体外原代星形胶质细胞分离培养方法的优化
大鼠肝星状细胞分离与培养方法的实验
青链霉素
防止细菌污染。
EDTA
用于螯合金属离子，防止细胞 粘附。
02
实验操作流程
大鼠肝星状细胞分离
准备器材
麻醉大鼠
包括手术器械、注射器、离心管、细胞筛 等。
使用戊巴比妥钠麻醉大鼠，并将其固定在 操作台上。
解剖大鼠
细胞分离
切开大鼠腹腔，暴露肝脏，并小心分离出 肝组织。
将肝组织剪成小块，放入含有消化酶的离 心管中，震荡孵育，然后离心，弃去上清 液，获得肝星状细胞。
大鼠肝星状细胞分离与培养方法的 实验
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目 录
• 实验准备 • 实验操作流程 • 实验数据分析 • 实验结论与讨论 • 参考文献与致谢
01
实验准备
实验材料准备
大鼠
健康雄性SD大鼠，体重100-150g。
细胞培养瓶
T25或T75培养瓶，用于细胞培养。
解剖器械
手术刀、手术剪、镊子、血管钳等。
细胞周期分析
通过分析细胞的周期分布，可以了解细胞增殖和凋亡的平衡状态。可以使用 DNA含量测定、细胞计数等方法进行测定。
04
实验结论与讨论
结论概述
实验成功分离出大鼠解析
采用酶消化和贴壁培养方法，成功分离出高纯度的肝星状细胞。
细胞形态完整，活性良好，可用于后续实验。
参考文献2
作者2, 等. (2015). 改进的 大鼠肝星状细胞分离与培 养方法. 生物医学工程学 杂志, 32(1), 120-126.
参考文献3
作者3, 等. (2018). 大鼠肝 星状细胞的体外培养及药 物干预研究. 中国实验动 物学报, 26(5), 635-641.
致谢
感谢实验室的老师和同学们在 实验设计和操作过程中的指导 和帮助。
提高小鼠原代肝星状细胞获得率及纯度的分离方法
《中国组织工程研究》 Chinese Journal of Tissue Engineering Research文章编号:2095-4344(2018)21-03376-053376 www.CRTER .org·研究原著·徐莹，女，1989年生，宁夏回族自治区银川市人，汉族，上海中药大学在读博士，主要从事慢性肝病的研究。
通讯作者：刘平，博士，教授，上海中医药大学，上海中医药大学附属曙光医院，上海市中医药研究院肝病研究所，肝肾疾病病证教育部重点实验室，上海中医临床重点实验室，上海市 201203；上海中医药大学，上海高校中医内科学 E -研究院，上海市 201203通讯作者：刘伟，博士，助理研究员，上海中医药大学，上海中医药大学附属曙光医院，上海市中医药研究院肝病研究所，肝肾疾病病证教育部重点实验室，上海中医临床重点实验室，上海市 201203中图分类号:R394.2 文献标识码:B稿件接受：2018-03-13Xu Ying, Doctorate candidate, Institute of Liver Diseases, Shuguang Hospital affiliated to Shanghai University ofTraditional Chinese Medicine, Key Laboratory of Liver and Kidney Disease (Ministry of Education), Shanghai Key Laboratory of Traditional Chinese Clinical Medicine, Shanghai 201203, ChinaCorresponding author: Liu Ping, M.D., Professor, Institute of Liver Diseases, Shuguang Hospital affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Key Laboratory of Liver and Kidney Disease (Ministry of Education), Shanghai Key Laboratory of Traditional Chinese Clinical Medicine, Shanghai 201203, China; E-Institute of