实验五 用IPTG诱导大肠杆菌表达重组绿色荧光蛋白
实验五用IPTG诱导大肠杆菌表达重组绿色荧光蛋白
一、目的要求
1.学习和掌握重组蛋白在大肠杆菌中表达的原理和实验技术；
2.观察大肠杆菌在诱导过程中的形态。
二、原理
pET 系统是有史以来在E.coli 中克隆表达重组蛋白的功能最强大的系统。目的基因被克隆到pET 质粒载体上，受噬菌体T7强转录及翻译(可选择)信号控制；表达由宿主细胞提供的T7 RNA 聚合酶诱导。T7 RNA 聚合酶机制十分有效并具选择性：充分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；诱导表达后仅几个小时，目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50%以上。尽管该系统极为强大，却仍能很容易地通过降低诱导物的浓度来削弱蛋白表达。降低表达水平可能可以提高某些目的蛋白的可溶部分产量。该系统的另一个重要优点是在非诱导条件下，可以使目的基因完全处于沉默状态而不转录。用不含T7 RNA聚合酶的宿主菌克隆目的基因，即可避免因目的蛋白对宿主细胞的可能毒性造成的质粒不稳定 (详见I. F.部分)。如果用非表达型宿主细胞克隆，可以通过两种方法启动目的蛋白的表达：用带有受λpL 和 pI 启动子控制的T7 RNA 聚合酶的λCE6噬菌体侵染宿主细胞，或者将质粒转入带有受lacUV5 控制的T7 RNA聚合酶基因的表达型细胞。在第二种情形下，可以通过在细菌培养基中加入IPTG 来启动表达。尽管有时(例如非毒性目的蛋白) 可以直接将目的基因克隆到表达型宿主细胞中，但这种策略并不是通用做法。两种T7 启动子以及多种拥有不同抑制本底表达水平的宿主细胞共同构成了一个极为灵活而有效的系统，使各种目的蛋白得以最优化表达。
三、试剂与器材
试剂：LB培养基、IPTG、氨苄青霉素、草酸铵结晶紫染色液，路哥氏（Lugol）碘液，95%乙醇，0.5%沙黄染色液。
器材：摇床、显微镜等。
四、操作步骤
A、诱导
许多研究表明细胞生长速率严重影响外源蛋白的表达，因此必须对接种菌量、诱导前细胞生长时间和诱导后细胞密度进行控制。生长过度或过速都会加重细菌合成系统的负担，导致形成包涵体。
1. 对照菌和重组菌分别挑取1～2个菌落，接入1 ml含氨苄青霉素（50μg/ml）的LB培养液，37℃培养过夜。
大肠杆菌在室温的生长速率比在37℃慢4倍，所以～20℃培养过夜（16 h）可能达不到饱和。但低温时细菌代谢缓慢，不容易形成包涵体。
2. 取400μl过夜培养物接入40 ml含氨苄青霉素（50μg/ml）的LB培养液，37℃振荡培养2 h以上，至对数中期（A550=0.5～1.0）。
3. 在40 ml培养物中加入IPTG至终浓度1 mmol/L，37℃继续振荡培养。
IPTG的浓度对表达水平影响非常大。1 mmol/L只是一个起点，也是一个比较高的浓度。实验中，应在0.01～5.0 mmol/L的范围内改变IPTG浓度，寻找最佳使用浓度。对于有些蛋白，必须诱导表达质粒慢转录，才不致于使细菌的生物合成系统过载。
4. 在诱导的前后取1 ml样品放于微量离心管中，测定A550，室温高速离心1 min。留样并观察形态。
B、形态观察
1、涂片
将诱导前后的大肠杆菌分别作涂片（注意涂片切不可过于浓厚），干燥、固定。固定时通过火焰1—2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。
2、染色
（1）初染加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，水洗。
（2）媒染滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗
（3）脱色将载玻片上的水甩净，并衬以白背景，用95%酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约20—30分钟，立即用水冲净酒精。
（4）复染用番红液染1—2分钟，水洗。
（5）镜检干燥后，置油镜观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。
革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。
注意事项
革兰氏染色成败的关键是脱色时间，如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而被误认为是革兰氏阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被误认为是革兰氏阳性菌。因此必须严格把握脱色时间。
五、思考题
(1)列举并说明影响重组蛋白在大肠杆菌中表达的因素。
(2)大肠杆菌形态若有变化，请阐述可能的原因。
参考：分子克隆实验指南，第三版。
肠毒性大肠杆菌的绿色荧光蛋白转化及表达研究
第45卷 增刊2006年5月 厦门大学学报(自然科学版)Journal of Xia men University (Natural Science ) Vol .45 Sup. M ay 2006 收稿日期:2005212227 基金项目:福建省发展和改革委员会重大产业技术开发专项 (20042427)资助 作者简介:朱红梅(1981-),女,硕士研究生. 3通讯作者:fzliubo@https://www.360docs.net/doc/f014354024.html, ;htzhou@jingxian .x mu .edu .cn 肠毒性大肠杆菌的绿色荧光蛋白转化及表达研究 朱红梅1 ,周涵韬 1,23 ,张赛群 1,2 ,曹 宜2,刘 波 23 (1.厦门大学生命科学学院,福建厦门361005;2.福建省农业科学院生物技术中心,福建福州350003) 摘要:通过电击转化法,将带有 gfp 标记基因的pG LO 质粒成功转化到肠毒素型大肠杆菌K 88、K 99中,经过紫外检测及荧 光显微镜检测均发现转化菌株发出绿色的荧光,表明gfp 基因得到稳定、高效的表达.进一步通过PCR 分子鉴定、血清型鉴定、微生物学特性分析均表明,转化菌株与原始菌株是一致的.该转化菌株将为研究肠毒性大肠杆菌的致病机理及益生素的筛选提供有效的手段. 