大肠杆菌BL21_DE3_中表达重组蛋白的研究

IPTG的浓度在 016 mmolΠL 时 ,诱导表达的蛋白量占 全菌蛋白量的比例最大 ,约为 917 %. 而当 IPTG 浓 度超过 018 mmolΠL 时其诱导表达量不受 IPTG 的变 化影响. 根据文献报道 , IPTG 对细菌生长有一定的 抑制作用. 因此 ,可以认为 016 mmolΠL 的 IPTG 的浓 度是最佳诱导表达条件.
如何使得外源重组蛋白在大肠杆菌中获得最佳
表达 ,目前在国内还未见相关具体报道. 为了研究外 源基因在大肠杆菌中表达特点 ,以及能否在大肠杆 菌中直接形成具有生物活性的可溶性表达 ,我们利 用大肠杆菌表达系统表达了植物 ACC 合成酶[7 ,8] , 通过改变不同的表达条件 ,探讨了目的蛋白的表达 量 ,目的蛋白与全菌蛋白的比例关系和目的蛋白与 包涵体表达的特点. 为以后利用大肠杆菌获得外源 重组蛋白提供了一个有效的可供选择的条件与方 法.
Lu Hai ; Wu Wei ; Zeng Qingyin ; Li Yi ; Jiang Xiangning ; Wang Shasheng. The expression analysis of recom2 binant protein in Escherichia coli BL21 ( DE3) . Journal of Beijing Forestry University (2001) 23 (6) 1～4 [ Ch , 8 ref . ] College of Biology , Beijing For. Univ. , 100083 , P. R. China.
2 结果与讨论
211 融合蛋白的表达 IPTG诱导后收获的细菌 , SDS2PAGE 分析可看
出经 IPTG诱导的细菌可大量表达一个 55 kD 的新
蛋白 ,而未经 IPTG诱导的细菌不表达 55 kD 的蛋白 (图 1 ) . 新 蛋 白 的 分 子 量 为 55 kD , 与 文 献 值 一 致[10 ,11] ,说明诱导表达成功. 同时取培养基浓缩后电 泳 ,发现未有 55 kD 蛋白出现 ,说明植物 ACC 合成酶 不以胞外分泌蛋白的形成存在.
In order to research the expression of recombinant protein in Escherichia coli plant ,ACC synthase was ex2 pressed with expression vector in E. coli (BL21) . Using SDS2PAGE and wave length2scan system ,the expressed protein was found increasing with the increase of time ,bacteria density and IPTG density. The best expressed time was two and half hours ,and the protein was expressed highly at bacteria density of OD600 = 016 with 016mmolΠL IPTG. The expression of solubility protein with SDS2PAGE electrophoresis was not found. Key words ACC synthase , SDS2PAGE , inclusion body
责任作者 :蒋湘宁 ,男 ,1958 年生 ,教授. 主要研究方向 :植物分子生物学. Email :jiangxn @bjfu. edu. cn 工作单位 :100083 北京林业大学生 物学院森林生物学实验中心
© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.
达 3 h 收获细菌 ,用 SDS2PAGE 分析结果见图 3. 从图 中可以看出 , OD600 越大 ,其诱导表达的蛋白总量越 多 ,但 OD600 为 016 ,诱导表达的蛋白量占全菌蛋白量 的比 例 最 大. 此 时 目 的 蛋 白 量 占 全 菌 蛋 白 量 的 2018 % ,当 OD600 为 016 时进行诱导表达是最佳条件.
© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.
第6期
陆 海等 :大肠杆菌 BL21 (DE3) 中表达重组蛋白的研究
3
213 诱导表达量与细菌密度的关系 当菌液长到 OD600 为 011 至 110 时加 IPTG诱导表
1 材料与方法
111 材 料 11111 菌株和质粒 大肠杆菌 BL21 (DE3) 、表达载 体 p ET214 b 为本实验室保藏. 11112 试 剂 异丙基硫代半乳糖苷 ( IPTG) 购于
2001202220 收稿 http :ΠΠwww. chinainfo. gov. cnΠperiodicalΠbjlydxxbΠ 3 国家自然科学基金重点项目 (39730350) 资助 3 3 第一作者 :陆海 ,男 ,1974 年生 ,博士. 主要研究方向 :植物分子生物学. 电话 :010262338063 , Email : hai2lu @263. net 地址 :100083 北京林 业大学生物学院森林生物学实验中心
图 1 融合蛋白的表达 1 为未诱导 2 IPTG诱导表达 M 标准蛋白分子量
FIGURE 1 Expression of recombinant protein
212 表达量与诱导时间的关系 将 37 ℃诱导培养 015 ,1 ,2 ,215 ,3 ,315 ,4 h 收获
的细菌 ,经 SDS2PAGE 分析的结果见图 2. 从图中可 以看出随着诱导时间的延长 ,其表达的总蛋白量逐 渐增加. 但在 215 h ,目的蛋白含量占全菌蛋白含量 之比为最大 ,约为 1617 %. 因此诱导表达 215 h 是最 佳诱导时间.
