发酵法生产肌苷酸_IMP_菌种和工艺技术
发酵工程及其应用课件-高二下学期生物人教版选择性必修3
现代发酵工程的大型发酵罐有计算机控制系统，能对温度、 PH、溶解氧、罐压、通气量、搅拌、泡沫和营养进行监测和控 制。还可以进行反馈控制，使发酵全过程处于最佳状态。
1.发酵工程的基本环节
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菌种的选育 扩大培养 培养基的配制 灭菌
发酵过程的影响因素：
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接种
发酵 产品的分离 提纯
（1）啤酒酵母菌：通过微生物培养技术筛选出的优良菌种，在接种前 进行扩大培养，缩短生产周期。
（2）焙烤温度不能过高，防止淀粉酶失活。
（3）蒸煮后的糖浆一定要冷却后才能接种，防止高温杀死酵母菌。
（4）发酵过程中注意控制好温度、pH、通气、发酵时间等。
（5）接种前要对发酵罐进行灭菌，接种时要进行无菌操作，防止杂菌 污染。
微生物分解有机物释放的能量，一部分用于合成ATP，另一 1.温度： 部分散发到培养基中时，会引起发酵温度升高；机械搅拌也会产
生一部分热量引起温度升高。此外，发酵罐壁散热，水分蒸发会
带走部分热量，使发酵温度降低。
通过发酵罐上的温度传感器和控制装置进行监测和调整，用
冷却水进行温度的调节
好氧型微生物：溶解氧要充足；
2.发酵工程的应用
(一) 在食品工业上的应用
啤酒的工业化生产流程 我国是世界上啤酒的生产和消费大国。啤酒是以大麦为主要原料经酵母
菌发酵制成的，其工业化生产流程如下图所示。其中发酵过程分为主发酵
和后发酵两个阶段。酵母菌的繁殖、大部分糖的分解和代谢物的生成都在
主发酵阶段完成。主发酵结束后，发酵液还不适合饮用，要在低温、密闭
1.发酵工程的基本环节
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产氨短杆菌GMA—2802 1.2L罐肌苷发酵试验
产 氨 短 杆 菌 ＧＭ Ａ 一 ２ ０ ２ 罐 肌 苷 发 酵 试 验 ８ ２ １． Ｌ
施 庆 珊 ， 良秋 ， 小 平 ， 玉棠 李 林 邱
（ 东省 微 生 物 研 究所 ， 州 ５ ０ ７ ） 广 广 １ ０ ０
摘 要： 采用诱变得来的产氨短杆 菌 ＧＭＡ一２ ０ １ ２ 自控发酵罐 上进行 ５枇发酵肌 苷试 验 发酵周期 ５ ８ ２ 在 ．Ｌ ４小时， 平均产肌 苷 ２ ．ｇ Ｌ ０ ４／ 。结 果表 明该 菌株 是 一株 具 有 较 多优 良特 性 的 肌 苷 产 生 茵。 关 键词 ： 产氨短杆 菌 发酵 ； 肌苷 中图分粪号 ： ９ ９ ９ Ｑ ３ ・７ 文献标识 码 ： Ａ 肌 苷是有一定医 疗价 值的药物 ， 可用 于措疗 肝脏、 心脏疾病。 白血球 、 血小扳减少 症 中心视 神经膜炎 、 视神经 萎缩等疾病及放 疗造成 的血小扳减少症 ； 此外 ， 可作为 合成 抗病毒药和食品 呈昧 还 剂 的原 料 【 。 ， 我 国一直采用枯草杆菌发酵法 生产 肌苷 业生产产 肌苷可 工 达 ２ Ｌ以上， ０ 但生产成奉较高， 究其原 因， 除了菌种单 一， 发酵设 备和工艺落后外， 采用价 昂的药用酵母柑为发酵原材料， 也是 一个 主要原 因。且添加酵母粉， 培养基 灭菌温 度、 间较难控 制， 时 易造 成污染， 发酵液牯度较大， 增加 后提取一离 子交 换工序 的难 度。