Traditional Chinese Internal Medicine, Shanghai Municipal Education Commission, Shanghai University of TraditionalChinese Medicine, Shanghai 201203, ChinaCorresponding author: Liu Wei, M.D., Assistant researcher, Institute of Liver Diseases, Shuguang Hospital affiliated to Shanghai University of Traditional ChineseMedicine, Key Laboratory of Liver and Kidney Disease (Ministry of Education),Shanghai Key Laboratory of Traditional Chinese Clinical Medicine, Shanghai 201203, China提高小鼠原代肝星状细胞获得率及纯度的分离方法徐 莹1，张定棋1，2，慕永平1，陈佳美1，王清兰2，平 键1，刘 伟1，刘 平1，2 (1上海中医药大学，上海中医药大学附属曙光医院，上海市中医药研究院肝病研究所，肝肾疾病病证教育部重点实验室，上海中医临床重点实验室，上海市 201203；2上海中医药大学，上海高校中医内科学 E -研究院，上海市 201203)DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.0903 ORCID: 0000-0003-2633-3295(徐莹)文章快速阅读：文题释义：肝星状细胞：又称贮脂细胞，是肝脏中的一种间质细胞，位于Disse 间隙，胞体主要呈卵圆形或不规则形，胞质内富含类维生素A 脂滴，正常肝脏中肝星状细胞的数目很少，与肝细胞数量之比为1∶20，其总体积占肝体积的1.4%。
大鼠大脑皮层星形胶质细胞原代培养及传代
大鼠大脑皮层星形胶质细胞原代培养及传代、试剂Poly-L-lysine (Sigma,P2636)DMEM (Invitrogen,11995-065)二、器械手术器械：眼科剪x2、眼科镊直、弯各x2、显微镊x2 （金钟，WA3050）、显微剪x13ml 移液管( Biologix, 30-0138A1)南京军区总院神经内科实验室 许丽丽 2012-12-011) 2) 3) FBS (Invitroge,10099-141)4) HBSS, no Calcium, no Magnesium (Invitrogen, 14170-112)5) 0.25% Trypsin-EDTA ( Invitrogen, 25200-056)6) DPBS (HyClone ，SH30028.01B )7) dd H 2O8) 75％酒精1) 2) 100 ml 小烧杯3) 200 目不锈钢筛4) 细胞计数器（求精）5) 50ml 离心管( Corning ， 430828)、 15ml 离心管( Corning ， 430790)6) 25ml 培养瓶( Corning ， 430639)或 75ml 培养瓶( Corning ， 430641)7) 100ml 玻璃瓶（蜀牛）8) 直径为 60mm 的培养皿 LabServ,310109010)9)10) 过滤器( Millex-GP, SLGP033R)B11) 注射器：50ml、5ml 各112) Pipette and pipette tips13) 冰袋、手套、口罩Day 11、消毒1.1 将解剖器械、枪头高温高压消毒15 分钟，消毒结束后放入烘箱中烘干待第二天使用。
1.2 打开操作台紫外线灯消毒30 分钟。
2、包被培养板2.1 戴手套，用酒精棉球擦拭操作台、移液枪，点燃酒精灯。
2.2取PLL用DPBS将其稀释至100 pg/ml 。
2.3以PLL包被培养瓶，量以覆盖培养瓶底面为宜。
离体脊髓星形胶质细胞的纯化与鉴定
离体脊髓星形胶质细胞的纯化与鉴定【摘要】目的探讨新生大鼠脊髓星形胶质细胞的分离、培育与传代及纯化方式，鉴定其培育纯度。