2
北 京 林 业 大 学 学 报
第 23ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ卷
Promega 公司 ,蛋白质分子量标准购自 Pharmacia 公 司 ,其他试剂均为国产或进口分析纯. 11113 培养基 LB 培养基 :胰蛋白胨 10 g ,酵母提 取物 5 g ,NaCl 10 g 溶于 1 L 蒸馏水中 ,高压灭菌 ,在 40 ℃加入卡拉霉素. 112 方 法 11211 SDS2PAGE 配 5 %的浓缩胶 ,1215 %的分离 胶. 取 1 mL 培养物 ,10 000 g离心 10 min ,沉淀重悬 于 100μL 还原型上样缓冲液中 ,沸水加热 20 min ,上 样 10μL[9] . 11212 ACC 合成酶的诱导表达 将重组质粒转化 大肠杆菌 BL21 (DE3) ,挑选阳性克隆培养 ,37 ℃震 荡培养过夜 ,然后按 1 %接种量于 LB 培养基中培 养 ,当菌液长到 OD600 为 016 时 ,加入 IPTG 至终浓度 2 mmolΠL ,37 ℃诱导 3 h 后收获细菌. 同时收获培养 基并进行浓缩. 11213 表达量与时间的关系测定 将菌液于 37 ℃ 震荡培养过夜 ,然后按 1 %接种量于 LB 培养基中培 养 ,当菌液长到 OD600 为 016 时加入 IPTG 至终浓度 1 mmolΠL ,37 ℃诱导培养 015 ,1 ,2 ,215 ,3 ,315 ,4 h 收获 细菌 ,然后用 SDS2PAGE 分析. 数据每组重复 3 次作 为平行 ,取其平均值. 以下所有数据均如此获得. 11214 表达量与细菌密度关系的测定 将菌液于 37 ℃震荡培养过夜 ,然后按 1 %接种量于 LB 培养基 中培养 ,当菌液长到 OD600 为 011 ,012 ,013 ,014 ,015 , 016 , 017 , 018 , 019 , 110 时 加 入 IPTG 至 终 浓 度 1 mmolΠL ,分别于 37 ℃诱导培养 3 h 收获细菌 ,然后 用 SDS2PAGE 分析. 11215 表达量与 IPTG浓度关系的测定 将菌液于 37 ℃震荡培养过夜 ,然后按 1 %接种量于 LB 培养基 中培养 ,当菌液长到 OD600 为 016 时分别加入 IPTG 至终浓度 012 ×10 - 4 ,012 ×10 - 3 , 012 ×10 - 2 , 0102 , 012 , 014 , 016 , 018 , 110 , 112 , 114 , 116 , 118 , 210 mmolΠL ,于 37 ℃诱导培养 3 h 收获细菌 ,然后用 SDS2 PAGE 分析. 11216 可溶性蛋白与包涵体分析 将细菌培养到 OD600 为 011 , 012 , 013 加 入 IPTG 至 终 浓 度 016 mmolΠL ,分别诱导表达 015 ,210 h ,取 5 mL 细菌离心 收集菌体 ,加入 50 μL TE 缓冲液 ,在冰浴中超声破 碎 ,离心 ,收集沉淀与上清 ,分别进行 SDS2PAGE 分 析.
第 23 卷 第 6 期 2001 年 11 月
北 京 林 业 大 学 学 报 JOURNAL OF BEIJ ING FORESTRY UNIVERSITY
Vol. 23 , No. 6 Nov. , 2001
大肠杆菌 BL21( D E3) 中表达重组蛋白的研究 3
陆 海 3 3 1) 吴 薇1) 曾庆银2) 李 义3) 蒋湘宁 1) 王沙生1)
a ACC 合成酶表达量与诱导时间的 SDS2PAGE 分析 (015 ,1 ,2 ,215 ,3 ,315 ,4 为分别诱导表达 015 ,1 ,2 , 215 ,3 ,315 ,4 h 全菌电泳图 , M 标准蛋白分子量)
时间Πh b ACC 合成酶表达量与诱导时间的关系曲线 图 2 ACC 合成酶表达量与诱导时间的关系 FIGURE 2 The relation of expression and induced time