由 于产氨短杆菌突变株与枯草杆 菌突变 抹肌苷生物 合成途 径不 同， 其发酵工艺也有所不同， 肌苷发酵是典型的代谢控制发酵， 良生 优 产菌种的选育 固然 是肌苷 发酵 的关键， 但发酵 条件 的控制对肌苷 发酵也有很大的影响。作者采用经多 次诱变筛选得来的产氨短杆 菌突变株 ＧＭＡ一２ ０ （ ｄ Ｇ ａ、 ｉｔｆ Ｖ ３ 、 ｉ、 ｍ ， ８ ２ Ａ ｅ、 ｕ。Ｂｏｉ 、 ｔ Ｒｆ Ｓ ） 在 ｒ 】 】 １２ ．Ｌ自控发酵罐中进行肌苷发酵 ｛验 ， 式 为工业生产提 供可靠 的实 验数据 。Ｇ ＭＡ一２０ ８ ２有望为我 国肌苷发 酵工业提 供另 一生产菌 株， 以备在工业生 产上碰到噬菌体后更换菌株生产Ｈ 。 】 １ 材料与方法 １ １ 菌 株 ： 氨 短 杆 菌 （ ＇ Ｙ ｃｅｉ 州 ａ ｎ ｎ ｒ￣ｇ ｒ ｓ） ． 产 ＢＴ Ｚ ￣ ∞ａ ｒｒＭ ｒ ｒｏｔ ｅｔ ｉ ｅ ＧＭＡ２ ０ －８２由本实验室诱变获得＿】 ３ 。 １ ２ 培 养基 ． １２ １ 斜面种子培养基（ Ｌ ： 萄糖 ２ ， ４ ０ 玉 米浆 ６ 蛋 白 ． ）葡 ０尿 ．， ， 胨 １， ０ 酵母 膏 １ ， ０ 腺瞟畸 ００ ５ 琼脂 ２ 。ｐ ７ ０ ．２ ， ０ Ｈ 。 １ ２ ２ 一级种子培养基（／ ）葡 萄糖 ２ ， ．． ｇＬ ： ０ 尿素 ４ ０ 玉 米浆 ８蛋 ．． ， 白胨 １ ， ０ 酵母膏 １， 嘌呤 ００ ５ｐ ７ ０ ０腺 ２ ，Ｈ 。 １２ ３ 发酵培养 基（ ／ ： ．， ｇＬ） 发酵 糖 １ ０ 玉米 浆 ３ ， 酸铵 １ ， ２， ０硫 ０ 磷 酸二氢钾 ３ 生长素 ６ 硫酸镁 １ 尿素 ５ 分 消）ｐ ． 。 ， ， ， （ ，Ｈ７０ １３ 主 要仪 器 与 设 备 ． １３ １ ７ １型分 光光度 计 ： ．． ２ 上海第三分析仪器厂。 １３ ２ ５ ．． ７ １型紫外 光珊分 光光度计 ； 上海第三 分析 仪器厂。 １３ ３ １２ 自控 发 酵 罐 ： －５ ＫＹ Ｅ． Ｒ ＩＨＩ ．． Ｌ ＭＤ １ ０ＴＯ Ｏ Ｌ． ＭＡ ＵＢ Ｓ
核酸药物(1)
核酸药物(1)
核酸药物(1)
3、双酶法生产肌苷酸和鸟苷酸（I＋G） 呈味核苷酸的主要品种是肌苷酸钠和鸟苷酸钠，
商品名简称为（I＋G），用核酸酶Pl降解RNA可获得 GMP和AMP，其中AMP经脱氨生成IMP。双酶法生 产（I十G）工艺 。
心，在上层液中加入等体积的冷95％乙醇，离心即可
得到纤维状DNA，再用冷乙醇和丙酮洗涤，减压低温
干燥得粗品DNA。粗品DNA溶于适量蒸馏水，加入5
％ 十 二 烷 基 磺 酸 钠 达 1 ／ 10 体积 ， 搅 拌 1 小 时 ， 经
5000r／pm离心1小时，清液中加入NaCl达1mol／L，
再缓慢加入冷95%乙醇，DNA析出，经乙醇、丙酮洗
核酸药物(1)
第二类为自然结构碱基、核苷、核苷酸结构的类 似物或聚合物，这一类核酸类药物是当今人类治疗 病毒、肿瘤、艾滋病的重要手段，也是产生干扰素、 免疫抑制的临床药物。
第二类核酸类药物大部分由自然结构的核酸类物 质进行半合成为结构改造物，近年来发展为化学-酶 合成法。大大提高收率，降低成本。
核酸药物(1)
核酸药物(1)
2、具有生物活性RNA的制备
核酸药物(1)
从核糖核蛋白中分离RNA
(1)乙醇沉淀法：
核糖核蛋白溶于NaHCO3