关键词:肠毒性大肠杆菌;绿色荧光蛋白;遗传转化中图分类号:Q 943.2 文献标识码:A 文章编号:043820479(2006)S 20043204 肠毒素性大肠杆菌(Enter ot oxigenic Escherichia co 2li .,ETEC )是一类引起人和幼畜(初生仔猪、犊牛、羔羊及断奶仔猪)腹泻的重要病原菌,初生幼畜被ETEC 感染后,常因剧烈水样腹泻和迅速脱水而死亡,发病率和死亡率均很高,是目前的研究热点之一[1] .猪源产肠毒素性大肠杆菌的黏附素抗原主要有K 88,K 99,987P . 来自多管水母(A equoreavitoria )的绿色荧光蛋白(green fluorescence p r otein,GFP )基因是目前应用广泛的一种报告基因[2] .在各种不同的系统中表达后,重组GFP 均可吸收蓝光,发出明亮的绿色荧光.与其它生物标记基因比较,它的最大优点是不需要任何底物或额外的辅助因子,利用其发出的荧光就可以实现 对生物的活体监测[3] ,为重组子的筛选及诸多生物学、免疫学试验提供了一个直观手段. 本研究利用gfp 基因标记ETEC,希望获得gfp 基因稳定表达、特性稳定的发光标记菌株,为进一步研究ETEC 侵染途径及治病机理奠定基础,同时也方便益生素的筛选及效果评价. 1 材料与方法 1.1 材 料 肠毒性大肠杆菌菌株C83905(K 88ac ),C83529(K 99)由福建省农科院畜牧兽医研究所提供.质粒pG 2 LO 购自B i o 2Rad 公司,有Amp (氨卞青霉素)抗性和 阿拉伯糖调控蛋白和gfp 基因. 蛋白胨为上海生工BB I 公司产品,酵母抽提物为OXO I D 公司.d NTPs 、TaqDNA 聚合酶、购自上海生工;100bp DNA Ladder 购自B i olabs . BECK MAN 冷冻离心机,B i o 2Rad Gene Pulser Ⅱ电穿孔仪,B i o 2Rad 电泳仪,OLY MP US 荧光显微镜. 1.2 实验方法 (1)质粒提取方法 挑取紫外灯下发绿色荧光的质粒宿主菌DH 5 α的单菌落,于10mL 含100μg ?mL -1 Amp 的LB 液体 培养基中,37℃振荡培养过夜.碱裂解法提取质粒[4] .提取的质粒用0.8%琼脂糖电泳检测纯度. (2)感受态细胞的制备 在NA 液体中摇床震荡培养ETEC 至OD 600为0.6,取菌液冰浴10m in,8000r/m in 4℃离心收集菌体.冰预冷的无菌水洗菌体4次,最后将菌体重悬于10%甘油中,-70℃冰箱保存备用. (3)电击转化 2mm 电转化杯冰上预冷后,分别加入100μL 感受态细胞和50ng 质粒,冰浴10m in 后进行电击转化,电击条件为2.5kV ,200Ω,25μF .电击结束立即加入900μL 的NA 培养基,混匀并转入1.5mL 的Eppen 2dorf 管中,于37℃、120r/m in 的摇床上振荡培养2h, 取100μL 菌液涂布在NA +100μg ?mL -1 Amp +6mg ?mL -1 阿拉伯糖(ara )筛选培养基上,并置于37℃培养箱培养16h . (4)转化子的荧光检测 将筛选培养基上长出的菌落,紫外灯照射检测绿色荧光.用接种环挑取稀释后的菌液置于载波片上,常规压片,荧光显微镜观察. (5)标记菌株的PCR 鉴定 细菌基因组DNA 的提取方法参照少量制备
1-大肠杆菌重组蛋白表达提取及纯化实验(最新整理)
第一天 1、配置LB培养基： 酵母粉15g、胰蛋白胨30g、氯化钠30g，定容至3000ml。调节PH至 7.4（2M NaOH），高压蒸汽灭菌20分钟，37℃保存。分装成15瓶（每瓶200ml）。 2、接种（超净台要提前杀菌通风） 取4瓶上述培养基，每瓶加200μlAMP（1:1000）、60μl菌液。37℃过夜。 第二天 1、扩大培养（超净台） 4瓶扩至16瓶，每瓶培养基加200μlAMP，摇床培养1小时左右。 2、诱导（超净台） 加40μlIPTG，加完后去除封口的除牛皮纸，扎口较松。25℃摇床培养4小时。 3、离心获取菌体 4℃，8000rpm离心25分钟。注意配平。 4、超声波破碎菌体 离心后去上清，向沉淀加入（600mlPB裂解液、300μl溶菌酶、3mlPMSF）。将菌液转入2个烧杯中，冰浴超声波破菌，400W，75次，每次6秒，间隔2秒。离心收集上清液。 600mlPB裂解液：20mM/L PB，10mM/L EDTA，5%甘油，1mM/L DTT，调节PH至7.4。 超声波破碎：首先用去离子水清洗探头，再将盛有菌液的小烧杯置于有冰 水混合物的大烧杯中，冰水界面略高于菌液面即可。探头浸没于菌液中，不可伸入过长。注意破菌过程中由于冰的融化导致的液面变化。 5、抽滤（双层滤纸) 洗胶（GST）。将上述上清液抽滤，滤液与GST胶混合，磁力搅拌过夜。 第三天
1、抽滤蛋白-胶混合液，滤液取样20μl，留电泳。 2、洗杂蛋白，用1×PBS+PMSF(1000:1)约400ml，洗脱若干次，用移液枪吸去上层泡沫（杂蛋白），至胶上无泡沫为止。 3、洗脱目的蛋白，洗脱液加50ml，分3次进行（15+15+15），每次加入后间歇搅拌，自然静置洗脱15分钟，抽滤，勿使胶干，合并洗脱液，取样20μl，留电泳。用洗脱液调零，测OD280。（OD值达到1.5为佳） 4、将洗脱液置于透析袋中（透析袋应提前煮好），将透析袋置于2L透析液1中，加入磁珠置于4℃冰箱内磁力搅拌器上，4小时后换为透析液2。胶的回收：用3M氯化钠溶液（用1×PBS溶液溶解）、1×PBS（无沉淀）洗涤，20%乙醇洗脱，装瓶。 洗脱液：50mM/LTRIS-HCL 、10mM/LGSH 透析液1：20mM/L TRIS-HCL、1mM/L EDTA 、0.15mM/L DTT 透析液2：:0.5mM/L EDTA、1×PBS
原核诱导表达汇总
