微生物的组成差异,为理解肉鸭的肠道微生物特征和功能机制等提供一定的理论依据㊂1材料与方法1.1试验动物及表型采集本试验鸭饲养至6周龄,随机挑选饲养状况相03314期牟启铭等:肉鸭肠道微生物空间异质性分析同㊁无疾病的6只雄性个体(3只北京鸭和3只连城白鸭),测定体重㊁料重比,屠宰后采集十二指肠㊁空肠㊁回肠㊁盲肠的内容物㊂用1.5m L无菌冻存管分装后,立即存入液氮,后移入 80ħ保存,用于D N A提取㊂1.2肠道内容物D N A提取、质控及物种注释采用C T A B法提取24个肠道内容物样品的总D N A,使用琼脂糖凝胶电泳鉴定D N A是否降解或出现污染,共计23个样品质检合格㊂将通过检测的样品D N A利用Q u b i t B R稀释到170n g/μL以下,并进行建库和宏基因组二代高通量测序,单个样品的宏基因组测序数据量不少于5G b㊂对于获得的宏基因组r a wr e a d s,首先利用f a s t p(v e r0.20.1)去除接头序列㊁低质量序列(-u20)和低长度序列(--l e n g t h_r e q u i r e d30),获得c l e a nr e a d s[8]㊂将c l e a n r e a d s利用B WA-m e m(v e r0.7.17-r1188)软件比对到I A S C A A S_P e k i n g D u c k_P B H v1.5北京鸭参考基因组(G C A_003850225.1)上,去除宿主基因组污染序列[9]㊂利用K a i j u(v e r1.9.2)比对到K a i j u_ R e f s e q参考序列数据库进行物种组成注释[10]㊂为了进一步降低数据噪音的影响,本研究对物种组成进行了质控,质控标准为:①相对丰度> 10-5;②检出率>25%㊂获得门㊁纲㊁目㊁科㊁属㊁种水平的微生物含量百分比表㊂利用R语言g g p l o t2包(v e r3.4.1)绘制门水平物种累计柱状图,获得十二指肠㊁空肠㊁回肠㊁盲肠的菌门水平的物种组成结果㊂1.3微生物种类差异分析利用获得的物种组成相对丰度表中的微生物比对r e a d s数进行对数转换,并计算获得微生物相对丰度表㊂使用R语言v e g a n包(v e r2.6-4)中的d i v e r s i t y函数计算菌门水平的各肠段微生物群落的菌门数,并进行K r u s k a l-W a l l i s多样本差异检验[11],查看不同肠段微生物菌门数差异结果,并结合菌门水平物种分布维恩图和物种相对丰度热图筛选出存在差异分布的微生物㊂1.4微生物群落结构差异分析使用R语言v e g a n包(v e r2.6-4)中的d i v e r s i t y 函数计算菌属水平的各肠段微生物群落的A l p h a 多样性和B e t a多样性差异;利用m u l t c o m p包(v e r 1.4-23)对各肠段微生物A l p h a多样性结果进行单因素方差分析[11-14],利用S h a n n o n指数作为A l p h a 多样性的指标㊂使用R语言v e g a n包(v e r2.6-4)中的v e g d i s t函数基于微生物相对丰度计算各样品两两之间的微生物B r a y-C u r t i s距离,基于计算获得的B r a y-C u r t i s距离矩阵进行主坐标分析(p r i n c i p a l c o o r d i n a t e a n a l y s i s,P C o A)㊂对所有的样品进行聚类,检验肉鸭不同肠段的微生物群落结构之间的差异[11-14]㊂利用R语言v e g a n包(v e r2.6-4)中的a n o s i m函数分别对各肠段微生物的B r a y-C u r t i s距离矩阵进行相似性分析(a n a l y s i so fs i m i l a r i t i e s, A N O S I M),随机置换999次,计算得到R值和P 值,以进一步评估不同肠段之间的微生物差异是否大于组内差异㊂基于菌科水平和菌种水平的相对丰度结果,进行主成分分析(P C A),验证其他分类水平上的肠道微生物的群落结构差异㊂1.5微生物功能注释使用h u m a n n(v e r3.8)将r e a d s比对到c h o c o p h l a n泛基因数据库㊁u n i r e f基因家族数据库㊁u t i l i t y_m a p p i n g注释数据库,并转换成K E G G注释结果㊂将盲肠微生物与十二指肠㊁空肠㊁回肠的功能注释结果进行比较,并根据P值筛选前三十的差异结果,用g g p l o