用含辛醇的 氯仿去蛋白
水相 乙醇
RNA沉淀
(2)盐酸胍法：
核糖核蛋白
2～4盐酸胍 38OC溶解
冷却至0OC
离心 RNA沉淀
核酸药物(1)
（二）DNA的提取与制备
1．工业用DNA的提取
【发酵工程】第四章_发酵工业无菌技术
柠檬酸发酵 （分别处理） a.污染细菌：加大通风，加速产酸，调pH3.0以 下，抑制细菌生长。 b.污染酵母：加入0.025~0.035g/L CuSO4抑制酵 母；通风加大，加速产酸。 c.染黄曲霉：加入另一罐将近发酵成熟的醪液， pH下降，黄曲霉自溶。
d.染青霉菌：在pH很低下能够生长。提前放罐。
2、污染原因分析
主要原因： ① 种子带菌 ② 无菌空气带菌 ③ 设备渗漏 ④ 灭菌不彻底 ⑤ 操作失误 ⑥ 技术管理不善
从污染时间看：早期污染可能与①②④⑤→接 种操作不当有关；后期污染可能与③⑤及中间 补料有关。 从染菌幅度看：各个发酵罐或多数发酵罐染菌， 且所污染的是同一种杂菌，一般是空气系统问 题，若个别罐连续染菌，一般是设备问题。
五、过滤灭菌法
原理：利用过滤方法阻留微生物以达到除菌的 目的。 适宜对象：不耐高温的液体培养基组分和空气 过滤除菌。
六、火焰灭菌法
原理：利用火焰直接杀死微生物以达到除菌的 目的。 优点：方法简单，灭菌彻底。 适宜对象：金属器具（接种针、接种环、接种 铲、小刀及镊子）和玻璃器具灭菌。
第四节
1）一般紫外线杀灭； 2）如有较多的细菌，用石碳酸或土霉素杀灭； 3）如有较多的霉菌，用制霉菌素杀灭； 4）如有噬菌体，用甲醛、双氧水或高锰酸钾等杀灭。
B、过滤空气带菌的防治 从空气的除菌净化流程和设备的设计、过滤介 质的选用和填装，以及过滤介质的灭菌和管理 等方面完善空气净化系统。
1）正确选择采气口 提高采气口的位置或安装前置粗过滤器，提高空压机 进口空气的洁净度。 2）设计合理的空气预处理流程，尽可能减少过滤空气的 含油量和湿度，提高温度，保持过滤介质的干燥状态。
一种二裂酵母发酵产物溶胞物和肌肽组合物的合成工艺及其作用
一种二裂酵母发酵产物溶胞物和肌肽组合物的合成工艺及其作用二裂酵母是一种单细胞真菌，在发酵过程中能够产生多种有益的代谢产物。
其中，发酵产物溶胞物和肌肽组合物被广泛应用于医药、保健品等领域。
本文将介绍一种二裂酵母发酵产物溶胞物和肌肽组合物的合成工艺及其作用。
第一步：选取合适的二裂酵母菌株首先需要选择一个高产的二裂酵母菌株进行发酵。
目前市面上已经有部分二裂酵母菌株进行了优化和改良，产生的代谢产物更为丰富和稳定。
选取适合自己实验室实验条件的菌株，并确定适宜的温度、pH、氧气等条件，以获得最佳的发酵效果。
第二步：发酵过程将选定的二裂酵母菌株接种到合适的培养基中，控制好培养条件，进行发酵。
在发酵过程中，二裂酵母会产生一些活性物质，如溶胞物和肌肽组合物等。
此时需要进行相应的分离和提取工作，以获得所需的产物。
第三步：提取和分离将发酵产物离心分离，分离出固体物和液体物。
液体物中含有产物溶胞物和肌肽组合物等有益生物活性成分。
其后，再经过一系列的纯化、浓缩、净化等步骤，得到纯度更高的产物。
第四步：应用于医药、保健品领域经过以上步骤，获得的二裂酵母产物溶胞物和肌肽组合物等可应用于多个领域。
其中，应用较为广泛的是医药、保健品领域。
由于其含有丰富的活性物质，有很好的抗氧化和抗衰老效果。
能够改善人体免疫力、抗疲劳、促进肌肉生长等作用，因此被众多人们所青睐。
