发酵菌种的制备
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发酵工程菌种的来源及选育
细菌分离：以乳酸菌为例
放线菌的分离
(一)采样
菜园土或林地土
土壤中放线菌最丰富，品种齐全。 可以筛选新的放线菌。
从堆肥或过热的材料中如干 草或蔗渣中可分离到大量的嗜热 放线菌，从淡水和海洋环境中分 离到嗜碱性的和嗜酸性的菌种。
自然风干，备用
气生孢子能耐干燥，耐湿热能力 高于营养体，室温保存20天， 放线菌的数量和组成变化不大， 细菌大部分死亡。
(二)生态学参数及培养基的组成原则
1、加入培养基中的天然提取物种类和用量、环境生物物 理学参数以及用于平板涂布分离样本的溶剂都会影响 实验中所要分离的细菌的数量和种类。
2、就分离培养基的组成而言，部分培养基中必须含有 10-50%的天然提取物。加入培养基中的天然提取物， 部分培养基中则应含有多种碳、氮源，如几丁质、纤 维素或果胶。
随机分离原理与技术
从产物入手，通过设计高产培养基和建立快速 灵敏专一的筛选方法，从随机分离的菌落中筛 选出所需的目的菌。
技术关键：产物合成条件的选择与控制及相应 筛选方法的确定。
随机分离技术举例
药理活性化合物产生菌的筛选
药理活性化合物是指能抑制人类代谢中某一 个关键酶的微生物产物即酶抑制剂，从而达到 治疗的目的。
样本采集时所需的工具通常有无菌刮铲、土样采集器、 镊子、解剖刀、手套、无菌小塑料袋和塑料瓶等。
采样的注意事项
1、采样时应尽可能保持相对无菌； 2、所采集的样本必须具有某种代表性； 3、采好的样必须完整地标上样本的种类及采集日期、
地点以及采集地点的地理、生态参数等； 4、应充分考虑采样的季节性和时间因素，因为真正的
（2）化学法
通过培养基中添加某些化学成分来增加微生物的数量。 如：用添加CaCO3稳定培养基的PH来分离嗜碱性的放线菌。
发酵工艺 第2章 发酵工业微生物菌种制备原理和技术
微生物菌种保藏机构名称和缩写
中国 缩写
ACCC
SH IA CCGMC AS-IV
CAF
IFFI
ID IV CIVBP
名称 中国农业微生物菌种保藏管理中 心 上海市农业科学院食用菌研究所 中国医学科学院抗菌素研究所 普通微生物菌种保藏管理中心 中国科学院武汉病毒研究所 中国林业科学院菌种保藏管理中 心 轻工业部食品发酵工业科学研究 所 中国医学科学院皮肤病研究所 中国医学科学院病毒研究所 中国兽医药品监察所
最常用的工业微生物
放线菌
– 链霉菌属 – 小单孢菌属 – 地中海诺卡氏菌 – 米苏里游动放线菌
藻类
藻类包括数种不同类以光 合作用产生能量的生物。 它们一般被认为是简单的 植物，并且一些藻类与比 较高等的植物有关。虽然 其它藻类看似从蓝绿藻得 到光合作用的能力，但是 在演化上有独立的分支。 所有藻类缺乏真的根、茎、 叶和其它可在高等植物上 发现的组织构造。藻类与 细菌和原生动物不同之处， 是藻类产生能量的方式为 光合自营性 ；琼脂（棕 藻）
国外重要菌种保藏机构
1、ATCC：美国模式培养物（菌）保藏中心 2、NRRL：美国农业部北方开发利用研究部 3、CSH：美国冷泉港研究所 4、IAM：日本东京大学应用微生物研究所 5、IFO：日本发酵研究所（大阪） 6、NCTC：英国国立标准菌种收藏所 7、CBS：荷兰真菌中心保藏所
三、生产中常用菌种的分离、选 育（screening ）
（一）微生物菌种的分离 四步骤： 样品采集 增值培养 纯种分离 生产性能的测定
1.施加选择压力分离法
施加选择性压力分离法
主要是利用不同种类的微生物其生长繁殖对环境和营 养的要求不同，如温度、pH、渗透压、氧气、碳源、 氮源等，人为控制这些条件，使之利于某类或某种微 生物生长，而不利于其他种类微生物的生存，以达到 使目的菌种占优势．而得以快速分离纯化的目的。如 可以控制培养时的氧，可将好氧微生物和厌氧微生物 分开；通过控制温度，可将嗜热微生物和非嗜热微生 物分开；控制pH，可将嗜酸、嗜碱微生物分离等。在 分离培养基中也可以加入不同的抗生素或试剂来增加 选择性。如在分离放线菌和细菌时，可加入抗真菌抗 生素；分离真菌时，可加入抗细菌药物。
乳酸菌发酵菌种制备的注意事项
①首先将乳酸菌的浓缩培养基加适量的水煮沸5分钟以上（大家记住一定要煮沸5分钟以上），杀灭其中所有的微生物。