原核诱导表达的标准操作程序（SOP） 一．目的： 使本实验室工作人员了解诱导表达的操作过程，并能实际动手进行原核诱导表达一系列实验。 二．适用范围： 本SOP适用于对新基因克隆的表达，并针对新基因产生的可溶性蛋白。 三．实验原理： E.coli的乳糖操纵子含Z、Y及A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶，此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节基因I。I基因编码一种阻遏蛋白，后者与O序列结合，使操纵子受阻遏而处于关闭状态。在启动序列P上游还有一个代谢物基因激活蛋白（CAP）结合位点。由P序列、O序列和CAP 结合位点共同构成lac操纵子的调控区，三个酶的编码基因即由同一调控区调节，实现基因产物的协调表达。在没有乳糖存在时，lac操纵子处于阻遏状态。此时，I序列在PI启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合，阻碍RNA聚合酶与P 序列结合，抑制转录起动。当有乳糖存在时，lac操纵子即可被诱导。在这个操纵子体系中，真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞，经b－半乳糖苷酶催化，转变为半乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化，导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录。异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用。 四、试剂准备: （一）实验器材的灭菌： 枪头的灭菌： 1mL，200μL，20μL的枪头放入枪头盒，用报纸包住（2层），放入高压灭菌锅中灭菌，121℃，20min。80℃烘箱中烘干，常温放置。 螺口管及离心管的灭菌： 将螺口管和离心管分别放入铝制饭盒中（盖子要拧松，离心管的管盖打开），放入高压灭菌锅中灭菌，121℃，20min。80℃烘箱中烘干，常温放置。 50mL离心管的灭菌： 将50mL离心管用报纸包住（2层），放入高压灭菌锅中灭菌，121℃，20min。80℃烘箱中烘干，常温放置。 （二）LB培养基的配制 液体LB培养基（1L）：蛋白胨10g 氯化钠10g 酵母提取物5g 调PH值到7.5，高压灭菌，4℃保存。 固体LB培养基（1L）：蛋白胨10g
蛋白表达纯化实验步骤
蛋白表达纯化实验步骤(待改进) 1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA。 2、设计蛋白表达引物。引物要去除信号肽,要加上适当的酶切位点和保护碱基。 3、RT-PCR,KOD酶扩增获取目的基因c DNA. 4、双酶切,将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。 5、转化到DH5α感受态细菌中扩增,提质粒。 6、将质粒转化入表达菌株,挑菌检测并保种。表达菌株如Bl21(DE3)、Rosetta gami(DE3)、Bl21 codon(DE3)等。 7、蛋白的诱导表达。 1)将表达菌株在3ml LB培养基中摇至OD=0.6左右,加入IPTG,浓度梯度从25μM 到1m M。37度诱导过夜(一般3h以上即有大量表达)。 2)SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。注:目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体 蛋白的50%以上,在胶上可以看到明显的粗大的条带。 3)将有表达的菌株10%甘油保种,保存1ml左右就足够了,并记录IPTG浓度范围。 甘油是用0.22μm过滤除菌的,储存浓度一般是30%-60%,使用时自己计算用量。 4)用上述IPTG浓度范围的最低值诱导10ml表达菌,18度,低转速(140-180rpm), 诱导过夜作为包涵体检测样品。 注意:1.如果表达的蛋白对菌体有毒性,可以在加IPTG之前的培养基中加入1%的葡萄糖用来抑制本底表达。葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽,不会影响后面的表达。2. 保种可以取一部分分成50μl一管,每次用一管,避免反复冻融。 8、包涵体检测。方案见附件2 9、如有上清表达,则扩大摇菌。 1)取保种的表达菌株先摇10ml,37度,300rpm摇至OD>=1.5,约5h左右,视菌种
大肠杆菌表达重组蛋白的超声破碎及纯化
大肠杆菌表达重组蛋白的超声破碎及纯化 一可溶性蛋白的纯化 （一）菌体的破碎 1. 仪器与材料：-80℃冰箱；超声波细胞破碎仪；50mM PBS或50mM Tris-HCl pH 7.5；50 ml 离心管；冷冻高速离心机 2.方法 2.1反复冻融 2.1.1收集菌液500ml，等分10份，4000 r/min 4℃离心15min，弃上清。 2.1.2 菌体沉淀中加入相同菌液体积的50mM PBS 或50mM Tris-HCl（选择使蛋白稳定的缓冲液和pH）重悬洗涤一次。 2.1.3 然后按原菌液体积的1/4加入缓冲液重悬菌体，并加入蛋白酶抑制剂PMSF和EDTA(带His标签不加)，PMSF终浓度为100μg/ml, EDTA的终浓度为。取20μl重悬菌液进行电泳，检测蛋白表达的情况（是否表达，是可溶性表达还是包涵体表达）。 2.1.4 将菌液（经检测有表达）在-80度冰冻，室温融解，反复几次（反复冻融三次），由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。 2.2超声波处理 (对超声波及热敏感的蛋白慎用) 2.2.1 将反复冻融的菌液（必要时可加入1mg/ml 溶菌酶，缓冲液pH＞8.0，加入后需静置20min），进行超声破碎，超声条件：400W，工作5秒，间隔5秒，重复一定次数，（根据我们的仪器找出一个比较好的工作条件）。直至菌体溶液变清澈为止，大约花费时间。 2.2.2 取少量经超声破碎后的菌液，10000rpm离心10分钟，分别对上清和沉淀进行检测，并用全菌作为阳性对照，检测菌体破碎程度及目标条带占总蛋白的含量。 注意事项： （1）超声破碎具体条件可根据实验情况而定，要掌握好功率和每次超声时间，降低蛋白被降解的可能。 （2）功率大时，每次超声时间可缩短，不能让温度升高，应保持在4度左右，超声时保持冰浴。 （3）菌体破碎后总蛋白浓度的测定可用Bradford法或者紫外吸收法。 （4）可通过SDS-PAGE 电泳观察菌体破碎程度及目标条带占总蛋白的含量。 二包涵体蛋白的纯化 1菌体的破碎（加溶菌酶处理包涵体效果可能不好，包涵体中总是有残留的溶菌酶，你看看有没有不加溶菌酶的，这个先保留好了） 1.1仪器与材料：超声波细胞破碎仪；20mM PBS或20mM Tris-HCl pH 7.5；裂解液buffer A；溶菌酶10mg/ml；50ml ，15ml离心管；冷冻离心机 1.2 方法 (1) 收集菌液500ml，等分10份，4000 r/min 4℃离心15min，弃上清。