方式分离、培育新生大鼠脊髓星形胶质细胞，用换液时暴露结合旋转法加以纯化，酶消化法传代后进行免疫组化鉴定，并染核计数星形胶质细胞的纯度。
结果星形胶质细胞贴壁快，多在12 h内，3 d后数量显著增加；免疫细胞化学染色显示，NF200抗体染色为阴性，提示培育盖片中不含神经元；GFAP阳性染色细胞高达%。
结论换液时短暂暴露结合恒温旋转法可纯化取得高纯度的星形胶质细胞，是一种简单、高效的星形胶质细胞纯化方式。
【关键词】星形胶质细胞；神经微丝蛋白；胶质纤维酸性蛋白Purification and identification of astrocyte of spinal cord in vitroAbstract: Objective To explore the method of isolation, culture, and purification of astrocyte derived from spinal cord of neonate rats, and identified by immunocytochemical stain. Methods Astrocyte derived from spinal cord of neonate rats were isolated and cultured, purified by exposed a short time when exchanging medium and rotation. Passage through enzymedigestion and identified by immunocytochemical stain, to count the purity coefficient of astrocyte. Results Astrocytes adhered after plated 12 h, the numbers increased significantly after 3 d. Immunocytochemical stain showed: there were no neuron on culture covers because the stain of NF200 was negative, while the positive rate of GFAP stain was up to %. Conclusion High purified astrocytes could be got by exposed a short time when exchanging medium and rotation, so it is a simple and high effective method for the purification of astrocyte.Keywords: astrocyte; neurofilament; glial fibrillary acidic protein最近几年，神经胶质细胞（astrocyte，AST）已成为神经科学研究的热点之一［1］，它不仅具有支持、分隔、营养和爱惜神经元的作用，而且参与了脑的高级功能活动，并在突触形成中起着重要作用［2-3］。
星形胶质细胞的体外生长特性
星形胶质细胞的体外生长特性蔡杰;彭会明;周洁萍;孙宗全;刘仁刚【摘要】目的研究纯化培养的星形胶质细胞的体外生长特性,作为进一步研究星形胶质细胞功能的依据.方法将纯化的星形胶质细胞分为6h 、12h 、18h 、24h 、30h 、36h 、42h 、48h 、54h 、60h 、72h 、84h 、96h 、120h 14个时间组,培养不同的时间后,采用细胞计数法绘制细胞生长曲线观察细胞的生长状况,用流式细胞学检测细胞周期各时相的变化并绘制增殖指数曲线,所得数据用SPSS软件进行统计学分析.结果①星形胶质细胞的生长曲线可明显的分为三个阶段:第一阶段为0至24h,在此时间内生长曲线平缓上升,其斜率为0.64.第二阶段为24h至84h,在此时间内生长曲线急剧上升,其斜率为2.69;此阶段中24h至48h时曲线最陡,斜率为3.94,细胞呈指数生长.第三阶段为84h至120h,在此时间内生长曲线走势平直,其斜率为-0.005.②星形胶质细胞的增殖指数在第一个细胞增殖周期内可以反映细胞的增殖状态,第一个细胞周期结束后,细胞的数量继续上升增殖指数却降低了.