如果不到5分钟，没有煮沸，那么做出来的杂菌可能就比较多。
①补充无菌水到330kg，或者做直接的产品，那你就直接补到990kg。
①加入菌种开始培养，培养的过程把培养液的温度保持在35-40①，建议直接在温度控制开关上把它调整到38①，这是最合适的。
④在38①恒温条件下培养36-48个小时，基本上可以完成培养。
如果你要做稀释的，那在这个时候再加入660公斤无菌水就可成为乳酸菌的成品，灌装或者直接使用。
发酵菌的制作方法
发酵菌的制作方法
发酵菌（也称为酵母菌或发酵剂）可以通过以下步骤来制作：
1. 准备食材：选用高质量的发酵菌菌种，如干酵母或活性酵母。
同时准备适量的营养基质，如糖、面粉、水等。
2. 培养基的制备：按照菌种所需的营养要求制备培养基。
一般的培养基可以使用面粉、水、糖混合而成。
具体的比例可以参考菌种的使用说明。
3. 混合菌种和培养基：将选用的发酵菌菌种加入到制备好的培养基中。
4. 培养发酵菌：将混合好的菌种和培养基放入一个温度适宜的环境，一般在28-32摄氏度之间。
同时保持适当的湿度和通风条件。
5. 观察生长情况：注意观察发酵菌的生长情况，包括菌体的形态、色泽和菌液的气味等。
6. 收获发酵菌：根据需要，可以在发酵菌达到一定的生长量后进行收获。
可以将生长好的发酵菌过滤出来，或者直接使用整体菌体。
以上是制作发酵菌的一般步骤，具体的制作方法可能会因不同的发酵菌种和用途而有所不同。
在进行发酵菌的制作过程中，应注意卫生和操作的规范性，以确保
发酵菌的质量和安全性。
另外，特殊的发酵菌种或应用需要专门的培养条件和方法，请根据具体的要求进行操作。
第二章发酵工业微生物菌种制备原理和技术-PPT
筛选一些具有特殊性质得微生物时,需根据该微生物独特 得生理特性到相应得地点采样(极端环境)。如:
高温酶产生菌:温度较高得南方,或温泉、火山爆发处 及北方得堆肥中采集样品;
低温酶产生菌:寒冷得地方,如南北极地区、冰窖、深 海中采样;
耐压菌:海洋底部采样。 耐高渗透压酵母菌:通常到甜果、蜜饯或甘蔗渣堆积处
菌种纯化就是指在特定环境中只让1种来自同一祖先得微生物 群体生存得技术。
菌株分离、筛选虽为两个环节,但却不能绝然分开,因为分离中 得一些措施本身就具有筛选作用。工业微生物产生菌得筛选 一般包括两大部分:一就是从自然界分离所需要得菌株,二就是 把分离到得野生型菌株进一步纯化并进行代谢产物鉴别。
3、分离思路
从自然界筛选
B、采样季节:以温度适中,雨量不多得秋初为好。
C、采土方式:在选好适当地点后,用小铲子除去表土,取 离地面5-15cm处得土约10g,盛入清洁得牛皮纸袋或塑 料袋中,扎好,标记,记录采样时间、地点、环境条件等, 以备查考。为了使土样中微生物得数量与类型尽少变 化,宜将样品逐步分批寄回,以便及时分离。
别出来。
抗生素筛选
6、生产性能得测定
由于纯种分离后,得到得菌株数量非常大,如果对每 一菌株都作全面或精确得性能测定,工作量十分巨大, 而且就是不必要得。一般采用两步法,即初筛与复筛, 经过多次重复筛选,直到获得1～3株较好得菌株,供 发酵条件得摸索与生产试验,进而作为育种得出发菌 株。这种直接从自然界分离得到得菌株称为野生型 菌株,以区别于用人工育种方法得到得变异菌株(亦 称突变株)。
采样。如有人曾在花蜜中分离到一株能耐30%高糖得耐 高渗透压得酵母菌。
(3)含微生物样品得富集培养(优化得过程) ----施加选择性压力分离法
青霉素的发酵生产流程
青霉素的发酵生产流程一、菌种选育与保存青霉素的生产首先始于优良菌种的选育。
选育出的高产、稳定且遗传性能好的菌种是青霉素生产的基础。
一旦获得理想菌种，必须妥善保存以防退化。
常用的保存方法包括冷冻干燥、斜面低温保藏和砂土管保藏等。
二、生产菌活化在进行大规模发酵生产前，需要对保存的菌种进行活化。
活化过程通常在适宜的培养基和温度下进行，目的是使菌种从休眠状态复苏，恢复其生理活性。
三、孢子制备活化后的菌种进一步制备成孢子悬液。
孢子作为青霉素发酵的种子，其质量直接影响发酵效果。
孢子制备过程中要注意控制营养条件、温度和湿度等，以获得数量多、质量好的孢子。
四、种子制备种子制备是将孢子接入适宜的培养基中，进行一定时间的培养，使其繁殖成足够数量的菌丝体。
这一过程中要严格控制培养条件，如温度、pH值、通气量等，以确保菌丝体健康、生长迅速。