t2绘制成气泡图,证明肠道微生物在功能多样性层面的差异㊂1.6微生物组间比较为比较北京鸭和连城白鸭的差异菌属,基于肠道微生物菌属水平的相对丰度表,通过t检验方法,并以P<0.05为限制指标,筛选出北京鸭和连城白鸭在各肠段的差异菌属,揭示其在北京鸭中的上调或下调类型㊂2结果2.1肠道微生物宏基因组测序数据概述质检合格的肠道内容物样品共计23个,质控后共计21676685条宏基因组测序高质量r e a d s成功比对到了R e f s e q非冗余参考序列数据库㊂将比对成功的r e a d s进行微生物分类注释,发现它们属于45个菌门㊁84个菌纲㊁186个菌目㊁418个菌科㊁1400个菌属和3467个菌种㊂2.2肠道微生物组成的空间差异2.2.1优势菌门丰度的空间差异通过宏基因组测序分析获得了十二指肠㊁空肠㊁回肠㊁盲肠等各个肠段(图1A)的菌门水平的微生物累积丰度百分比,结果表明,各个肠段的门水平优势微生物均主要由厚壁菌门㊁拟杆菌门㊁变形菌门㊁放线菌门等组成,但是不同菌门在不同肠段中的相对丰度存在着明显的差异,存在空间异质性(图1B)㊂十二指肠㊁回肠中拟杆菌门的累积相对丰度低于40%,然而盲肠中拟杆菌门的累积相对丰度为62.41%ʃ2.11%,极1331中 国 畜 牧 兽 医51卷显著高于其他3个肠段(P <0.01)㊂厚壁菌门累积相对丰度在不同肠段之间没有显著差异(P >0.05)㊂十二指肠㊁空肠㊁回肠样品中变形菌门的相对丰度显著高于盲肠(P <0.05),而盲肠中放线菌门的相对丰度极显著低于十二指肠㊁空肠和回肠(P <0.01)㊂另外在盲肠中注释到了相对丰度较高的螺旋体门,其物种累积百分比高于放线菌门㊂图1 肉鸭各肠段分布(A )及门水平优势微生物组成及丰度(B )F i g .1 D i s t r i b u t i o n (A )a n d c o m p o s i t i o na n da b u n d a n c e o f d o m i n a n tm i c r o b i a l c o m m u n i t i e s a t t h e p h yl u ml e v e l (B )i nd i f f e r e n t i n t e s t i n a l s e gm e n t s o fm e a t d u c k s 2.2.2 门水平微生物种类差异 为了校正菌门水平的数据误差,本研究将菌门水平的注释得到的r e a d s 数进行对数转换,并统一测序深度,把对应结果作为菌门水平的相对丰度㊂其中盲肠注释到的菌门数极显著高于其他肠段(P <0.01),而十二指肠㊁空肠和回肠中的菌门数均无显著差异(P >0.05)(图2A ),其中芽单胞菌门㊁网团菌门等10个菌门仅在盲肠中分布(图2B ㊁2C )㊂结合菌门水平相对丰度热图结果发现,盲肠中除去拟杆菌门外,还有36个菌门的相对丰度高于十二指肠㊁空肠和回肠(图2C )㊂以上结果均证明盲肠门水平微生物种类和其他肠段之间存在着明显差异㊂2.2.3 优势菌属丰度的空间差异 在属水平上,优势菌属水平相对丰度和菌门水平具有相似的空间差异规律,不同肠段之间的微生物相对丰度也存在较大差异(图3),如拟杆菌属和P h o c a e i c o l a 属是各个肠段中累积丰度百分比最高的菌属,在所有样品中检出率达到100%,它们都隶属于拟杆菌门,但是在不同肠段之间存在着较大差异㊂其中盲肠中拟杆菌属和P h o c a e i c o l a 属的累积相对丰度分别达到13.80%ʃ0.61%和27.13%ʃ2.48%,极显著高于十二指肠㊁空肠和回肠(P <0.01)㊂而在十二指肠㊁空肠和回肠中,幽门螺杆菌属和棒状杆菌属的平均相对丰度则显著高于盲肠(P <0.01),尤其是幽门螺杆菌属平均丰度沿着肠道延伸还呈现出了逐渐降低的趋势㊂2.3 肠道微生物群落多样性差异本研究利用S h a n n o n 指数作为A l p h a 多样性的衡量标准㊂通过4个肠段的S h a n n o n 指数对比发现,随着肠段的延伸,十二指肠㊁空肠和回肠的微生物群落多样性呈现出逐渐升高的趋势,盲肠的微生物多样性极显著高于十二指肠㊁空肠和回肠(P <0.01,图4A )㊂P C o A 分析结果显示,样品明显按照不同取样肠段进行聚类,十二指肠㊁空肠㊁回肠3个肠段的微生物存在一定程度上的重合,而盲肠中微生物和3个肠段之间存在明显的分离(图4B ),证明盲肠微生物的群落构成和3个肠段微生物群落构成存在明显差异㊂23314期牟启铭等:肉鸭肠道微生物空间异质性分析A ,各肠段的菌门总数;B ,各肠段菌门分布的数目;C ,各肠段所有菌门相对丰度A ,T o t a l n u m b e r o fm i c r o b i a l p h y l a i n e a c h s e g m e n t o f t h e g u t s ;B ,D i s t r i b u t i o no fm i c r o b i a l p h y l a i n e a c h s e gm e n t o f t h e g u t s ;C ,R e l a t i v e a b u n d a n c e o f a l lm i c r o b i a l p h y l a i ne a c hs e g m e n t o f t h e g u t s 图2 各肠段菌门数及相对丰度统计F i g .2 C o u n t s a n d r e l a t i v e a b u n d a n c e o fm i c r o b i a l p h y l a i nd i f f e r e n t s e gm e n t s o f t h e g u ts 图3 属水平优势微生物组成及丰度F i g .3 C o m p o s i t i o na n da b u n d a n c e o f d o m i n a n tm i c r o o r ga n i s m s a t t h e g e n u s l e v e l 3331中 国 畜 牧 兽 医51卷A ,各肠段微生物A l p h a 多样性分析结果;B ,各肠段微生物B e t a 多样性分析PC o A 结果A ,A l p h ad i v e r s i t y c o m p a r i s o na m o n g t h e g u t s e g m e n t s ;B ,P C o Ar e s u l t s o fB e t a -d i v e r s i t y c o m p a r i s o na m o n g t h e g u t s e g m e n t s 图4 各肠段微生物群落多样性分布图F i g .4 D i s t r i b u t i o no fm i c r o b i a l c o m m u n i t y d i v e r s i t y i n e a c h s e gm e n t o f g u t 本研究引入了A N O S I M 非参数统计方法来检验组间差异是否大于组内差异㊂结果表明,在菌属分类水平上,盲肠微生物群落和其他肠段的微生物群落之间存在显著差异,组间差异水平大于组内差异水平(R>0,P <0.01)㊂与此同时,P C A 分析结果同样表明,在科水平(图5A )和种水平(图5B )上,盲肠微生物群落多样性和其他肠段微生物的群落多样性存在明显差异,而十二指肠㊁空肠和回肠微生物群落多样性差异不显著,这与属水平微生物群落多样性存在相似的规律㊂图5 菌科水平(A )和种水平(B )的主成分分析图F i g .5 P C A p l o t a t f a m i l y (A )a n d s pe c i e s t a x o n o m i c l e v e l (B )2.4 肠道微生物功能多样性差异基于宏基因组K E G G 功能注释分析结果表明,盲肠和十二指肠(图6A )㊁空肠(图6B )㊁回肠(图6C )的微生物在功能注释水平存在显著差异㊂结合宏基因组K E G G 通路富集分析结果,发现与十二指肠㊁空肠和回肠微生物相比,盲肠微生物的细菌趋化性通路㊁核苷酸糖代谢通路,丙氨酸通路㊁天冬氨酸通路㊁非酒精性脂肪肝代谢通路㊁谷氨酸代谢通路和脂肪酸的生物合成通路等代谢通路均有上调趋势㊂43314期牟启铭等:肉鸭肠道微生物空间异质性分析图6 盲肠与十二指肠(A )㊁空肠(B )㊁回肠(C )微生物群落功能比较F i g .6 C o m p a r a t i v e a n a l y s i s o fm i c r o b i a l c o m m u n i t i e s b e t w e e n t h e c a e c u ma n d d u o d e n u m (A ),j e ju n u m (B ),i l e u m (C )i n t e r m s o f t h e i r f u n c t i o n s2.5 北京鸭和连城白鸭不同肠段微生物差异物种比较如图7所示,共筛选到了9个菌属的微生物在不同品系的十二指肠中差异分布,9个菌属的微生物在空肠中差异分布,4个菌属的微生物在回肠中差异分布,31个菌属的微生物在盲肠中差异分布㊂盲肠内北京鸭和连城白鸭的差异菌属数量超过十二指肠㊁空肠和回肠㊂图7 北京鸭和连城白鸭不同肠段的差异菌属F i g .7 T h e d i f f e r e n t i a l g e n e r a i nd i f f e r e n t i n t e s t i