结论培养的星形胶质细胞的生长过程分为潜伏期、指数生长期和停滞期三个阶段,其潜伏期为0至24h,指数生长期为24h至48h,停滞期为84h以后.单纯用增殖指数等类似的指标作为细胞增殖状态的判断标准是有一定局限性的,一定要将这些指标与细胞数量结合起来分析.%Objective This study is aiming to investigate the growth characteristics of the purified as-trocytes in vitro, which the next study will base on. Methods Purified astrocytes from cerebral cortex of newborn rats were divided into 14 groups. After incubation for different hours(6h ,12h , 18h , 24h , 30h ,36h , 42h , 48h , 54h , 60h ,72h , 84h , 96h , 120h) , we observed the proliferation by cell counting and drew the growth curve of astrocytes, and we observed the cell cycle by the flow cytometerand drew the proliferation index curve of astrocytes The corresponding data were analyzed with SPSS statistical software. Results The growth curve of astrocytes were divided into three phases. The first phase continues from 0 to 24 hours, the slope rate is 0. 64. The second phase continues from 24 to 84 hours, the slope rate is 2. 69. At the first part of the phase (from 24 to 48 hours) the slope rate is 3. 94 and the growth of cells is the fastest in the total process. The cells start the third phase after 84 hours, the slope rate is -0. 005. The proliferation index of astrocytes can reflect the proliferation of astrocytes in the first cell cycle. After the first cell cycle, the proliferation index reduces but the number of the cells is increase. Conclusion The growth process of purified astrocytes can be divided into 3 phases; latent phase (from 0 to 24 hours) , logarithmic growth phase (from 24 to 48 hours) and stagnate phase (from 84 to 120 hours). By using merely the indexes, such as the proliferation index, it is circumscribed to estimate the proliferation of astrocytes.