大肠杆菌表达系统与蛋白表达纯化(参考资料)
8.大肠杆菌表达系统与蛋白表达纯化 大肠杆菌表达系统遗传背景清楚，目的基因表达水平高，培养周期短，抗污染能力强等特点, 是分子生物学研究和生物技术产业化发展进程中的重要工具。因此熟练掌握并运用大肠杆菌表达系统的基本原理和常规操作是对每一个研究生来说是非常必要 的。本章节介绍了实验室常用的大肠杆菌表达系统的构成特点，归纳了利用大肠杆菌表达系统纯化重组蛋白的基本流程和详细 操作步骤，并且结合笔者的操作经验，总结了初学者在操作过程中可能遇到的问题和解决策略。 8.1大肠杆菌表达系统的选择与构建 8.1.1表达载体的选择 根据启动子的不同这些载体大致可以分为热诱导启动子，如λPL，cspA 等和另外一类就是广泛使用的IPTG诱导的启动子，如lac，trc，tac，T5/lac operator，T5/lac operator等。根据表达蛋白质的类型可分为单纯表达载体和融合表达载体。融合表达是在目标蛋白的N端或C端添加特殊的序列，以提高蛋白的可溶性，促进蛋白的正确折叠，实现目的蛋白的快速亲和纯化，或者实现目标蛋白的表达定位。常用的用于亲和纯化融合标签包括 Poly-Arg， Poly-His, Strep-Tag Ⅱ，S-tag，MBP等。其中His-Tag 和GST-Tag 是目前使用最多的。His Tag 大多数是连续的六个His 融合于目标蛋白的N端或C端，通过His 与金属离子：Cu2+>Fe2+>Zn2+>Ni2+ 的螯合作用而实现亲和纯化，其中Ni2+是目前使用最广泛的。His 标签具有较小的分子量，融合于目标蛋白的N端和C端不影响目标蛋白的活性，因此纯化过程中大多不需要去除。目前常使用的表达载体主要是由Novagen 提供的pET 系列和Qiagen 公司提供的pQE 系列。 除了His 标签外，还原性谷胱甘肽S-转移酶是另一种实验室常用的融合标签。它可以通过还原性谷胱甘肽琼脂糖亲和层析而快速纯化。此外，与His 相比，GST 很多时候能够促进目标蛋白的正确折叠，提高目标蛋白表达的可溶性，因此，对于那些用his 标签表达易形成包涵体的蛋白，可以尝试用GST融合表达来改进。当然，GST 具有较大的分子量（26kDa），可能对目的蛋白的活性有影响，因此很多时候切除GST是必须的。目前，GST融合表达系统主要是由GE Healthcare （原Amersham）提供。 8.1.2宿主菌的选择 重组质粒的构建一般选择遗传稳定，转化效率高，质粒产量高的菌株作为受体菌，常用的有E.coli DH5α，E.coli JM 109，E.coli DH 10B ，E.coli NovaBlμe等rec A–和end A–型细胞。作为表达宿主菌必须具备几个基本特点：遗传稳定，生长速度快，表达蛋白稳定。具体操作过程中，根据所使用的表达载体的特点，目的基因密码子的组成等选择特定的表达宿主菌。以下是实验室常用的几种表达宿主： BL2： lon和ompT 蛋白酶缺陷型，避免了宿主对外源蛋白的降解。是经典的使用最广泛的表达受体。适用于Tac，Trc，Lac，λPL，cspA等作为启动子的载体。 BL21（DE3）： DE3噬菌体溶源于BL21 形成的带有染色体T7 RNA 聚合酶基因大肠杆菌。IPTG 诱导的lac ΜV5 启动子控制T7 RNA 聚合酶基因表达T7 RNA 聚合酶，进而控制T7 表达系统表达目的蛋白。 BL21（DE3）衍生系列：在经典的T7表达系统BL21（DE3）的基础上，Novagen 公司开发了一些特殊的表达宿主细胞。比如：Origami （DE3），Origami B（DE3）和Rosetta-gami （DE3）菌株带有 trxB和
生物化学实验报告记录：Westernblotting检测大肠杆菌重组蛋白
生物化学实验报告记录：Westernblotting检测大肠杆菌重组蛋白
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实验三 Western blotting检测大肠杆菌重组蛋白 一、实验目的 利用Western Blotting技术，定性（或定量）检测苦荞黄酮醇合酶基因（Flavon ol synthase gene, FtFLS）在大肠杆菌表达宿主菌Escherichia coli BL(DE3)中的诱导表达。 二、实验原理 黄酮醇合酶（FLS，EC 1.14.11.23）属于2-ODD家族，催化黄酮醇合成支路中最后一步氧化反应，也是直接合成黄酮醇的反应。FLS可以使二氢黄酮醇在C3链中C2和C3之间氧化形成双键，从而生成黄酮醇：a Dihydroflavonol + 2-oxoglutarate + O2 a Flavonol + succinate + CO2 + H2O。 本实验采用PCR的方法，在苦荞黄酮醇合酶基因（FtFLS）ORF起始密码子前引入Kpn?酶切位点，去掉终止密码并引入Bam H ?酶切位点。克隆引入酶切位点后的FtFLS到表达载体pET-30b(+)质粒中，其表达产物分别在N-末端和C-末端各含有6 ×His标签。重组质粒（pET-30b(+)-FtFLS）经鉴定后转化表达宿主菌E. coli BL21(DE3)并使用IPTG进行诱导表达。收集诱导0 h、2 h、4 h、6 h和8 h的产物，经SDS-PAGE后用于考马斯亮蓝R-250染色或Western blotting分析。 Western blotting的标准流程如下：蛋白质首先通过SDS-PAGE胺凝胶电泳分离，通过电泳转移到固相支持物上（硝酸纤维素膜、PVDF膜和尼龙膜）；将膜上未反应的位点封闭起来，以抑制抗体的非特异性吸附，固定的蛋白质即可与特异性的多克隆或单克隆抗体相互作用并通过放射、生色或化学发光的方法进行定位。 本实验采用小鼠抗聚组氨酸单克隆抗体（Anti-His tag IgG，一抗）与重组FtF LS蛋白的N-末端和C-末端6 ×His发生抗原-抗体特异反应，再利用辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG（peroxidase-Goat Anti- Mouse IgG，二抗）与一抗发生特异结合，最后使用DAB进行显色。DAB即：二氨基联苯胺（3, 3'-diaminobenzidine），是过氧化物酶（Peroxidase）的生色底物。DAB在过氧化氢的存在下失去电子而呈现出颜色变化和积累，形成浅棕色不溶性产物。该方法常用于检测过氧化物酶的活性，它灵敏度高，特异性好，在免疫组化，原位杂交，Western blotting等膜显色中