n a l s e g m e n t s o fP e k i nd u c ka n dL i a n c h e n g Wh i t e d u c k 5331中国畜牧兽医51卷3讨论肠道微生物群在宿主生长㊁免疫㊁代谢等方面发挥着重要作用,同时也是和宿主表型进行关联分析的重要参考指标㊂肉鸭的肠道微生物组成和猪[9,15-16]㊁人[9]㊁鸡[9,14,17-19]等物种具有一定的相似性,都主要包括细菌㊁古菌㊁真核微生物㊁病毒等㊂然而不同肠段的结构和功能存在较大差异,定植微生物的物种丰富度和群落多样性也存在较大差异,选择哪个肠段进行肠道微生物的差异分析研究就很有必要㊂本试验鉴定到的鸭各个肠段的门水平优势微生物均为厚壁菌门㊁拟杆菌门㊁变形菌门㊁放线菌门等组成,与猪㊁鸡等物种的肠道微生物优势物种注释有着类似的结果[14-20]㊂本试验结果也进一步印证了远端肠道的盲肠中厚壁菌门㊁拟杆菌门㊁变形菌门㊁放线菌门的累积相对丰度和近端的3个肠段存在显著差异,尤其是盲肠中拟杆菌门的相对丰度极显著高于十二指肠㊁空肠和回肠㊂盲肠的相对封闭环境为微生物的繁殖提供了适宜的空间,而盲肠微生物大量繁殖为动物提供了许多其他方面的功能,如提高能量利用率,厌氧发酵产生短链脂肪酸(S C F A)等营养物质等[21]㊂作为优势菌属之一,拟杆菌以多糖作为主要的能量来源,参与碳水化合物的发酵㊁含氮物质的消化利用等[22],这也和在猪饲料中添加粗纤维的比例和饲养后盲肠内拟杆菌门的相对丰度呈现正相关[23]相互印证,而盲肠是消化粗纤维等大分子物质的主要场所,所以粗纤维中大分子物质的发酵可能是提高拟杆菌门相对丰度的重要因素㊂综上,本研究认为盲肠中的植物纤维素㊁木聚糖等物质由于消化不彻底,经过消化液的流动和小肠蠕动而向肠道末端移动,并大量积累于盲肠和结直肠区域,因此盲肠中的拟杆菌属等微生物由于能量来源充足而大量繁殖,使得盲肠中拟杆菌门的相对丰度极显著高于其他肠段㊂结合门水平微生物种类数差异和微生物群落A l p h a多样性中S h a n n o n指数分析发现,盲肠中微生物的物种丰富度和群落多样性极显著高于其他肠段㊂尽管肉鸭的肠道是连续的空腔,但是由于前肠中好氧细菌大量消耗氧气,使得后续肠段中厌氧微生物随着肠道的延伸而相对丰度不断升高,促进了厌氧微生物的积累[24]㊂其次,由于肠道的蠕动和消化液的流动,食糜在十二指肠㊁空肠和回肠中的储存时间显著短于盲肠[25],营养物质难以积累㊂且由于十二指肠㊁空肠和回肠中p H更接近于中性[26],导致胰蛋白酶㊁胰凝乳蛋白酶等消化酶在十二指肠㊁空肠和回肠中活性更高,使得在此部分肠道中酶促反应的速率极显著高于盲肠,加速了糖蛋白等大分子营养物质的分解,由于大分子营养物质在十二指肠㊁空肠和回肠中含量较低,使得十二指肠㊁空肠和回肠中缺乏足够的营养来源,进一步抑制了十二指肠㊁空肠和回肠内的发酵作用,导致了微生物的丰度得到了抑制[25,27]㊂肉鸭的盲肠具有盲端,食糜便于积累,不易扩散,这为微生物的培养和发酵提供了大量营养素,如黏蛋白㊁纤维素等,使得微生物由于营养素充足得以大量繁殖,宏基因组功能注释结果中盲肠微生物的细菌趋化性强也印证了这个问题㊂综上所述,氧气浓度差异和营养素积累差异,可能是影响各个肠段微生物分布的重要因素,也是使得盲肠微生物的菌门数㊁微生物相对丰度和群落多样性极显著高于其他3个肠段的可能原因㊂通过以门水平的B r a y-C u r t i s距离矩阵为指标的B e t a多样性分析,本研究发现十二指肠㊁空肠和回肠的差异不显著,而盲肠和3个肠段具有明显的分离㊂而I s a a c s o n等[22]也发现了盲肠和结直肠与其他各个肠段存在着明显的分离㊂而盲肠中微生物以厌氧菌为主,这也充分印证了氧气含量[28]和养分[29-30]是影响微生物分布的重要因素㊂北京鸭和连城白鸭在体格大小㊁料重比㊁采食量等生长指标均存在着较大差异,这可能与肠道微生物有密切关系㊂本研究发现北京鸭和连城白鸭盲肠内的差异菌属数量超过十二指肠㊁空肠和回肠,且差异菌属,如R o t h i a(罗氏菌属)等和脂肪代谢㊁消化吸收等作用有关㊂综上所述,盲肠微生物的种类㊁丰度㊁群落多样性均显著高于其他各个肠段,发现盲肠的环境更适合微生物的繁殖,所以盲肠是研究肉鸭肠道微生物的重要肠段,这为之后肉鸭肠道微生物的深入研究提供了充分的借鉴价值㊂4结论本研究发现肉鸭肠道微生物的分布存在明显的空间异质性㊂各肠段优势菌门的种类相同,然而相对丰度却存在明显差异㊂十二指肠㊁空肠㊁回肠段的微生物种类和相对丰度差异不显著,而盲肠的微生物群落多样性和物种丰富度极显著高于其他肠段,北京鸭和连城白鸭的盲肠差异菌属数也高于十二指肠㊁空肠和回肠,并且筛选到了盲肠微生物和十二指肠㊁空肠和回肠微生物的差异代谢通路㊂63314期牟启铭等:肉鸭肠道微生物空间异质性分析参考文献(R e f e r e n c e s):[1]孙永波,王亚,萨仁娜,等.