五、发酵培养发酵培养是青霉素生产的核心环节。
将种子接入发酵罐中，在严格控制的培养条件下进行大规模的培养。
通过调节培养基成分、温度、pH值、溶氧量等参数，促进青霉素的合成和积累。
六、发酵液预处理发酵结束后，发酵液需要进行预处理，以去除其中的杂质和固体颗粒，为后续的萃取与分离创造条件。
预处理通常包括离心、过滤、沉淀等步骤。
七、萃取与分离萃取与分离是将青霉素从发酵液中提取出来的关键步骤。
常用的萃取剂有醋酸丁酯、正丁醇等。
通过萃取，青霉素可以被转移到有机相中，再经过分离纯化得到较为纯净的青霉素。
八、脱色与结晶经过萃取与分离后得到的青霉素溶液需要进行脱色处理，以去除其中的有色杂质。
脱色后，再通过结晶操作，使青霉素以晶体的形式析出，便于后续的干燥和包装。
九、成品检验与包装最后，对结晶得到的青霉素进行质量检验，包括纯度、活性等指标。
合格的青霉素产品进行干燥、粉碎后，进行包装。
包装材料要求无菌、防潮、避光，以保证青霉素在存储和运输过程中的稳定性和有效性。
整个青霉素的发酵生产流程需要严格控制各个环节的条件和操作，以确保最终产品的质量和产量。
发酵与酿造技术2.发酵菌种(曲)的制备
γ射线
激光
8-AG
亚硝基甲基脲(NMU)
亚硝基乙基脲(NEU) 亚硝酸(NA) 氮芥(NM) 4-硝基喹啉 1-氧化物 乙烯亚胺(EI) 羟胺
2.诱变剂选择与使用
2.1诱变剂的选择对野生型菌株，单一诱变因素有时也能 取得好的效果，对老菌种重复使用单一诱变因素，突变 的效果不高，可利用复合因素来扩大诱变幅度、提高诱 变效果。 2.2 诱变剂的剂量选择 变异率取决于诱变剂量，而变异率与致死率之间有一定 关系，因此可以用致死率作为选择适宜剂量的依据。采 用致死率高的剂量，如90—99.9%致死率的剂量，虽然负 变株多，但变异幅度大；采用中等剂量如 75 － 80%或更 低的剂量，不会导致太多的负变株和形态突变株，出现 高产菌株的几率高，而且低剂量诱变剂可能更利于高产 菌株的遗传稳定。
自然选育操作步骤：
一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。
单细胞(孢子)悬液的制备
平板分离
挑选单菌落(注意形态的观察) 发酵试验
二、诱变育种
用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变进行 的筛选，称为诱变育种
诱变育种的理论基础是基因突变，即DNA分子结构中某一 部位发生变化。由各种物理、化学、生物的因素人工诱发基因 突变，引起微生物的遗传变异，可使菌种发生突变的频率和变 异的幅度得到提高，从而使筛选获得优良特性的变异菌株的几 率得到提高。但是诱发突变缺乏定向性，因此必须与大量的筛 选工作结合才能收到良好效果。
2.诱变剂选择与使用
化学诱变剂 物理 诱变剂
紫外线 快中子 X射线 碱基类似物 2-氨基嘌呤 5-溴尿嘧啶 8-氮鸟嘌呤 与碱基反应的物质 硫酸二乙酯(DES) 甲基磺酸乙酯(EMS) 亚硝基胍(NTG)
生物 DNA分子中插入或 缺失一个或几个碱 诱变剂 基物质
第二章发酵工业微生物菌种ppt课件
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(1) 曲霉属(Asprgillus)：曲霉种类繁多、分布 广泛，工业上利用曲霉生产各种酶制剂和有机 (2) 青霉属（Penicillium）：j既是使果实腐 酸。如米曲霉（ Asp. oryzae）用于酿酒和L败和实物变坏的有害菌，又是青霉素后葡萄 乳酸生产。制酱油用的酱油曲霉以及制造柠檬 糖酸的产生菌。 酸、草酸、葡萄糖酸和糖化酶、酸性蛋白酶、 (3) 根霉属（Rhizopus）：用于米酒、黄 果胶酶、单宁酶等的黑曲霉 (Asp. niger)。 酒生产。此外，广泛用作淀粉糖化菌、有机 酸发酵以及甾体转化等许多方面。 (4) 毛霉属（Mucor）：产生蛋白酶，有分 解大豆蛋白的能力。腐乳、酱油、转化甾族 化合物。土曲霉：衣康酸
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连续培养菌种的筛选 比生长速率(u):每克菌体每小时增长的 菌体量.u=1/XdX/dt.