【期刊名称】《中国组织化学与细胞化学杂志》【年(卷),期】2011(020)005【总页数】5页(P486-490)【关键词】星形胶质细胞;增殖;细胞周期;生长曲线;增殖曲线【作者】蔡杰;彭会明;周洁萍;孙宗全;刘仁刚【作者单位】华中科技大学同济医学院附属协和医院心外科,武汉,430022;华中科技大学同济医学院基础医学院解剖学系,武汉,430030;华中科技大学同济医学院基础医学院解剖学系,武汉,430030;华中科技大学同济医学院附属协和医院心外科,武汉,430022;华中科技大学同济医学院基础医学院解剖学系,武汉,430030【正文语种】中文【中图分类】R329星形胶质细胞（Astrocyte，AS）是中枢神经系统内数目最多的一类细胞，它在神经系统发育、突触传递、神经组织修复与再生、神经免疫以及多种神经疾病中的病理机制等方面，都起着十分重要的作用［1-4］。
原代培养细胞技术的方法和应用
原代培养细胞技术的方法和应用细胞是构成生命体的基本单位之一，而原代培养细胞技术是生物学和医学领域中一项重要的技术。
该技术利用从真实的生物组织中分离出的原代培养细胞，研究生命的生长、发育、分化及各种疾病的发生机制，已成为目前生命科学研究的重要手段。
本文将详细介绍原代培养细胞技术的方法和应用。
一、原代培养细胞的培养方法1. 细胞分离：分离组织细胞是原代培养细胞技术的基础操作，只有分离出的单个细胞才能进行培养。
通常的细胞分离方法包括肉眼分离、切碎和胶原酶消化等方法。
2. 细胞培养：将分离出的单细胞转移到含有适宜营养成分的培养基中，使其在培养皿上附着并在适宜条件下生长繁殖，形成细胞群落或单层细胞，这便是原代培养细胞。
常用的培养基成分包括生长因子、血清、胎牛血清或鸡胚提取物等。
二、原代培养细胞技术的应用1. 细胞生长和分化研究：原代培养细胞技术被广泛应用于生长和分化过程的研究。
通过培养与调控因子不同的细胞，可以了解特定基因和生物化学途径的影响。
同时，还可以通过形态学和免疫组化等方法对细胞进行分型和鉴定。
2. 药物筛选和毒理学研究：原代培养细胞技术被广泛应用于药物筛选和毒理学研究中。
在细胞培养中加入药物并观察对细胞或细胞群落的影响，可以预测药物的毒性和治疗效果。
3. 细胞免疫学研究：原代培养细胞技术也可用于细胞免疫学研究，通过对免疫反应进行实验操作和分析，可了解免疫细胞、细胞因子和细胞-细胞交流等现象。
4. 细胞发育和癌症研究：原代培养细胞技术在细胞发育和癌症研究中也有广泛应用。
例如，通过对人类胚胎干细胞的培养，可以研究人类胚胎发育和分化的机制，对治疗某些疾病和替代组织移植等方面具有潜在价值。
同时，还可以通过比较肿瘤组织和正常组织的细胞特性和生物化学途径，为癌症的治疗和预防提供新的思路和方法。
三、原代培养细胞技术的前景与发展原代培养细胞技术的研究与发展已经成为生命科学和医学领域的重要方向之一。
随着科技的不断进步和发展，原代培养细胞技术必将更好地服务于人类的健康。
大鼠胰星状细胞体外分离培养的实验研究
大鼠胰星状细胞体外分离培养的实验研究万远太;赵秋;王天才;王波;李德明【期刊名称】《华中科技大学学报（医学版）》【年(卷),期】2005(034)001【摘要】目的体外分离培养胰星状细胞(PSC)以建立合适的体外模型,为进一步研究胰纤维化的分子发生机制打下实验基础.方法采用改良Apte MV酶消化法体外分离培养PSC,胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)免疫组化染色和荧光倒置显微镜观察自发绿色荧光对原代培养的PSC加以鉴定.结果 PSC与肝星状细胞(HSC)具有相似的特征,细胞呈梭形或星形,细胞骨架蛋白GFAP染色阳性,由于胞质内含维生素A脂滴,在荧光倒置显微镜下于328 nm波长处可见自发绿色荧光.结论改良酶消化法可用于体外分离培养PSC,PSC分离培养的成功为进一步研究PSC活化与抑制信号通路的分子机制提供了体外模型.【总页数】3页(P125-127)【作者】万远太;赵秋;王天才;王波;李德明【作者单位】华中科技大学同济医学院附属同济医院肝病研究所,武汉,430030;华中科技大学同济医学院附属同济医院肝病研究所,武汉,430030;华中科技大学同济医学院附属同济医院肝病研究所,武汉,430030;华中科技大学同济医学院附属同济医院肝病研究所,武汉,430030;华中科技大学同济医学院附属同济医院肝病研究所,武汉,430030【正文语种】中文【中图分类】R329.2【相关文献】1.