家禽肠道健康评价指标研究进展[J].动物营养学报,2017,29(12):4266-4272.S U N Y B,WA N G Y,S A R N,e t a l.R e s e a r c hp r o g r e s so ne v a l u a t i o ni n d i c a t o r so f i n t e s t i n a lh e a l t hi n p o u l t r y[J].C h i n e s e J o u r n a l o f A n i m a lN u t r i t i o n,2017,29(12):4266-4272.(i nC h i n e s e)[2]王晶,许丽,齐广海,等.家禽肠道健康及其营养调控措施[J].动物营养学报,2019,31(6):2479-2486.WA N GJ,X U L,Q IG H,e t a l.I n t e s t i n a l h e a l t ha n di t s n u t r i t i o n a l m o d u l a t i o n m e a s u r e s o f p o u l t r y[J].C h i n e s e J o u r n a l o f A n i m a lN u t r i t i o n,2019,31(6):2479-2486.(i nC h i n e s e)[3] D A U D E L 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生物栅系统净化效果及微生物ERIC—PCR指纹图谱分析
２ Ｅ ｓ Ｃ ｉａＮ ｒ ｌ ｎｖｒ ｔ， ｈ ｎ ｈ ｉ ０ ０ ２ Ｃ ｉ ） ． ａｔ ｈｎ ｏｍａ ｉ ｓ ｙ Ｓ ａ ｇ ａ ０ ６ ， ｈｎ Ｕ ｅｉ ２ ａ
Ａ ｂｓｒ ｃ Ｔｈ ｎ ｅｒ ｌｔｏ ｆｔ ｃ ｏ ａ ｏ ｍｕｎｔ ｔｕ ｔ ｒ ｓ ａ ｈ ｅ ｒ ｄ ｔｏ ｆｐ ｉ ｉａ ｌｕｔｎ ｓ ｗａ ｉｃ ｓ ｅ ｙ ｔ ａ ｔ： ｅ ｉ ｔｒｅ ａｉｎ ｏ ｈｅ ｍｉｒ ｂｉｌｃ ｍ ｉｙ ｓｒ ｃ ｕ ｅ ｎｄ ｔ ｅ ｄ ｇ ａ ａ ｉｎ ｏ ｒｎｃｐ ｌｐｏｌ ａ ｔ ｓ ｄ ｓ ｕ ｓ ｄ ｂ
统 表 现 出 良好 的 运 行 稳 定 性 。 关 键 词 ： 物 栅 系 统 ； 生 物 群 落 结 构 ；Ｒ Ｃ—Ｐ Ｒ 生 微 ＥＩ Ｃ
中 图分 类 号 ： １ ２ Ｘ ７ 文献标识码 ： Ａ
Ｐｕｒｆｃ ｔｏ ｆ ｃ ｅ ｙ ｏ ｏ ｏ ｉ ａ ｉ ｄ Ｓ ｓ ｅ ａ ｉ ａ ｉ ｎ Ｅｆ ｉ ｎｃ ｆＢｉ ｌ ｇ ｃ ｌＧ ｒ ｙ ｔ ｍ ｎｄ ｉ ｉ Ａｎ ｌ ｓｓ ｏ ｉ ｒ ｂ ａ ａ ｙ ｉ ｆ Ｍ ｃ ｏ ｉ ｌＥＲＩ —ＰＣＲ ｎ ｅ ｐｒ ｎ ｉ ｇ Ｃ Ｆｉ ｇ ｒ ｉ ｔｎ
第 ２ 卷 第 ５期 ｌ
２ ００８年 １０月
污
染
防
治
技
术
Ｖｏ ． １ ２１． ． Ｎｏ ５ ０ｃ ．２０ ０ ８ ｔ．
Ｐ０ＬＬＵＴ１ ０Ｎ ＣＯＮＴＲＯＬ ＴＥＣＨＮ０Ｌ０ＧＹ
生 物 栅 系 统 净 化 效 果 及 微 生 物 Ｅ Ｉ Ｒ Ｃ—Ｐ Ｒ指 纹 图 谱 分 析 Ｃ
率 比 空 白 池 分 别 约 高 ３ ％ 、０ ， 系 统 运 行 中 功 能 细 菌 数 量 与 污 染 物 去 除 率 呈 现 出 显 著 的 正 相 关 性 ； ＲＣ—Ｐ Ｒ指 纹 图 ５ ３％ 且 ＥＩ Ｃ 谱 分 析 表 明 ， 着 系统 的 运 行 ， 反 应 池 中 微 生 物 多 样 性 指数 不 断 增 加 ， 生 物 种 群 趋 于 丰 富 ， 似 性 指 数 增 高 ， 物 栅 系 随 各 微 相 生
微生物实验(生物实验三)
1 生物大实验三《微生物学》部分实验目录 实验一、 培养基的配制和灭菌 实验二、 微生物的分离、接种及培养法 实验三、 水中细菌总数和大肠菌群的检测 实验四、 微生物的快速鉴定和自动化分析技术 实验五、 抗微生物药物敏感性试验 实验六、 微生物的生理生化反应 实验七、 微生物菌种保藏 实验八、 沉淀反应 实验九、 细菌鞭毛染色及其运动的观察 实验十、 细菌芽孢、荚膜的染色及观察 2