IPTG诱导蛋白表达的原理
IPTG诱导蛋白表达得原理 IPＴＧ诱导得产物就是重组后表达载体中得插入序列所能够翻译得蛋白，并可视载体构建情况翻译后续得标签序列。 用乳糖操纵子作为启动子进行蛋白质表达得时候，需要诱导物进行诱导（相当于点火)，但乳糖可以被细胞利用掉，所以利用IPＴＧ（异丙基－β—Ｄ-硫代半乳糖苷）在结构上与乳糖得相似性也可以将基因表达启动,但它不能被细胞利用掉，从而实现持续得表达、 IPTG就是一种诱导外源基因表达得诱导剂,它不仅仅如我们学过得作为乳糖得类似物诱导大肠杆菌表达半乳糖苷酶，它就是一种普遍应用得诱导剂,能诱导菌种表达多种外源基因。 但就是它能诱导基因表达得具体原理我却了解得不就是很多，我在网上查到以下一些内容，供查阅者借鉴. 最早应用于得表达系统就是Lac乳糖操纵子,乳糖得类似物IＰTG 可以与lacＩ产物结合，使其构象改变离开laｃO,从而激活转录、?这种可诱导得转录调控成为了大肠杆菌表达系统载体构建得常用元件。ｔac启动子就是ｔrp启动子与lａcUV5得拼接杂合启动子,且转录水平更高，比ｌacUV5更优越。trc启动子就是ｔrp启动子与ｌac启动子得拼合启动子，同样具有比trp更高得转录效率与受ｌacI 阻遏蛋白调控得强启动子特性.在常规得大肠杆菌中，lacI阻遏蛋白表达量不高，仅能满足细胞自身得ｌaｃ操纵子，无法应付多拷贝得质粒得需求，导致非诱导条件下较高得本底表达,为了让表达系统严谨调控产物表达，能过量表达lacＩ阻遏蛋白得lacIｑ突变菌株
常被选为Lac/Tac/tｒc表达系统得表达菌株。现在得Laｃ/Tac／trc 载体上通常还带有ｌacIq 基因,以表达更多lacI阻遏蛋白实现严谨得诱导调控。ＩＰTG 广泛用于诱导表达系统,但就是IPＴG有一定毒性,有人认为在制备医疗目得得重组蛋白并不合适,因而也有用乳糖代替IＰＴＧ作为诱导物得研究。另外一种研究方向就是用lacＩ得温度敏感突变体，30度下抑制转录,42度开发。热诱导不用添加外来得诱导物，成本低，但就是由于发酵过程中加热升温比较慢而影响诱导效果，而且热诱导本身会导致大肠杆菌得热休克蛋白激活,一些蛋白酶会影响产物稳定、 Ｔ7启动子就是当今大肠杆菌表达系统得主流，这个功能强大兼专一性高得启动子经过巧妙得设计而成为原核表达得首选，尤其以Novａgeｎ公司得pEＴ系统为杰出代表.强大得T7启动子完全专一受控于T7 RNA聚合酶,而高活性得T7 RNＡ聚合酶合成ｍRNＡ得速度比大肠杆菌RNＡ聚合酶快5倍——当二者同时存在时，宿主本身基因得转录竞争不过Ｔ7表达系统,几乎所有得细胞资源都用于表达目得蛋白；诱导表达后仅几个小时目得蛋白通常可以占到细胞总蛋白得50％以上。由于大肠杆菌本身不含T7 RＮＡ聚合酶,需要将外源得Ｔ7 ＲNA 聚合酶引入宿主菌，因而T７RＮA 聚合酶得调控模式就决定了Ｔ7系统得调控模式-—非诱导条件下,可以使目得基因完全处于沉默状态而不转录,从而避免目得基因毒性对宿主细胞以及质粒稳定性得影响；通过控制诱导条件控制Ｔ7 RNA聚合酶得量,就可以控制产物表达量,某些情况下可以提高产物得可溶
重组蛋白IFNGA在大肠杆菌中的表达与纯化
高中组 11年级 生物化学 3人项目 重组蛋白IFNGA在大肠杆菌中的表达与纯化
重组蛋白IFNGA在大肠杆菌中的表达与纯化 摘要： 干扰素γ（Interferon gamma，IFN-γ）是体内重要的细胞因子，能够通过调控免疫相关基因的转录协调机体的免疫反应，具有抗病毒、抗肿瘤、增强免疫力能功能。目前对于IFN-α、IFN-β重组表达的较多，而关于IFN-γ 蛋白的纯化表达较少.因此,本研究使用PCR方法扩增IFN-γ基因，将IFN-γ基因分别插入原核表达载体pET-30构建重组表达质粒pET-30--IFN-γ，转化大肠杆菌BL21和Rosetta菌株，在IPTG诱导下表达IFN-γ，SDS-PAGE分析重组表达蛋白。结果表明：成功构建重组表达质粒pET-30-IFN-γ；表达产物主要以包涵体形式存在；经Ni2+-NTA亲和层析纯化，获得高纯度重组蛋白。本实验纯化的蛋白有望在今后用于医学和生物学研究中。 关键词：干扰素；IFN-γ 蛋白；大肠杆菌表达系统；重组表达；蛋白纯化； 一、研究背景 干扰素（IFN）是一种广谱抗病毒剂，并不直接杀伤或抑制病毒，而主要是通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制病毒（比如：乙肝病毒）的复制。其类型分为三类，α-（白细胞）型、β-（成纤维细胞）型，γ-（淋巴细胞）型；同时还可增强自然杀伤细胞（NK细胞）、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用，并增强抗病毒能力。干扰素是一组具有多种功能的活性蛋白质（主要是糖蛋白），是一种由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子。它们在同种细胞上具有广谱的抗病毒、影响细胞生长，以及分化、调节免疫功能等多种生物活性。 其中，IFN-γ是体内重要的免疫调节因子，能通过与细胞表面受体结合，诱导病毒感染细胞产生多种抗病毒蛋白，使细胞内产生抗病毒状态而发挥抗病毒作用。在诱导效应因子表达的同时，由于IFN-γ能够提高细胞表面MHC分子的表达，增强免疫活性细胞对病原体的杀伤作用，从而协同促进了机体对病毒感染细胞的杀灭，而使机体处于抗病毒状态。虽然各种类型的干扰素均能介导细胞对病毒感染的反应，但IFN-γ 的免疫调节活性在协调免疫反应和确定机体长期的抗病毒状态中发挥更为重要的作用。其作用可大致总结为以下几点：①
大肠杆菌蛋白表达体系的构建实验报告