大鼠胰星状细胞的分离与培养 [J], 贾一韬;李兆申2.三种方法体外同步分离培养大鼠肝枯否细胞和星状细胞的比较 [J], 成家茂;潘志恒;谢瑶;何宏文;何义华3.大鼠肝星状细胞分离与培养方法的实验研究 [J], 史慧敏;徐军全;王登妮;王明亮;宋彬妤4.大鼠骨髓基质干细胞体外分离、纯化、培养的实验研究 [J], 何玉祥;孙岩;刘振川;刘洋;周华;王茂华;袁海;金星;吴学君;5.大鼠骨髓基质干细胞体外分离、纯化、培养的实验研究 [J], 何玉祥;孙岩;刘振川;刘洋;周华;王茂华;袁海;金星;吴学君因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
星形胶质细胞和少突胶质细胞培养
（二）星形胶质细胞星形胶质细胞是胶质细胞中体积最大，数量最多的一种，胞体呈星形，核大，呈卵圆形，染色质稀少，星形胶质细胞分两类，一类为原浆性星形胶质细胞（protoplasmic astrocyte），其突起短粗，分枝多。
另一种为纤维性星形胶质细胞（fibrous astrocyte），它的突起细长，分枝少。
纤维性星形胶质细胞是与少突胶质细胞源自同一前体细胞。
星形胶质细胞具有多种功能，中枢神经系统内神经元及其突起间的空隙几乎全部由星形胶质细胞充填，起结构的支持作用，星形胶质细胞的突起构成血脑屏障，星形胶质细胞能摄取和代谢某些神经递质如γ-氨基丁酸等。
调节局部神经递质的浓度，使神经网络能平稳地发挥作用。
还能吸收细胞间隙中过多的K+，为K+的存储库，通过调节K+的水平而影响神经元的电生理活动。
星形胶质细胞能合成和分泌大量神经营养因子，有维持神经元生存和促进神经元突起生长的作用，亦能分泌白细胞介素，肿瘤坏死因子和干扰素等多种细胞因子，星形胶质细胞有分裂能力，在中枢神经系统损伤后，星形胶质细胞增生、肥大，填补缺损，形成胶质瘢痕。
（1）方法和结果选择出生2 d 的SD大鼠，无菌条件下分离出大脑皮层，用0.125%胰蛋白酶消化(37℃30min)后用培养液（90% DMEM，10 % 胎牛血清，2mM谷氨酰胺）吹打分散成细胞悬液，先接种于玻璃培养瓶中，于培养箱中孵育30 min后，翻转瓶子吸出细胞悬液，除去已贴壁的成纤维细胞，再接种于涂有鼠尾胶的75cm2塑料培养瓶中, 种植密度为1×105 个细胞/cm2，每瓶10ml细胞悬液置。
置36℃、10%CO2 培养箱中培养。
每周换液2 次，培养10-14h，细胞分为两层，下一层为I型胶质细胞即原浆形胶质细胞，上一层是O-2A前体细胞，根据两类细胞贴壁能力的差异，以振荡培养技术进行分选，在37℃摇床上振荡，16 h （180r/min）O-2A前体细胞可被摇下来，摇下来的细胞种植在涂有鼠尾胶的75mcm2塑料培养瓶中，培养液使用20 % 胎牛血清促进O-2A前体细胞分化为II型胶质细胞即纤维型胶质细胞。
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体外原代星形胶质细胞分离培养方法的优化黄太萍;黄巨恩;沈丽【摘要】目的:通过对国内外原代培养星形胶质细胞的不同方法的比较运用,旨在优化现有的星形胶质细胞(AS)分离培养方法,建立稳定,高产的培养模式,为进一步研究奠定基础.方法:结合自有实验室条件采用优化的胰蛋白酶消化组织块分离培养法获取AS,进行形态学观察,绘制生长曲线,对培养的细胞进行GFAP免疫荧光鉴定.结果:体外培养的原代AS 7～10 d基本融合,胞体不规则,突起丰富如网状,生长曲线符合正常细胞生长特性;免疫荧光染色显示细胞纯度可达95％以上.结论:优化的胰蛋白酶消化组织块分离培养法对AS的培养更适宜自有实验室条件,可获得稳定纯度较高的AS,为中枢神经系统疾病相关研究提供了新的基础.【期刊名称】《广西医科大学学报》【年(卷),期】2014(031)006【总页数】4页(P894-897)【关键词】星形胶质细胞;体外培养;鉴定;大鼠【作者】黄太萍;黄巨恩;沈丽【作者单位】广西医科大学护理学院南宁 530021;广西医科大学护理学院南宁530021;广西医科大学护理学院南宁 530021【正文语种】中文【中图分类】R-33神经胶质细胞是构成神经组织的两大类细胞之一,其生物学作用越来越受到重视，而星形胶质细胞(astrocyte，AS) 是其中的主要部分，在神经系统发育、突触传递、神经系统内环境的稳定和新陈代谢等中枢神经系统的多种正常生理活动, 以及神经疾病的病理机制中都起着十分重要的作用[1]。