二裂酵母发酵产物溶胞物和肌肽组合物是一种含有丰富活性物质的有益产物。
其合成工艺步骤相对简单，应用范围较广。
通过规范好操作流程和控制好相应的参数，能够获得更为丰富、高效的产物，发挥出其更大的生物学价值。
核酸和核苷类药物
发酵法生产核苷酸
1、发酵法生产肌苷酸（IMP） 肌苷酸钠是一种高效增鲜剂，在谷氨酸钠（味精）中加
2%，鲜度可增长3倍。所以，在味精中添加肌苷酸钠（或 鸟苷酸钠）后成为第二代特鲜味精。
产氨短杆菌嘌呤核苷酸生物合成途径、代谢调控和肌苷酸 发酵机制:
积累IMP旳主要前提：
（1）阻断SAMP合成酶: 即选育缺该酶旳菌株（嘌呤缺陷型），发酵前期提供适量
质。
1、RNA化学水解法制备核苷：
2、发酵法生产核苷
产率高、周期短、控制轻易、产量大。 共同特点： （1）使用磷酸单酯酶活力很强旳枯草芽孢杆菌或短小芽孢杆 菌为诱变出发菌株； （2）具有特定标识旳有变株； （3）发酵培养时需提供限量生长原因。 原菌株： （1）AMP强烈克制PRPP转酰胺酶旳活性，控制总代谢途径； （2）AMP克制SAMP合成酶； （3）GMP克制IMP脱氢酶
第二节 制备旳一般过程与原理
一、RNA旳提取与制备
工业用RNA旳提取
（ 1 ） RNA 及 其 工 业 起 源 ： 从 微 生 物 中 提 取 RNA是工业上最实际和有效旳措施。某些最 常见旳菌体具有丰富旳核酸资源，如酵母、白 地霉、多种抗菌素旳菌丝体——青霉素，制 霉菌素等菌体。
一般在细菌中RNA占5％～25％，在酵母中 占2.7％～15％，在霉菌中占0.7%～28％。
在菌体内RNA含量旳变化受培养基构成影响，其中关键 是铵离子浓度和磷酸盐浓度。培养酵母菌体收率高，易于提 取RNA。
很显然在许多酵母中，早期细胞中旳RNA含量高，其确切 数值取决于碳、氮百分比和培养基构成等。
（2）高RNA含量酵母菌株旳筛选
能够从自然界筛选到RNA含量高旳酵母菌株，也可用诱变 育种旳措施提升酵母菌旳RNA含量。
工业发酵菌种选育
纯种分离的方法有稀释分离法、划线分离法等
现代发酵技术
稀释分离法
现代发酵技术
平皿划线分离法
a.分区划线分离法
b.连续划线分离法
现代发酵技术
菌种筛选（初筛+复筛）
（1）平板筛选（初筛）
从产物角度出发
根据产物的性质有目的地设计培养基来筛选菌种
从形态角度出发
现代发酵技术
抑菌圈法
测试菌苔 含药物滤纸
抑菌圈
琼脂培养基
现代发酵技术
其他鉴定—毒性试验
自然界天然微生物可能产生毒素
据规定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲
霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外，其他微生物作 为与食品工业有关的菌种，均需通过两年以上的毒性试验。
现代发酵技术
2、诱变育种
从野生菌转向变异菌 自然选育转向代谢育种 从诱发基因突变转向基因重组的定向育种。
现代发酵技术
二、菌种选育的主要目的
提高产量
改进质量
增加新品种 改善工艺条件
现代发酵技术
实
例
工业生产菌
不再分泌黄色色素
原始产生菌 青霉素产生菌产黄色色素
土霉素产生菌产大量泡沫
泡沫减少
红霉素产生菌不耐噬菌体
2、工业化菌种的要求
能够利用廉价的原料，大量高效地合成产物 有关合成产物的途径尽可能地简单
遗传性能相对稳定 不易感染它种微生物或噬菌体
产生菌及其产物的毒性低