大肠杆菌蛋白表达系统的构建与蛋白质的分离纯化 ●实验目的： 1.学会氯化钙制备大肠杆菌DH10B感受态细胞及掌握质粒转化感受态细胞的操作方法 2.转化BL21(DE3)并在合适条件下诱导表达蛋白，掌握蛋白质诱导表达的原理，学习蛋白质诱导表达的方法 3. 学会使用镍柱分离纯化蛋白质，利用PEPC试剂盒测定PEPC的活力。 ●实验原理： 1. 钙转法：Ca2+能与加入的DNA分子结合，形成抗DNA酶(DNase)的羟基-磷酸钙复合物，并黏附在细菌细胞膜的外表面上。当42℃热刺激短暂处理细菌细胞时，细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，并随之出现许多间隙，为DNA分子提供了进入细胞的通道。 2. 诱导BL21(DE3)表达蛋白质的原理：E. coli BL21(DE3)其DE3是整合在细菌基因组上的一种携带T7 RNA聚合酶基因和lacI基因的λ噬菌体，lacI编码的阻遏蛋白与lac操纵基因结合，从而不能进行外源基因的转录和表达，此时宿主菌正常生长。IPTG为乳糖类似物，不能被细胞利用，可以特异结合阻遏蛋白，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则外源基因大量转录并高效表达。 3. 六聚组氨酸纯化蛋白的原理：亲和层析是一种通过生物分子之间的特异性的相互作用来分离物质的层析方法。 组氨酸是具有杂环的氨基酸，每个组氨基酸含有一个咪唑基团，这个化学结构带有很多额外电子，对于带正电的化学物质有静电引力，亲和层析是利用这个原理来进行吸附的，亲和配体（也就是填料）上的阳离子（一般是镍离子）带正电对组氨酸有亲和作用。组氨酸标签是原核表达载体上6个组氨酸的区段,这个标签在PH8.0时不带电,且无免疫原性,对蛋白质的分泌,折叠,功能基本上无影响.能高度亲和镍离子,用于蛋白质的亲和纯化. 4. 目标蛋白：磷酸烯醇丙酮酸羧化酶（Phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPC. 酸羧化酶的催化下，草酰乙酸转变为磷酸烯醇式丙酮酸和二氧化碳。该反应消耗一分子的三磷酸鸟苷以提供磷酰基。在糖异生作用中，此酶与丙酮酸羧化酶一起构成了从丙酮酸转化为磷酸烯醇式丙酮酸的迂回步骤。
大肠杆菌高效表达重组蛋白策略
大肠杆菌高效表达重组蛋白策略 前言 重组蛋白的制备在蛋白结构分析和医疗应用领域十分重要。药物蛋白的研究需要高纯度的重组蛋白来进行药物动力学和物理化学的研究[1]。重组蛋白在检测酶活、连接配体、蛋白相互作用等生物学领域广泛应用。已经表达出多种重组蛋白被证明有很大的应用潜力[2,3]。通过基因工程改造的方法已经获得了许多性状优良的宿主菌表达系统，尤其是通过大肠杆菌可以大量表达外源基因编码的重组蛋白[4]。但是仍然有两个问题制约着大肠杆菌表达系统对重组蛋白的表达：一个是表达量低，还有一个就是表达错误折叠的蛋白包涵体[5]。蛋白的表达和纯化工艺一直在发展进步，但是超过30%的重组蛋白为不具有生物活性的包涵体，严重影响了重组蛋白的生产应用[6,7]。 在理想条件下，重组蛋白由强启动子进行表达，产生大量的具有生物学活性的可溶性重组蛋白。但是，强启动子会导致重组蛋白的过表达,从而影响宿主菌体的生长并产生包涵体[8]。在某些条件下可以通过变性、复性的方法使包涵体恢复活性[9]，但是复性后的蛋白是否能够完全恢复活性仍然未可知。一般来讲，可以通过表达条件的优化来促进蛋白的可溶性表达，比如：诱导温度、培养基组成、宿主菌的种类。还可以通过多种方案来解决蛋白不溶的问题：蛋白重新折叠[10]，构建融合蛋白[11]。另外想要进一步增加蛋白可溶性可以与分子伴侣共表达[8]或者低温诱导[12]。本文对目前主要的促进蛋白可溶表达的方法进行了比较全面的总结。 1.大肠杆菌表达系统的构建 1.1选择表达宿主菌 对于大规模的表达重组蛋白，一般选择胞表达或者周质空间表达。与周质空间表达相比，胞表达的表达量更高，因此应用更为广泛。在实验研究和实际生产中，已经有很多大肠杆菌表达系统广泛应用于。在表达体系中较为常用的大肠杆菌为B菌株和K12菌株及它们的衍生菌株（表1[13]）。美国国立研究院已经认证了K12菌株的标准性以及安全的使用方案，因此K12菌株在生产应用中具有极大的优势。但是由B菌株演变而来的BL系列菌株与K12相比，突变了lon 和ompT两个基因[14]，因此具有许多表达优势：产物积累少，缺少蛋白酶，防止产物被降解。这些优势使得BL菌株也具有非常广泛的应用[15,16,17]。 通常来讲，针对不同的重组蛋白，宿主菌的选择也是不同的。如果重组蛋白含有大肠杆菌稀有密码子，就需要宿主能够表达针对这些密码子的tRNA，比如
目的蛋白的诱导表达
目的蛋白的诱导表达 1.诱导目的蛋白表达 （1）从平板或甘油保存菌中接一环重组工程菌和pET-22b(+)空载体转化细胞，加入3 ml Amp(100ug/ml)+LB的培养液中，37℃，250rmp摇床培养过夜。（2）将过夜培养的重组工程菌和pET-22b(+)空载体转化细胞分别按1%的比例转种于30 ml Amp(100ug/ml)+LB的培养液中。 （3）37℃摇床培养至OD600到0.4-1。 （4）从重组工程菌和pET-22b(+)空载体转化细胞中各取10ml培养物作为未诱导对照；在剩下的样品中加入1M IPTG储液至终浓度1mM，继续培养2-3 小时。 （5）将摇瓶置于冰上5分钟，5000g 4℃离心15分钟收集菌体，菌体保存于-20℃冰箱或SDS-PAGE分析等。 2.表达条件的优化： 1）IPTG的诱导浓度的确定： （1）重组工程菌的诱导：从平板或甘油保存菌中接一环重组工程菌和pET-22b(+)空载体转化细胞，加入3 ml Amp(100ug/ml)+LB的培养液中， 37℃，250rmp摇床培养过夜。 （2）将过夜培养的重组工程菌按1%的比例转种于30 ml Amp(100ug/ml)+LB的培养液中。 （3）在37℃，250rmp摇床培养至OD600约为0.8。 （4）按6ml/份上述培养物分装，分别加入IPTG至终浓度0, 0.5, 1, 1.5, 2.0mM。（5）37℃，250rmp摇床培养8h，在无菌条件下取样并测定OD600值。 （6）所取样品1ml/份分装，5000g 4℃离心15分钟收集菌体。 （7）菌体保存于-20℃冰箱或SDS-PAGE分析或蛋白含量测定。 2）IPTG诱导温度条件的优化： （1）重组工程菌的诱导：从平板或甘油保存菌中接一环重组工程菌和pET-22b(+)空载体转化细胞，加入3 ml Amp(100ug/ml)+LB的培养液中， 37℃，250rmp摇床培养过夜。 （2）将过夜培养的重组工程菌按1%的比例转种于30 ml Amp(100ug/ml)+LB的培养液中。 （3）在37℃，250rmp摇床培养至OD600约为0.8。 （4）在诱导之前，将30ml培养液分为5份，每份各6ml，其中4份加入IPTG，另1份不加IPTG作为不诱导对照。加入IPTG至终浓度为1.0mM,选取几个适当温度点（可从15-37℃之间选择）250rmp摇床培养。 （5）培养8h后，在无菌条件下取出样品6ml，并测定OD600值。 （6）所取样品1ml/份分装，5000g 4℃离心15分钟收集菌体。 （7）菌体保存于-20℃冰箱或SDS-PAGE分析或蛋白含量测定。 3）诱导时间优化 （1）重组工程菌的诱导：从平板或甘油保存菌中接一环重组工程菌和pET-22b(+)空载体转化细胞，加入3 ml Amp(100ug/ml)+LB的培养液中， 37℃，250rmp摇床培养过夜。