目前体外培养AS常用的方法有非酶分离细胞法，酶消化分离法，限制性细胞培养法。
其中运用最多的为酶消化分离法。
本文通过对比和摸索，针对本实验室的自身条件采用了胰蛋白酶消化组织块分离培养法对体外培养大鼠AS进行优化，取得良好效果。
1 材料和方法1.1 实验动物和试剂：新生24 h内的SD大鼠，由广西医科大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK(桂)2012-0002；DMEM-HG、胎牛血清由维森特公司提供、胰蛋白酶由美国Gibco公司提供；Anti-GFAP antibody为abcam公司产品；anti-rabbit-488为中杉金桥公司产品。
1.2 方法和步骤1.2.1 AS的培养：新生24 h内的SD大鼠(雌雄不限)在75%酒精擦试消毒后用颈动脉放血法处死动物。
快速分离出脑组织后置于预冷D-Hanks液洗净血污，取皮层部分尽可能的剥净脑膜及脑表血管，并剔除海马组织，将分离出的皮层组织用D-Hanks液清洗2次，用眼科弯剪将其剪成1 mm3的小块，并将组织小块转入到离心管中，加入37 ℃复温30 min的终浓度为0.125%胰蛋白酶消化15 min 后，用含10%胎牛血清的DMEM-HG终止消化，以1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入2 mL培养液后用1 mL移液枪头置于离心管底部缓慢轻柔吹打10次,勿超过15次(尽可能的吹散膨松絮状组织块，不产生气泡)，静置1 min使皮层组织块沉于离心管的底部，取中下2/3上清于另一离心管中收集细胞悬液，再将含有皮层组织的离心管中继续加入2 mL培养液依同样方法吹打10次后收集中下2/3上清置于收集上清液的离心管中。
将一起收集完全的含上清液的离心管以1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入含l0%胎牛血清的DMEM-HG培养液重悬，调整细胞浓度以5×105/mL接种于50 mL培养瓶内37 ℃、5% CO2饱和湿度静置培养。
48 h首次换液，以后每2～3 d换液；而对于第一支离心管：培养基重悬下层沉淀的未完全利用的组织块，静置1～2 min，弃上层液体，重复以上操作两次，加入少量含l0%胎牛血清的DMEM-HG的培养基重悬组织块种瓶，而后轻轻翻转培养瓶，使瓶底向上,注意翻瓶时勿使组织小块流动，塞好瓶塞，置37 ℃温箱培养2 h左右(勿超过4 h)。
使小块微干涸。
而后在瓶底脚部轻轻注入培养基少许，再缓缓把培养瓶翻转过来，让培养液慢慢覆盖附于瓶底上的组织小块，置温箱中绝对静置培养。
直至48 h后换液时方可移动或者观察，以便于组织块贴壁。
以上细胞在37 ℃、5% CO2孵箱中培养7～9 d，待培养的细胞70%～80%融合时，进行传代纯化。
1.2.2 AS的鉴定方法：传至第3代的AS采用胶质纤维酸性蛋白(GFAP)进行免疫荧光鉴定，将第3代细胞用胰蛋白酶消化后以5×104/mL的密度接种在铺有盖玻片( 预先采用多聚赖氨酸包被) 的6孔板内，置于5% CO2、37 ℃恒温培养箱内24 h，贴壁后以4%多聚甲醛固定后进行GFAP细胞免疫荧光鉴定，抗荧光淬灭剂封片后共聚焦显微镜下观察显色结果，计数阳性细胞并拍照记录。
2 结果2.1 AS的培养结果：初次分离的原代大鼠AS种瓶后(图1)2 d左右换液，倒置显微镜下见细胞基本贴壁且折光性较好，部分细胞伸展并有细小突起长出(图2)。
但是细胞生长缓慢，经过1～2次换液后开始迅速生长。
7～10 d后待细胞基本铺满瓶底，细胞呈梭形或多边形后进行传代纯化。
动态观察可见细胞的胞体变大、形态多为不规则，突起丰富，分支增多并交织成网(图3)。
AS生长曲线见图4。
2.2 AS的鉴定：传至第3代的细胞(图5A)应用GFAP细胞免疫荧光法鉴定。
阳性细胞胞质呈绿色荧光(图5B)。
取4张爬片，随机取5个不同的视野，计数阳性细胞占所有细胞的比例,AS的比例均达95%以上。