实验一、培养基的配制和灭菌 一、实验目的 1.了解配制培养基的原理，并掌握配制培养基的一般方法和步骤。 2.学习几种常用培养基的配制、分装和灭菌的操作方法。 3.进一步熟练掌握手提式高压蒸汽灭菌锅的使用方法。 二、实验器材 1.药品及试剂： 可溶性淀粉，葡萄糖，KNO3，K2HPO4·3H2O，MgSO4·7H2O，FeSO4·7H2O，K2HPO4，1mol/L NaOH，琼脂，牛肉膏，蛋白胨，NaCl，马铃薯 2.仪器及其它 试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻棒、天平、药匙、高压蒸汽灭菌锅、pH试纸(5.5-9.0)、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布、干燥箱、培养皿、涂布棒、吸管（1ml）、玻璃珠、PH试纸 三、实验内容 1.分组配制高氏一号培养基300ml。 配方： 可溶性淀粉20g NaCl 0.5g KNO3 1g K2HPO4·3H2O 0.5g MgSO4·7H2O 0.5g FeSO4·7H2O 0.01g 琼脂 15-25g 水 1000ml pH 7.4-7.6 2.配制牛肉膏蛋白胨培养基 配方： 牛肉膏3g 蛋白胨10g NaCl 5g 水1000ml PH 7.4-7.6 3.配制马丁氏培养基 配方： K2HPO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，蛋白胨5g，葡萄糖l0g，琼脂15～20g，水1000mL，自然pH。 配制方法 配制20％马铃薯浸汁 取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000ml。80℃浸泡1h，用纱布过滤，然后补足失水至所需体积。100Pa灭菌20min。即成20％马铃薯浸汁，贮存备用。 3
凡纳滨对虾不同养殖模式下微生物群落结构分析
张 芹，吴小军，杨兴丽．凡纳滨对虾不同养殖模式下微生物群落结构分析［Ｊ］．江苏农业科学，２０２４，５２（６）：２２５－２３５．ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０２４．０６．０２９凡纳滨对虾不同养殖模式下微生物群落结构分析张 芹，吴小军，杨兴丽（河南省水产科学研究院，河南郑州４５００４４） 摘要：为了解不同养殖模式对凡纳滨对虾养殖环境微生物多样性和群落结构的影响，利用高通量测序技术，结合生物信息学分析，比较凡纳滨对虾主养模式和鱼－虾混养模式中水体、底泥以及虾肠道微生物的多样性和群落结构。
结果显示，无论是物种的多样性水平还是丰富性水平，均是底泥＞水＞虾肠道，主养池塘底泥和虾肠道样品的物种多样性和丰富性均高于混养池塘。
不同样品微生物群落的菌群分布于５９个门，其中１０个门的丰度＞１％，变形菌门（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）和拟杆菌门（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）属于绝对优势菌群，在混养池塘和主养池塘中均＞１０％。
主养池塘的微生物标志物共有８个类群，分别为双歧杆菌目（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）、双歧杆菌科（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、双歧杆菌属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）等，混养池塘的微生物标志物共有１８个类群，分别为蓝色芽殖杆菌属（Ｇｅｍｍｏｂａｃｔｅｒ）、外硫红螺菌科（Ｅｃｔｏｔｈｉｏｒｈｏｄｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）、外硫红螺菌属（Ｅｃｔｏｔｈｉｏｒｈｏｄｏｓｐｉｒａ）等。
通过功能预测及其相对丰度比较，发现主养模式在这些代谢通路中基因注释的相对丰度值均高于混养模式。
以上研究表明，在凡纳滨对虾主养模式中添加的益生菌，有效提高了水体、虾肠道和底泥的微生物多样性，塑造了更健康、多元化、功能更强大的微生物群落，提高了养殖系统的物质循环能力和能量利用效率，更有利于虾体的健康成长。
关键词：凡纳滨对虾；微生物群落结构；高通量测序 中图分类号：Ｓ１８２；Ｓ９１７．１ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００２－１３０２（２０２４）０６－０２２５－１０收稿日期：２０２３－０５－０２基金项目：国家现代农业产业技术体系建设专项（编号：ＣＡＲＳ－４５）；河南省农业科学院自主创新项目（编号：２０２３ＺＣ１１３）；国家淡水水产种质资源库建设项目（编号：ＦＧＲＣ：１８５３７）；河南省农业产业技术体系（编号：ＨＡＲＳ－２２－１６－Ｓ）。
用PCR-DGGE和16S rDNA测序解析吐温对绵羊瘤胃细菌多样性的影响