蛋白表达步骤
1．培养基的配制 原理 wenku.baidu./link?url=B2SX0TUS5KB2ovXQcKyds9MS9OnW7y5Yn204CH3vg44FsT WICJAnwePCb013a9T-vzmX5g9oCbv6GSuPahN6jfA9hVhQXCd3QCMZ_NTscu7 步骤 LB培养基，是微生物学实验中最常用的培养基，用于培养大肠杆菌等细菌，其分为液态或是加入琼脂制成的固态培养基。加入抗生素的LB 培养基可用于筛选以大肠杆菌为宿主的克隆。尽管该培养基的名称被广泛解释为Luria-Bertani 培养基，然而根据其发明人贝尔塔尼(Giuseppe Bertani)的说法，这个名字来源于英语的lysogeny broth，即溶菌肉汤。 LB培养基的配制： 成分 胰蛋白胨(tryptone) 10g 酵母提取物(yeast extract) 5g
氯化钠(NaCl) 10g 固体培养基另加琼脂粉15-20g 加双蒸水至1000mL, 用5mol/L NaOH（约0.2ml）调pH至7.2，121℃灭菌30min 配制方法 （1）称量分别称取所需量的胰化蛋白胨、酵母提取物和NaCl，置于烧杯中。 （2）溶化加入所需水量2/3的蒸馏水于烧杯中，用玻棒搅拌，使药品全部溶化。 （3）调pH 用1mol/L NaOH溶液调pH至7.2。 （4）定容将溶液倒入量筒中，加水至所需体积。 （5）加琼脂加入所需量琼脂，加热融化，补足失水。 （6）分装、加塞、包扎。 （7）高压蒸汽灭菌100Pa灭菌20min。
2、大肠杆菌菌种活化 原理 菌种的活化就是将处于保藏状态的菌种放入合适的培养基中进行培养，逐级增大培养是为了得到纯而壮的培养物，可以理解为就是为了获得活力旺盛的、接种数量足够的培养物进行培养。菌种发酵一般情况下需要2-3代的复壮过程，因为保存时的条件往往和培养时的条件不相同，所以要活化,让菌种逐渐适应培养环境 中药标准对照品研究中心建议实验要明白菌种活化的情况就首选需要了解菌种保藏的方式和方法。目前国际和国常用的菌种保存方法包括：定期移植法、液体石蜡法、沙土管法、真空冷冻干燥法、80℃冰箱冻结法、液氮超低温冻结法。 对于不同的保存方式活化的方式也不同： 1 定期移植法的菌种复较简单，直接转接即可； 2 液体石蜡法保存的菌种在复时，挑取少量菌体转接在适宜的新鲜培养基上，生长繁殖后，再重新转接一次；
IPTG诱导蛋白表达全面介绍
IPTG全面介绍：优点·使用·配制·特点 摘要: 异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)是一种作用极强的诱导剂,不被细菌代谢而十分稳定,因此被实验室广泛应用。IPTG 常用于需要诱导β-半乳糖苷酶活性的克隆实验。它常与X-Gal 或Bluo-Gal 结合使用，用于重组细菌菌落的蓝白筛选，这些菌落可以诱导lac 操纵子在大肠杆菌中的表达。IPTG 与lacI 阻遏蛋白结合并改变其构象而发挥作用，防止β-半乳糖苷酶编码基因lacZ 的抑制。 中文名：异丙基-β-D-硫代半乳糖苷( IPTG) 英文名称：Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside 用途：异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)是一种作用极强的诱导剂,不被细菌代谢而十分稳定,因此被实验室广泛应用。IPTG 常用于需要诱导β-半乳糖苷酶活性的克隆实验。它常与X-Gal 或Bluo-Gal 结合使用，用于重组细菌菌落的蓝白筛选，这些菌落可以诱导lac 操纵子在大肠杆菌中的表达。IPTG 与lacI 阻遏蛋白结合并改变其构象而发挥作用，防止β-半乳糖苷酶编码基因lacZ 的抑制。 使用方法：首先把IPTG配制成23.83 mg/ml(100 mM)的水溶液，并进行过滤除菌后保存。然后在100 ml的琼脂培养基中，加入100 μl 的上述溶液、200 μl的X-Gal(20 mg/ml的二甲基甲酰胺(DMF)溶液)和100 μl的Amp(100 mg/ml)，制作成IPTG、X-Gal、Amp平板培养基。当dna 片段插入至pUC系列载体(或其他带有lacZ、Amp基因载体)，然后转化至lacZ缺失细胞中后，涂布上述的IPTG、X–Gal、Amp平板培养基，可根据长出菌体的蓝白色，而方便地挑选出基因重组体(白色为具有DNA插入片段的基因重组体)。 配制方法：在8ml蒸馏水中溶解2g IPTG后，用蒸馏水定容至10ml，用0.22μm滤器过滤除菌，分装成1ml小份贮存于-20℃。 优点： 1.能诱导酶的合成，但又不被分解的分子，称为安慰诱导物。由于乳糖虽可诱导酶的合成，但又随之分解，产生很多复杂的动力学问题，因此人们常用安慰诱导物来进行各种实验。 2.IPTG不被菌体代谢，为乳糖类似物，一旦进入细胞就会产生持续长久的诱导效果，所以IPTG的诱导效率高，往往只需要很少量(1mmol/L)即可达到理想诱导效果。由于IPTG不被代谢，在胞内专一诱导外源蛋白的表达。不受细胞代谢的影响，诱导效果持续稳定。乳糖有双效作用，既能做为诱导剂异乳糖的前体物质，又可以做碳源，在诱导过程中，很不稳定，IPTG因其优异的稳定性决定了它适合做实验研究用。 3.IPTG能在缺乏lacY基因下而有效地被抄送。 4.半乳糖苷键中用硫代替了氧，失去了水解活性，但硫代半乳糖苷和同源的氧代化合物与酶位点的亲和力相同，IPTG虽不为β–半乳糖苷酶所识别，但它是lac基因簇十分有效的诱导物。 注意事项：培养噬菌体时，Top agar中的添加量为：25 μl/3 ml(24 mg/ml)。含有 IPTG 的培养基4℃避光保存，须在1~2 周内使用。 保存：2-8°C冷藏保存，配制好后保存于-20°C，室温可放置一个月。远离热源及氧化剂。 IPTG诱导蛋白表达的原理.材料.实验方法 摘要: E.coli的乳糖操纵子(元)含Z、Y及A三个结构基因,分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶,此外还有一个操纵序列O、一个启动子序列P及一个调节基因I.I基因编码一种阻遏蛋白,后者与O序列结合,使操纵子(元)受阻遏而处于关闭状态.在启动序列P上游还有一个分解(代谢)物基因激活蛋白(CAP)结合位点.由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区,三个酶的编码基因即由同一调控 E.coli的乳糖操纵子(元)含Z、Y及A三个结构基因,分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶,此外还有一个操纵序列O、一个启动子序列P及一个调节基因I.I基因编码一种阻遏蛋白,后者与O序列结合,使操纵子(元)受阻遏而处于关闭状态.在启动序列P上游还有一个