生产特性要符合工艺要求
现代发酵技术
3、理想的生产菌种
生长繁殖迅速； 产量高； 易培养； 发酵周期短； 耐噬菌体； 纯种。
如氨基酸、核苷酸、多糖、脂类、维生素等。
提高发酵产率与速度的方法
PH值对发酵产率和发酵度的影响，要 选择适宜的PH值
❖ PH.值是酶发挥活性的重要参数之一。 适宜 的PH值有利于提高酶活性，促进反映顺利进 行，改善麦汁成分，提高麦汁中可发酵糖含 量，从而提高麦汁最终发酵度。
在发酵过程中添加外加酶，可以提高 发酵的产率和速度
❖ 外加高转化率糖化酶加强麦汁中糊精及麦芽 四糖的分解，使其降解为可发酵糖，以被酵 母所利用，无疑可大幅度提高啤酒发酵度。
❖ 20世纪40年代初，随着青霉素的发现，抗生素发酵 工业逐渐兴起。由于青霉素产生菌是需氧型的，微 生物学家就在厌氧发酵技术的基础上，成功地引进 了通气搅拌和一整套无菌技术，建立了深层通气发 酵技术。它大大促进了发酵工业的发展，使有机酸、 维生素、激素等都可以用发酵法大规模生产。
发酵工程发展史
❖ 1957年，日本用微生物生产谷氨酸成功，如今20种 氨基酸都可以用发酵法生产。氨基酸发酵工业的发 展，是建立在代谢控制发酵新技术的基础上的。科 学家在深入研究微生物代谢途径的基础上，通过对 微生物进行人工诱变，先得到适合于生产某种产品 的突变类型，再在人工控制的条件下培养，就大量 产生人们所需要的物质。目前，代谢控制发酵技术 已经用于核苷酸、有机酸和部分抗生素等的生产中。
பைடு நூலகம்
原料的状态也直接影响着发酵产率和 速度
❖ 原料的状态可分为固态、液态、气态、颗粒、粉末 等等。例如：利用麦芽来制作啤酒，原料的粉碎， 特别是麦芽粉碎是否适宜，不仅关系到原料糖化室 浸出物收得率，而且影响到制得麦汁组成成分，特 别是麦汁中可发酵糖的含量，影响到麦汁色泽与口 味。麦芽粉碎过细，虽然有利于糖化，获得较高可 发酵糖，较高最终发酵度，但难以形成理想过滤层， 麦汁过滤困难，过滤时间长，原料利用率低。但原 料粉碎过粗，过滤层形成较理想，但糖化难以完全， 麦汁收得率同样不理想，麦汁中可发酵糖含量少， 麦汁最终发酵度会受到影响。
微生物发酵制药
微生物发酵制药目录123微生物药物简述新型微生物发酵技术微生物药物应用一定义：微生物药物简述微生物在其生命活动过程中产生的生理活性物质及其衍生物，包括抗生素、维生素、氨基酸、核苷酸、酶、激素、酶抑制剂、免疫调节剂等一类化学物质的总称，是人类控制感染等疾病，保障身体健康，以及用来防治动、植物病害的重要药物。
分类抗生素类药物维生素类药物氨基酸类药物核酸类药物酶与辅酶类药物酶抑制剂免疫调节剂甾体类激素1.抗生素类抗生素类是一类由微生物产生的在低浓度下具有抑制或杀死微生物作用的化学物质。
2.维生素类目前采用微生物技术生产的维生素类药物及其中间体有维生素B2(核黄素)、维生素B12(氰钴胺素)、2-酮基-L古龙酸(维生素C原料)、β-胡萝卜素(维生素A前体)、麦角甾醇(维生素D2前体)等。
3.氨基酸类药物目前氨基酸主要用于生产大输液及口服液。
精氨酸、谷氨酸钠用于肝性昏迷的临床抢救，解除氨毒；L-谷氨酰胺用于治疗消化道溃疡；L-组氨酸为治疗消化道溃疡辅助药等。
目前大部分氨基酸可用发酵法生产。
4.核酸类核酸类物质和氨基酸等类似，是微生物的初级代谢产物，它们在生物体内收到严密的调节和控制，因此，用于工业生产的产生菌都是经过选育的突变株。