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比生长速率u
A B
r
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基质浓度
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限 制 性 基 质
当进行流加时基质浓度<r 时,A菌先被洗出; 当进行流加时基质浓度>r 时,,B菌先被洗出;
培养液
固体培养法
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2.随机分离方法 （1）.抗生素产生菌筛选 试验菌的灵敏性，以及与抗生素有关的酶、 酶的抑制剂（例如棒酸）、激活剂、抗体 等建立起来的高灵敏度、专一的检测技术。 （2）.药理活性化合物的筛选 （3）.生长因子产生菌的筛选 （4）.多糖生产菌的筛选 （5）.免疫激活剂产生菌的分离
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(3) 乳酸菌：由糖类生成乳酸的一类细菌总称为乳 酸菌，有乳链球菌和乳酸杆菌之分，主要用来制 造乳制品。凡发酵产物中只有乳酸者，称为同型 乳酸发酵；凡发酵产物中除乳酸外还有乙酸等和 CO2者，称为异型乳酸发酵。肠膜状明串珠菌属 于乳酸菌族，是制药工业生产有旋糖酐的重要菌。 (4) 大肠杆菌：工业上利用大肠杆菌的谷氨酸 脱羧酶，进行谷氨酸定量分析。还可以利用 大肠杆菌制取天冬氨酸、苏氨酸和缬氨酸等。 医药方面用它制造治疗白血症的天冬酰胺酶。 另外，在研究细菌遗传变异方面，以及构建 基因工程菌时，大肠杆菌是理想的研究材料。
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1.2 发酵工业对菌种的要求
1) 能在廉价原料制成的培养基上迅速生长，并生成所需要的代谢产物，且 产量高； 2）培养条件易于控制； 3）生长速度快，发酵周期短； 4）满足代谢控制的要求； 5）抗噬菌体和杂菌的能力强； 6）遗传性状稳定，菌种不易变异退化； 7）在发酵过程中产生的气泡要少，这对提高装料系数、提高单罐产量、 降低成本有重要意义； 8）对需要添加的前体物质有耐受能力，并且不能将这些前体作为一般碳 源利用； 9）不是病原菌，同时在系统发育上与病原菌无关，不产生任何有害的生 物活性物质和毒素，以保证安全。
1.3 工业生产常用的微生物菌种
已工业化产品生产菌的介绍
(二) 真核细胞表达系统
酵母(既是微生物又是真核细胞)
生长迅速，营养要求不高，易培养； 安全性好； 比哺乳动物细胞操作简单； 具有一定的修饰蛋白的能力。
1.3 工业生产常用的微生物菌种
已工业化产品生产菌的介绍
中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）表达系统
第一章 发酵工程总论
第二章 发酵设备
第三章 发酵工业原料及其处理
发
第四章 发酵工业灭菌
酵
第五章 发酵菌种的制备
工
第六章 发酵工业放大
程
第七章 微生 发酵过程工艺控制
第十章 发酵染菌及防治
第十一章 发酵工业废物、废水处理和资源化技术
第十二章 展望
第五章 发酵菌种的制备
→ 菌种的鉴定 → 生产性能测定
目的：高效地获取一株高产目的产物的微生物
复合酶系
问题：如何使样品中所含微生物的可能性大
如何在后续的复操合作中菌使系这种可能性实现
1.4 工业微生物菌种的分离
二、采样时要注意的问题
气候、水分、空气 来源要广 结合产品的特点 标签：地点、时间、气候等
1.4 工业微生物菌种的分离
1.3 工业生产常用的微生物菌种
二、氨基酸生产有关的微生物
AK:天冬氨酸激酶 HD:高丝氨酸脱氢酶 HT:高丝氨酸转乙酰酶
黄色短杆菌中赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸和异亮氨酸 的合成调节机制
1.3 工业生产常用的微生物菌种
二、氨基酸生产有关的微生物
氨基酸生产菌的要求： 代谢途径比较清楚，简单