IPTG诱导蛋白表达的原理及方法步骤
IPTG诱导蛋白表达的原理及方法步骤 E.coli的乳糖操纵子（元）含Z、Y及A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶，此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节基因I。I基因编码一种阻遏蛋白，后者与O序列结合，使操纵子（元）受阻遏而处于关闭状态。在启动序列P上游还有一个分解（代谢）物基因激活蛋白（CAP）结合位点。由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区，三个酶的编码基因即由同一调控区调节，实现基因产物的协调表达。在没有乳糖存在时，lac操纵子（元）处于阻遏状态。此时，I序列在PI启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结合，抑制转录起动。当有乳糖存在时，lac操纵子（元）即可被诱导。在这个操纵子（元）体系中，真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞，经b－半乳糖苷酶催化，转变为半乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化，导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录。异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用。 材料 1、诱导表达材料 ( 1 ) LB （Luria—Bertani）)培养基 酵母膏 (Yeast extract) 5g 蛋白胨 (Peptone) 10g NaCl 10g 琼脂 (Agar) 1-2% 蒸馏水 (Distilled water) 1000ml pH 7.0 适用范围：大肠杆菌 ( 2 ) IPTG 贮备液：2 g IPTG溶于10 mL 蒸馏水中，0 . 22 μm 滤膜过滤除菌，分装成1 mL /份，－20 ℃ 保存。 ( 3 ) l× 凝胶电泳加样缓冲液： 50 mmol / L Tris -CI ( pH 6 . 8 ) 50 mmol / L DTT 2 % SDS （电泳级） 0.1 ％溴酚蓝 10 ％甘油 2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料
蛋白表达步骤
1．培养基的配制 原理步骤 LB培养基，是微生物学实验中最常用的培养基，用于培养大肠杆菌等细菌，其分为液态或是加入琼脂制成的固态培养基。加入抗生素的 LB 培养基可用于筛选以大肠杆菌为宿主的克隆。尽管该培养基的名称被广泛解释为Luria-Bertani 培养基，然而根据其发明人贝尔塔尼(Giuseppe Bertani)的说法，这个名字来源于英语的 lysogeny broth，即溶菌肉汤。 LB培养基的配制： 成分 胰蛋白胨(tryptone) 10g 酵母提取物(yeast extract) 5g 氯化钠(NaCl) 10g 固体培养基另加琼脂粉 15-20g 加双蒸水至1000mL, 用5mol/L NaOH（约）调pH至，121℃灭菌30min 配制方法 （1）称量分别称取所需量的胰化蛋白胨、酵母提取物和NaCl，置于烧杯中。 （2）溶化加入所需水量2/3的蒸馏水于烧杯中，用玻棒搅拌，使药品全部溶化。 （3）调pH 用1mol/L NaOH溶液调pH至。 （4）定容将溶液倒入量筒中，加水至所需体积。 （5）加琼脂加入所需量琼脂，加热融化，补足失水。 （6）分装、加塞、包扎。 （7）高压蒸汽灭菌100Pa灭菌20min。
2、大肠杆菌菌种活化 原理 菌种的活化就是将处于保藏状态的菌种放入合适的培养基中进行培养，逐级增大培养是为了得到纯而壮的培养物，可以理解为就是为了获得活力旺盛的、接种数量足够的培养物进行培养。菌种发酵一般情况下需要2-3代的复壮过程，因为保存时的条件往往和培养时的条件不相同，所以要活化,让菌种逐渐适应培养环境 中药标准对照品研究中心建议实验要明白菌种活化的情况就首选需要了解菌种保藏的方式和方法。目前国际和国内常用的菌种保存方法包括：定期移植法、液体石蜡法、沙土管法、真空冷冻干燥法、80℃冰箱冻结法、液氮超低温冻结法。 对于不同的保存方式活化的方式也不同： 1 定期移植法的菌种复苏较简单，直接转接即可； 2 液体石蜡法保存的菌种在复苏时，挑取少量菌体转接在适宜的新鲜培养基上，生长繁殖后，再重新转接一次； 3 沙土管法保存菌种在复苏时，在无菌条件下打开沙土管，取部分沙土粒于适宜的斜面培养基上，长出菌落后再转接一次。或取沙土粒于适宜的液体培养基中，增殖培养后再转接斜面； 4 真空冷冻干燥法保存菌种在复苏时先用70%酒精棉花擦拭安瓿上部，将安瓿管顶部烧热，用无菌棉签沾冷水，在顶部擦一圈，顶部出现裂纹，用挫刀或镊子颈部轻叩一下，敲下已开裂的安瓿管的顶端，用无菌水或培养液溶解菌块，使用无菌吸管移入新鲜培养基上，进行适温培养； 5 -80℃冰箱冻结法保存菌种复苏时，从冰箱中取出安瓿管或塑料冻存管，应立即放置38℃-40℃水浴中快速复苏并适当快速摇动。直到内部结冰全部溶解为止，约需50秒-100秒。开启安瓿管或塑料冻存管，将内容物移至适宜的培养基上进行培养 6 液氮超低温冻结法保存菌种复苏与-80℃冰箱冻结法保存菌种复苏相似，从液氮罐中取出安瓿管或塑料冻存管，应立即放置在38℃-40℃水浴中快速复苏并适当摇动。直到内部结冰全部溶解为止，一般约需50秒-100秒。开启安瓿管或塑料冻存管，将内容物移至适宜的培养基上进行培养。 步骤