Ａｂｓｒ ｃ ： Ｆｉ ｅ Ｃｈ ｎｅ ｅ Ｍ ｅ ｉ ａ ｅ ｓ ｅ ｐ ｆｔ ｅ ｔ ｅ ｐｅ ｕａ ｕ ｅ ｉ ｔ ａ ｗｅ ｅ ｕｓ ｄ ｉ ｔａ ｔ ｖ ｉ ｓ ｒｎｏ ｍ ｌ ｈ ｅ ｉｔ ｄ ｗｉｈ ｐ ｒ ｔ １ｒ ｍ ｎ ｆｓ ｕｌ ｒ ｅ ｎ ａ ５× ５ Ｌａ ｉ ｔｎ ｓ ａ ｅ ｄ ｓｇｎ ｄ ｅ ｐｅ ｉ ｅ Ｏ ｅ ａ ｎｅ ｔ ｅ ｅ ｆ ｃ ｓ ｏｆｓ ｐｌ ｍｅ ｔ ｔｏｎ Ｔｗｅ ｎ ８ ｎ ｑｕ ｒ ｅ ｉ ｅ ｘ ｒｍ ｎｔｔ ｘ ｍｉ ｈ ｆｅ ｔ ｕｐ ｅ ｎ ａ ｉ ｅ Ｏ ａ ｄ Ｔｗｅ ｎ ２Ｏ ｏ ｈｅ ｒ ｅ ｎ ｔ ｕ— ｍｅ ａ ｔ ｒａ ｉ ｅ ｓｔ ．Ｔｈｅ ｆｖ ｒ ａ ｍ ｅ ｔ ｒ ｈ ｓ ｌｄ ｅ ｔ ｏ ｒ １ ｎｄ ｔ ａ ａ ｉ ｔｓ ｐｌｍ ｅ ｎ ｂ ｃ ｅ ｉ ｌｄ ｖ ｒ ｉｙ ｉ ｅ ｔ ｅ ｔ ｎ ｓｗｅ ｅ ｔ ｅ ｂａ ａ ｉ ｔ（ ｈｅ ｃ ｎｔ ｏ ）ａ ｈｅ ｂ ｓ ｌｄ ｅ ｕｐ ｅ ｎ—
优势菌种类增加 ， 温 ８ 吐 Ｏ和低 剂 量 的 吐 温 ２ Ｏ使 优 势 菌 种 类 下 降 。在 绵 羊 瘤 胃细 菌 中 ， 吐 温 ２ 受 Ｏ和 吐 温 ８ Ｏ影 响 的
种类 不 同 。
关 键 词 ： 非 离 子 表 面活 性 剂 ； 羊 ； 胃 ； 菌 ；聚 合 酶 链 式 反 应 一 变 性 梯 度 凝 胶 电泳 绵 瘤 细
新 疆 农 业 大 学 学 报 ２ １ ，３ ６ ：６ ～４ ４ ０ ０ ３ （ ） ４ ９ ７ Ｊ ｕ ｎ ｌ ｆＸｉｊａ ｇＡ ｒｃ ｌ ｒ ｌ ｎｖｒｉ ｏ ｒ ａ ｎ ｉｎ ｇ ｉｕｔ ａ ｉ ｓｔ ｏ ｕ Ｕ ｅ ｙ
对两种不同投料方式的大黄鱼肠道菌群结构分析
0 引言 大黄鱼被誉为国鱼，大黄鱼产业的兴起带动了数以千亿的
产业。2017 年，全国大黄鱼总养殖产量将近 18 万 t，其中福建 地区的养殖产量超过 15 万 t。但在大黄鱼养殖中，长期投喂冰 鲜饵料已经带来的一系列问题。另一方面，浮性膨化饲料具有 不容易造成水体污染，不易流失营养成分等优点。但在实际生 产中养殖户仍然以冰鲜饲料投喂为主，浮性膨化饲料在高温季 节作为补充饲料进行投喂。
DNA 的提取： 采用 MOBIO 的 ＲNA PowerSoil DNA Elution Accessory Kit 提取样品 DNA。利用超微量核酸分光光度计 检测 DNA 浓度及纯度。
16srDNA 的 PCＲ 扩增： 用细菌 16S rＲNA 基因 通 用 引 物 338F： 5 ’－ ACTCCTACGGGAGGCAGCA － 3 ’和 806Ｒ： 5 ’－ GGACTACHVGGGTWTCTAAT － 3 ’对 肠 道 内 容 物 DNA 进 行
畜禽业
试验研究
门水平上的物种柱状分布图
属水平上的物种柱状分布图
图 1 在生物学上门、属水平上的物种柱状分布图
试验研究
LIVESTOCK AND POULTＲY INDUSTＲY
No． 3，2019
对两种不同投料方式的大黄鱼 肠道菌群结构分析
柯 翎，李素一，张丽娟，研究所，福建 福州 350001）
基于PCR-DGGE的小鼠肠道菌群基因组提取方法的建立
基于PCR-DGGE的小鼠肠道菌群基因组提取方法的建立张素珍;李思施;韦婷婷;张凯;关家伟;吴大畅【摘要】通过比较4种小鼠粪便细菌总DNA提取方法对基于PCR-DGGE检测的肠道菌群多样性分析的影响,旨在建立适于PCR-DGGE的小鼠肠道微生物宏基因组提取的稳定、经济、快捷的方法.采用SDS裂解法、某国产市售粪便DNA提取试剂盒、改进的化学裂解法、改进的溶菌酶法4种方法提取小鼠粪便细菌总DNA,通过琼脂糖凝胶电泳、紫外分光光度法、细菌16S rRNA V3区PCR扩增结合DGGE对提取结果进行比较分析.SDS裂解法和国产市售试剂盒2种方法提取粪便细菌总DNA均未得到理想结果,另2种方法均能够检测到粪便中20种左右的细菌.改进的化学裂解法和改进的溶菌酶提取法的建立为基于PCR-DGGE进行肠道菌群结构的定量及定性分析提供了可靠的前提基础和实验保障.【期刊名称】《微生物学杂志》【年(卷),期】2013(033)005【总页数】5页(P32-36)【关键词】肠道菌群;小鼠粪便;DNA提取;PCR-DGGE【作者】张素珍;李思施;韦婷婷;张凯;关家伟;吴大畅【作者单位】大连医科大学,生物技术系,辽宁大连,116044;大连医科大学,生物技术系,辽宁大连,116044;大连医科大学,生物技术系,辽宁大连,116044;大连医科大学,生物技术系,辽宁大连,116044;大连医科大学,生物技术系,辽宁大连,116044;大连医科大学,生物技术系,辽宁大连,116044【正文语种】中文【中图分类】Q93-336哺乳动物肠道内细菌组成非常复杂。