谷氨酸发酵的菌种： 棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属或小 杆菌属的棒型细菌
其他氨基酸生产菌： 常规菌种一般也是以谷氨酸生产菌 选育而成；工程菌，大肠杆菌，枯 草芽孢杆菌
1.3 工业生产常用的微生物菌种
已工业化产品生产菌的介绍
三、食品酶制剂生产有关的微生物
开发一个新酶，都要经过一系列研究的毒理试验。 关于食品用酶，美国需要得到FDA的批准。目前已同意 使用的仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。
1 发酵工业微生物菌种的选育 2 工业微生物种子的扩大培养 3 种子培养基及其制备
http://211.84.144.22/jing/C76/zcr-1.htm
第五章 发酵菌种的制备
1 发酵工业微生物菌种的选育
1.1 工业微生物的特点 1.2 发酵工业对菌种的要求 1.3 工业生产常用的微生物菌种 1.4 工业微生物菌种的分离 1.5 发酵高产菌种的选育 1.6 菌种的退化与保藏
微生物（包括动、植物细胞）几乎可以生产 我们所需的一切产品，但是涉及到工业化生 产对于某一种特定的产品，只有特定的微生 物才具有大量表达的潜力。
例：
礼来(Eli lilly),花了10年的时间从40万株微 生物中，发现了三种有潜力的新抗生素。
1.4 工业微生物菌种的分离
一、菌种分离的一般过程
样品采集 → 预处理 → 增殖培养 → 纯培养
三、目的微生物富集的一些基本方法
富集的目的： 让目的微生物在种群中占优势，使筛选变 得可能。
富集的三种方案： 定向培养:采用特定的有利于目的微生物富集的 条件，进行培养。 当不可能采用定向培养时，则可设计在一个分 类学中考虑， 不能提供任何有助于筛选产生菌的信息，这 时只能通过随机分离的办法
1 发酵工业微生物菌种的选育
1.1 工业微生物的特点
一个现代化的发酵工业必须具有优良的菌种、 合适的工艺和先进的设备、严格的检测与控制，其 中菌种是主体,其他则是为了充分发挥菌种的优良 性能而考虑和设计的。
能用于发酵生产的微生物即为工业微生物，它 们具有个体小、种类多、繁殖快、分布广、代谢能 力强、易变异改造等特点。
1.3 工业生产常用的微生物菌种
地球上的微生物资源非常丰富， 目前已发现的仅占其总数的1%~5%， 而在工业生产中被利用的仅有数百种， 分属于细菌、酵母菌、霉菌、放线菌、 担子菌、藻类。
1.3 工业生产常用的微生物菌种
已工业化产品生产菌的介绍
一、抗生素生产有关的微生物
抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的代谢， 目前发现的生物来源如下：
1.4 工业微生物菌种的分离
三、目的微生物富集的一些基本方法
定向培养的方法
α—淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢杆 菌和地衣牙孢杆菌
1.3 工业生产常用的微生物菌种
已工业化产品生产菌的介绍
三、常用的基因表达系统
(一)原核生物：大肠杆菌(1977年Boyer)、枯草牙胞杆菌 沙门氏菌
生长迅速、蛋白产量高; 表达蛋白的纯化、分离及分析快速； 外源基因的导入相对容易； 已建立了整套表达理论及技术。
放线菌（链霉素 四环素；红霉素 等）
真菌（青霉素、头孢等） 一些产芽孢的细菌
植物或动物来源
1.3 工业生产常用的微生物菌种
已工业化产品生产菌的介绍
二、氨基酸生产有关的微生物
20世纪50-60年代以氨基酸发酵为代表的代谢控制发 酵，是发酵工业发展历史上的一个转折点：
代谢控制发酵：用人工诱变的方法，有意识地改变微生 物的代谢途径，最大限度地积累产物，这种发酵形象地 称为代谢控制发酵，最早在氨基酸发酵中得到成功应用。
具有准确的转录后修饰功能； 具有产物胞外分泌功能，便于下游产物分离纯化； 具有重组基因的高效扩增和表达能力； 具有贴壁生长特性，也可进行悬浮生长； CHO很少分泌自身的内源蛋白。
1.3 工业生产常用的微生物菌种
已工业化产品生产菌的介绍
问题： 生产抗生素的微生物能不能用于生产氨基酸？