图1 原代培养0 h(×40)图2 原代培养48 h(×100)图3 传至第3代的AS(×400)图4 AS的生长曲线图5 AS免疫荧光检测(GFAP×200)A：明视野；B：GFAP免疫荧光检测3 讨论获得AS的分离培养方法有非酶分离细胞法[2],酶消化分离法[3]，限制性细胞培养法[4～5]。
非酶分离细胞法操作简单，花费较低，但是单纯机械损伤对细胞表面蛋白造成不可逆的损伤，从而导致细胞的存活率和获得率较低；酶消化分离法在文献中报道最多，国内多参照薛庆善等[6]的培养方法，胰蛋白酶既消化细胞间质又消化细胞本身，操作简单，价格也相对便宜，在把握好酶消化的条件后操作后续步骤较顺利，也有人使用胰蛋白酶与胶原酶混合消化法[7]来获取AS。
此种方法对细胞损伤小，但胶原酶价格较昂贵，培养细胞成本较高，一般实验室少见使用；限制性细胞培养法是考虑到在限制细胞种植密度和限制给予培养液的培养条件下AS的体外形态发育与在体的情形基本一致，提示该细胞培养方法可能有助于研究中枢神经系统中AS的生理功能[8]。
但是，笔者在实践中发现，单纯应用该种方法培养的AS欠稳定，细胞成活率相对较低。
尽管如此，此种方法仍不失为一种探索AS培养方法的新途径。
对原代培养的AS进行纯化的方法主要是“原代培养”、“一次或两次震荡纯化”、“传代纯化”、“差速贴壁培养”这5种方法各有利弊，杜方等[8]对前4种纯化方法进行比较发现“原代培养”的方法细胞纯度不够，有文献报道最主要的污染是成纤维细胞和小胶质细胞；“一次或两次震荡纯化”的方法主要考虑到AS与其它细胞处于分层生长，经过震荡处理，可使处于底层的AS留在原处，上层的细胞自行脱落，从而达到纯化的目的；“传代纯化”的方法获得的AS能有效去除其他细胞的污染，达到99%以上的纯度，有利于在离体的缺血环境中观察AS的变化，研究其在脑中的功能[9]。
“差速贴壁培养”的方法主要见于王伟等[10]的文章中，此种方法可以获得高纯度的AS且比震荡法简便可行。
本文的方法属于优化的酶分离AS法,主要的技术要点和依据如下：①颈动脉放血法处死动物。
可以减少脑组织内血细胞量和酒精浸泡时有可能通过开放的管腔损伤脑细胞的可能。
②全部冰块条件下剥离组织块可大大提高成功率。
可能是由于脑细胞在低温条件下代谢减慢，抗损伤能力增强。
③选用不含EDTA的纯胰酶。
这种培养减少了其它杂质的介入, 为进一步实验提供了良好的基础。
纯胰酶作用更温和，不易使细胞受损；另外由于作用时间较长，可以一次性取材多只动物，利用时间间隔分次消化，从而节约实验时间和人力。
④弃上1/3，而取中下2/3的上清收集细胞悬液，可去除杂质及离心过程中产生的细胞碎片。
⑤经酶处理后的组织块，结构松散，细胞易于从组织块中爬出，且纯度较高。
将未吹散的组织块利用起来可以节约取材动物，增加细胞量。
⑥吹打必须轻柔且不产生气泡。
避免产生气泡是因为气泡表面张力会损伤细胞膜，导致死细胞增多。
笔者采用1 mL移液枪头置于底部缓慢吹打，如遇第一次组织块过大无法使用时，可先用大口径的吸管轻柔吹打2～3次。
该吹打的次数计入总吹打次数中。
⑦培养瓶和培养板不作任何预处理。
笔者在实验过程中发现做过预处理的细胞较不做预处理的细胞贴壁快，提前了第一次换液的时间，却增加了预处理的步骤和污染的机会。
⑧离心时需提前预冷。
选用可以设置预冷的离心机可以减少离心时高速环境下产生更多热能影响细胞活力。
另外，离心结束后的下降选择缓慢的下降模式，防止骤降损伤细胞。
⑨掌握酶和培养液pH 值非常重要。
酶作用时, pH的控制很重要, 如胰蛋白酶在pH<7时几乎完全失活。
培养液的最适pH值为7.2～7.4，且神经细胞耐酸不耐碱较其他类型的细胞更明显。
所以笔者在实验过程中经常注意培养用液的pH值,后期实验所购买的含HEPES的高糖培养基pH值较稳定。
综上所述，用胰蛋白酶消化组织块分离培养法成功地培养出高纯度的AS。
同时，对于此种方法的较好应用，更适用于消化后剩余的组织量够平铺用，从而达到很好利用剩余组织量的目的。
使用这种方法不仅能节约取材动物量和经费，而且能保持原有的细胞分化和增殖能力。
因此，本试验采用的胰蛋白酶消化组织块分离培养法步骤简单、成本低廉、稳定性好、耗时短、获得的细胞量大且纯度较高，适宜在一般实验室推广应用。
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