近年来，肠道菌群对机体健康和疾病的影响越来越受到人们的关注［1-2］，粪便与肠道内容物相似，含有大量的微生物、未消化食物和肠道脱落细胞等［3］，粪便微生物的变化可以间接地反映肠道微生物的变化。
粪便分析技术不同于采血或取组织获取样本，属于非损伤性取样，应用性强［4］。
在肠道菌群数量和种类鉴定过程中，因厌氧菌占多数，难以利用传统的选择培养法进行培养，因此无法对其深入研究［5］。
乌龙江湿地土壤真菌群落结构的PCR—DGGE分析
乌龙江湿地土壤真菌群落结构的PCR—DGGE分析作者：陈丽华吕新刘兰英黄薇李玥仁来源：《福建农业学报》2018年第08期摘要：为了解乌龙江湿地土壤真菌群落结构组成及动态变化，本研究通过稀释平板法对湿地土壤可培养真菌数进行测定，并采用变性梯度凝胶电泳（DGGE）技术分析乌龙江湿地土壤真菌群落结构。
平板计数结果表明，不同时间不同采样点可培养真菌数的变化幅度较小，每克干土中可培养真菌数介于0.13×104～8.26×104 CFU。
真菌18S rDNA的PCR-DGGE图谱显示，每个泳道条带的位置、数目和亮度各有不同，说明不同采样时间不同采样点土壤真菌群落结构存在着差异。
DGGE图谱条带多样性分析结果表明，2009年3月、2009年11月和2010年1月所采集土壤样品的真菌群落多样性较其他时间更为豐富；从采样点来看，真菌群落丰富度则表现为样品L>样品M>样品R。
对DGGE主要条带和差异性条带进行克隆测序后发现，乌龙江湿地土壤主要真菌类群为子囊菌Ascomycota和毛霉菌Mucoromycota。
关键词：乌龙江湿地；土壤真菌；群落结构；PCR-DGGE；多样性分析中图分类号：Q 938.1文献标识码：A文章编号：1008-0384（2018）08-835-07Abstract： Composition and dynamics of the fungal community in soil of Wulongjiang wetlands were studied. The classical plate count and the denatured gradient gel electrophoresis （DGGE）were applied to determine the cultivable population and diversity of the community. The plate counts of the samples averaged between 0.13×104 and 8.26×104 CFU per g of dry soil with no significant difference due to the locations or time of collection. On the other hand， the PCR-DGGE patterns of 18S rDNA （V1+V2） fragments exhibited variations on the positions， number and lightness of the bands from different lanes， indicating compositional differences among the fungal populations. The DGGE bands digitally analyzed by Quantity One software and the derived Shannon-Wiener index，evenness and abundance showed greater diversities in the samples obtained in March 2009，September 2009 and January 2010 than other times of a year. They also unveiled the differences in abundance of Sample L> Sample M> Sample R. The dominant fungi in the soil were identified to be Ascomycota and Mucoromycota according to a sequence analysis on the DGGE bands.Key words： Wulongjiang wetland； soil fungi； community composition； PCR-DGGE；diversity analysis湿地生态系统是地球最重要的三大生态系统之一，兼有水体和陆地的双重特征，其在物质循环、能量流动、污染净化、生态平衡等方面发挥着重要的作用[1]。