用微生物发酵技术生产的核苷酸类药物及其中间体有肌苷酸、肌苷、5‘-腺苷酸(AMP)、三磷酸腺苷(ATP)、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、辅酶A(CoA)、辅酶I(CoI)、二磷酸胞苷(CDP)、胆碱等。
5.酶与辅酶类药物L-天冬酰胺酶、链激酶；NAD、NADP、CoA6.酶抑制剂克拉维酸、洛伐他汀7.免疫调节剂免疫增强剂、免疫抑制剂8.甾体类激素可的松、地塞米松二1新型微生物发酵技术发酵工程23基因工程菌微生物药物作用机制一、发酵工程概念：采用现代工程技术手段，利用微生物的某些特定功能，为人类生产有用的产品，或者直接把微生物应用于工业生产的一种新技术发酵工程的内容菌种的选育培养基的配制灭菌扩大培养和接种发酵过程产品的分离提纯等菌种一级种子摇瓶扩大培养二级种子罐培养原料发酵培养基配制灭菌发酵生产代谢产物分离微生物工业发酵过程简图发酵过程的影响因素菌体浓度培养基的影响，如碳源、氮源、微量元素等温度影响PH溶解氧发酵工程制药特点菌种是根本理论产量存在“生物学变量”常温常压下反应，安全，条件简单纯种培养，防污染课制备复杂高分子化合物分子水平，定向发酵，组合生物合成等发酵工业成本低二、基因工程菌将目的基因导入细菌体内使其表达，产生所需要的蛋白的细菌称为基因工程菌，如：大肠杆菌。
发酵工程(1-13章)
《发酵工程》Fermentation engineering 授课教师：张书祥（Email：zhangshux578@）第一章绪论第一节发酵工程的定义、特点、内容第二节发酵工程的发展历史第三节发酵工业的应用第四节发酵工程的发展趋势第一节发酵工程的定义、特点、内容1、定义1.1发酵工程：利用微生物的性状和机能，通过现代化工程技术，生产人们所需要产品的过程。
如抗生素、酒类、有机酸、基因工程药物等的生产。
发酵过程是以微生物反应为核心的，因此，发酵工程又被称为微生物工程。
1.2生物工程：生命科学应用于产业方面，称为生物工程学。
也就是利用生物体（生物作用剂：微生物、动物细胞、植物细胞等）的机能，通过现代化工程技术，生产人们所需要产品的过程。
生物工程包括：发酵工程、酶工程、基因工程、细胞工程。
发酵工程与生物工程的关系发酵工程是生物工程的重要组成部分，在生物工程中处于中心地位。
无论是从微生物得到酶或用基因工程菌获得产品都必须依赖发酵工程技术。
发酵工程的发展直接影响生物工程的进一步发展。
2、发酵工业的一般特点：2.1生产所用原料通常以淀粉、糖蜜等碳水化合物（可再生资源）为主，辅料包括一定的无机或有机氮源和少量无机盐。
2.2微生物生化反应过程能通过单一微生物代谢活动完成，因而产品在发酵设备中一次合成。
2.3微生物能利用简单的物质合成复杂的高分子化合物。
2.4由于生命体特有的反应机制，微生物能高度选择地在复杂化合物的特定部位进行氧化、还原、官能团导入等转化反应，从而获得某些具有一定经济价值的物质。
发酵工程与化学工程、生化工程的比较工业发酵的过程是依靠微生物细胞生命活动获得目的产物的过程，从根本上区别于化学合成工业和生化工业。
在工业化学过程中没有生物活性物质参与催化。
工业生化过程属于由酶催化的体外酶反应过程，酶具有生物活性。
当酶失活、辅酶耗尽，过程就停止了。
第三节、发酵工业的应用：发酵工程技术已给人类社会生产力的发展带来了巨大的潜力，解决了人类所面临的食品与营养、健康与环境、资源与能源等重大问题。